KO und AC sind durch ein Stipendium und ein Stipendium der American Heart Association unterstützt. SIB und RB werden durch Zuschüsse aus NIH unterstützt.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">Klicken Sie hier, um einen Überblick über die halbautomatische Herzschlag-Analyse (SOHA) Verfahren zu sehen.</a> Semi-automatische optische Herzschlag Analyse 1. Vorverarbeitung - Dieser Schritt gibt Auskunft über den diastolischen und systolischen Herz Durchmesser. Herz Kanten werden erkannt und während der maximalen Diastole und Systole markiert. Optische Aufnahmen können bei niedrigen Geschwindigkeiten und sogar ein Bild in einer Zeit, die eine genaue Identifizierung der Rahmen, bei denen maximale Kontraktion und Entspannung des Herzens auftreten vorangetrieben werden. Ein Paar Marken, mit denen der diastolische Kanten und ein Paar Identifizierung des systolischen Kanten sind. Marks können auch in zweifacher Ausfertigung bei verschiedenen horizontalen Positionen entlang des Herzens gemacht werden. Das Herz Durchmesser in diesem Schritt erhalten werden auch verwendet, um eine zusätzliche Messung, die eine Abschätzung der Kontraktilität des Herzens bietet berechnen. Diese Maßnahme ist die prozentuale fraktionelle Verkürzung (% FS) und stellt das Ausmaß, in dem das Herz Kanten aufeinander zu bewegen während einer Kontraktion. Die Formel zur Berechnung% FS ist: (((Diastolischer Durchmesser - Systolischer Durchmesser) / diastolischer Durchmesser) x 100) Hinweis - Die Punkte in diesem Satz identifiziert sind nur für den Durchmesser und die fraktionelle Verkürzung Messungen verwendet und nicht für Bewegungserkennung eingesetzt. Beispiel: (. Cammarato, et al 2008) In Drosophila, Punktmutationen in Myosin schwere Kette der Geber-Domäne, eine Region bekannt zu modulieren des Motors enzymatische Aktivität, Ergebnis in Herzen, die erweitert oder sind abhängig davon, ob sie zu unterdrücken oder zu verbessern Myosin ist ATPase-Aktivität beschränkt . Diese Arten von Messungen können nicht in intakten Fliegen gemacht werden, wie es in der Regel nicht möglich ist, zu Herzen Kanten entlang der gesamten Länge des Herzens Rohr durch die Kutikula und das Fett zu identifizieren, (vgl. Wildtyp, D45 und Mhc5 M-Modi in &quot;M-Modus Abbildung &quot;weiter unten), die normalerweise umschließen das Herz. Die Messungen erfolgten bei der Visualisierung des Herzens in intakten Fliegen mit anderen häufig verwendeten Methoden sind in der Regel zu den vorderen Teil des Herzens, die konische Kammer Region beschränkt. Es ist auch nicht möglich, diese dynamische Messung in fixiertem Gewebe zu erhalten. 2. Movement Detection- Dieser Schritt wird automatisch vom Programm erledigt und verwendet zwei verschiedene Algorithmen, um Bewegung in jeden Film zu analysieren. Kurz gesagt, der erste Algorithmus, verwendet die &quot;Average Rahmen Darkness&quot;-Algorithmus ein Frame für Frame-Ansatz. Dieser Algorithmus Mittelwerte der Dunkelheit die Intensität für einen ganzen Film Frame, normalisiert den Wert auf ein Intervall zwischen 0 und 1, und die Kurven der normierten Durchschnitt für jeden Frame in dem Film über die Zeit. Der zweite Ansatz, die &quot;Pixel für Pixel&quot;-Algorithmus analysiert die Veränderung in der Dunkelheit der die einzelnen Pixel von einem Bild zum nächsten. Pixel, die Intensität Veränderungen über einen voreingestellten Schwellenwert aufweisen, sind für jeden Frame zusammengefasst und dargestellt für jeden Frame in dem Film über die Zeit. 3. Prüfintervalle- Die Ausgabe der beiden Bewegungsmelder Algorithmen ist in diesem Modul mit der &quot;Average Darkness&quot;-Ausgabe in einem Fenster über dem &quot;Pixel für Pixel&quot; Ausgabefenster angezeigt angezeigt. Um sicher zu sein, dass der Nachweis Abständen mit Bewegung stimmen in der eigentlichen Film zeigen wir eine Kante-trace-oder M-Modus aus dem Rahmen, die direkt unterhalb des Algorithmus Ausgabefenster analysiert gemacht. Die M-Modus wird durch digital schneiden Scheiben ein Pixel breit durch das Herz von jedem Bild im Film und passen sie horizontal, um einen Schnappschuss des Herzens Rand Bewegungen im Laufe der Zeit gegeben haben. In der &quot;Pixel für Pixel&quot;-Fenster die ermittelten diastolischen Intervalle sind durch eine horizontale grüne Linie mit der Anzahl der Frames einen Beitrag zu diesem Intervall direkt oben angegeben. Systolischer Intervalle werden als Intervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Diastolen identifiziert. Der Beginn einer Systole in den M-Modus durch eine senkrechte blaue Linie angezeigt und das Ende ist durch eine vertikale rote Linie dargestellt. Mit dieser Anzeige ist es relativ einfach zu sehen, ob der Algorithmus Ausgabe stimmt mit der tatsächlichen Herzen Bewegungen. Obwohl Bewegungserkennung automatisch durchgeführt wird, muss die Ausgabe auf ihre Richtigkeit überprüft werden. Es gibt mehrere mögliche Gründe dafür ist, dass es oft eine zugrundeliegende, Slow-Wave-Fluktuation in Lichtverhältnisse nicht auf die Herzbewegung verwandt. Dies kann in der Regel durch Verwendung eines eingebauten Hochpassfilter eliminiert werden. Eine zweite Grund hat mit der Empfindlichkeit des &quot;Pixel für Pixel&quot;-Ansatz zu tun. Die Ausgabe dieses Algorithmus ist in der Regel zwei Bewegung Spuren, eine für die Kontraktion und eine für die Entspannung Bewegung. In älteren fliegt und in einigen Mutanten die Länge der Zeit zwischen diesen beiden Bewegungen<html> wird relativ lange und das Programm versucht, die beiden Bewegungen als zwei separate Schläge zu interpretieren. Dies kann, indem er das Programm auf den Ausgang der Pixel für Pixel-Algorithmus zu vergleichen mit dem der durchschnittliche Frame-Dunkel-Algorithmus korrigiert werden, indem Sie auf den &quot;Use Dunkelheit&quot; ein. Beispiel (siehe Video): In 5 bis 7 Wochen alte fliegt der systolischen Intervalle sind in der Regel viel länger als bei jungen Fliegen. Diese lange Intervalle werden zunächst als zwei getrennte Kontraktionen durch einen kurzen Diastole getrennt nachgewiesen werden. Dies kann durch die Auswahl der &quot;Use Finsternis&quot; Kontrollkästchen korrigiert werden. In diesem Fall wird das Programm vergleichen den diastolischen Intervall durch die Pixel für Pixel-Algorithmus identifiziert mit dem Durchschnitt Rahmen Dunkelheit Ausgang. Wenn die durchschnittliche Frame-Dunkel-Ausgang hat einen positiven Wert, dann ist jede diastolischen Intervall in der Pixel für Pixel-Algorithmus identifiziert werden ignoriert und die Intervalle korrekt angegeben werden. Der gesamte Film kann in 10 Sekunden Segmente gescannt werden und akzeptiert (klicken Sie auf &quot;Data OK&quot;) oder abgelehnt (klicken Sie auf &quot;Discard Daten&quot;). Die Hallo und Lo Pass Filter Empfindlichkeiten kann manuell eingestellt werden, um genauer zu definieren helfen Kontraktion Abständen beim Einsatz der Finsternis Algorithmus. 4. Output Statistics- Sobald die Ausgabe für einen bestimmten Film akzeptiert wurde das Programm nutzen, dass Informationen zur automatischen Berechnung einer Reihe von Parametern. Dazu gehören diastolischen und systolischen Intervall-, Herz-Zeit und Herzfrequenz, Richtung und Geschwindigkeit der Kontraktion Welle, Herz-Durchmesser und% FS. Darüber hinaus hat das Programm mehrere Methoden zur Quantifizierung arrhythmicity reflektieren ungleichmäßige Kontraktion und Entspannung Zyklen (siehe Fink et al, 2009). Statistische Ausgang ist für jeden Film einzeln und für die gesamten Daten in Form einer (Comma Separated Value. Csv-Datei), die in Tabellenkalkulationsprogrammen wie Microsoft Excel geöffnet werden kann, setzen zur Verfügung gestellt. Tabelle 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="table1" /> Ein Beispiel für die Ausgabe durch die Semi-automatische optische Herz Analyse-Programm generiert. 5. Update-Histogramme- Dieser Teil des Programms werden alle Daten auf Herz Abständen für eine Datenmenge in Histogramm-Format. Da Herzfrequenz variabel sind wir zu normalisieren das Histogramm Ausgangsdaten. Da jedoch die Verteilung der Intervalle ist nicht symmetrisch um einen Mittelwert verwenden wir die mittlere Intervall Wert für unsere Normalisierung. Beispiel (siehe Video): Flies, dass mutierte sind für die KCNQ Kaliumkanal zeigen extrem unregelmäßig diastolischen und systolischen Intervalle. Typischerweise werden die systolischen Intervalle sind viel länger und unregelmäßiger als bei gleichaltrigen Wildtyp-Fliegen. Dies ist deutlich durch die Anzeige der Daten in Histogramm-Format betrachtet werden (siehe auch Ocorr et al. 2007). 6. M-mode- Dieses Modul generiert M-Modi, die aus jeder Position entlang des Herzens in der Movie-Rahmen gemacht werden. Die Länge der M-Modus kann auch angegeben werden. M-Modi sind nützlich, um qualitativ zu zeigen, was das Herz ist in einem Film zu tun. Beispiel (siehe Video): Movie eines 3 Tage alten Zebrafisch-Larven Herz zeigt die vordere Kammer, die verwendet werden, um einen M-Modus zu erzeugen. Die vertikale Scheibe der Pixel, die elektronisch von jedem Film Rahmen herausgeschnitten werden wird durch eine rote Linie angezeigt. M-Mode-Bild: Beispiele für M-Modi von Drosophila und Zebrafisch. Einer der Myosin-Mutationen in der Vorverarbeitung Schritt führt in einen molekularen Motor mit schneller Enzymkinetik was zu Herzen Einschränkung und gelegentlich ein Leitungsblock diskutiert. Beide Parameter können angezeigt qualitativ mit M-Modi werden. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M-Modi Beispiele" /> M-Modi in den gleichen Teil des Herzens in beiden Wildtyp und Mutante Fliegen machen deutlich, die eingeschränkte Phänotyp in den MHC-5-Mutante und dem erweiterten Durchmesser und Arrhythmie Kontraktion Zyklen der D45-Mutante (die Myosin drückt mit gedrückter Enzymkinetik) (modifiziert von Cammarato et. al, 2008). M-Modus von einem Zebrafisch Larven Herz zeigt die vordere Kammer (gleiche Herz Film wie in der Demonstration, Fink et.al. 2009 gezeigt) hergestellt. 7. Red Dot Movie- Dieses Modul erzeugt automatisch eine verlangsamte (1:4), 20 Sekunden Version eines analysierten Film zeigt alle Pixel, die als Veränderung in rot gekennzeichnet sind. Diese Funktion ist in erster Linie zur Illustration verwendet. Movie 1 - A &quot;red dot Film&quot; zeigt die Pixel, die als mit Dunkelheit Intensität Veränderungen durch das Programm-Algorithmen in rot gekennzeichnet sind. Der Film Geschwindigkeit ist von der ursprünglichen um einen Faktor von 4 verlangsamt. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; Klicken Sie hier, um Movie 1 herunterladen. 8. Zusätzliche Anwendungen- Wir haben begonnen, diese analytische System zu hoher Geschwindigkeit Filme von anderen gelten für Fahrzeuge mit kleinen Herzen, die oft schwer zu analysieren mit traditionellen Methoden. Wir haben erfolgreich diese Analyse sowohl Zebrafisch Larven Herzen und embryonalen Mäuseherzen (Fink et al, 2009) angewendet. Movie 2 - Maus Herzen Movie Plus Figur mit Prüfintervalle mit Datenausgang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">Klicken Sie hier, um Movie 2 herunterladen.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="Überprüfen Sie Maus Herzintervalle" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Drosophila-Modell hat sich als ein leistungsfähiges Tool, das genetische verwendet wurde, um eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen reichen von embryonalen Entwicklung, Lernen und Gedächtnis-Adresse sein. Kürzlich dieses vielseitige Modell-Organismus wurde verwendet, um die Genetik von Herz-Funktion zu untersuchen. Eine Reihe von Versuchen, Herz Physiologie bei erwachsenen Drosophila zu quantifizieren sind auf Beobachtungen in intakten fliegt durch die Bauchdecke Nagelhaut, gelten. Die meisten diese...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

Wir haben ein Verfahren zur Analyse optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den entwickelten<em&gt; Drosophila</em&gt;, Zebrafisch und Maus embryonale Herz (Fink, et. Al., 2009). Unser Semi-automatische optische Heartbeat Analysis (SOHA) nutzt eine neuartige Bewegungserkennung Algorithmus, der in der Lage, Herz-Bewegungen mit einzelnen kontraktilen und Entspannung Ereignissen zu erkennen ist. Das Programm bietet eine Vielzahl von physiologisch relevanten Auslesen einschließlich des systolischen und diastolischen Intervalle, Herzfrequenz, sowie qualitative und quantitative Maßnahmen der Herzschlag arrhythmicity. Das Programm berechnet auch Herz Durchmesser Messungen sowohl bei Diastole und Systole aus dem fraktionelle Verkürzung und fraktionierte Bereich Veränderungen berechnet werden. Die Ausgabe erfolgt als digitale Datei kompatibel mit den meisten Tabellenkalkulations-Programmen zur Verfügung gestellt. Die Messungen werden für jeden Herzschlag in einer Rekordzeit Erhöhung der statistische Aussagekraft der Ausgang gemacht. Wir zeigen die einzelnen Schritte, in denen Benutzereingaben erforderlich ist, und zeigen die Anwendung unserer Methodik zur Analyse der Herzfunktion in allen drei genetisch manipulierbaren Modellen des Herzens.

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Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Wir haben eine Semi-automatische optische Heartbeat Analysemethode (SOHA) für die Analyse von optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den entwickelten<em&gt; Drosophila</em&gt;, Zebrafisch und Maus embryonalen Herzen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode auf die Analyse der Herzfunktion in Fruchtfliege und Maus embryonalen Herzen.

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Aufrufe.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. Wir haben eine Semi-automatische optische Heartbeat Analysemethode (SOHA) für die Analyse von optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den entwickelten Drosophila, Zebrafisch und Maus embryonalen Herzen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode auf die Analyse der Herzfunktion in Fruchtfliege und Maus embryonalen Herzen.

Serie: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Forschung

Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Wesentliche Komponenten des Lichtmikroskops

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Ein ImageJ Plugin für Semi-automatisierte Blattform Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

Quantitative Analyse der viskoelastischen Eigenschaften roter Blutkörperchen mittels optischer Pinzette und Defokussierungsmikroskopie

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Halbautomatische Isolierung von weißem Fettgewebe der Maus

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor im Rampenlicht: Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus weißem Fettgewebe der Maus mit einem Gewebedissoziator  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...