In den letzten Jahren hat sich die Verkapselung in zellgroßen Lipid-Doppelschichtvesikeln als nützliche Methode für In-vitro-Rekonstitutionsexperimente erwiesen. Die von uns vorgestellte Methode wird bei der Rekonstitution von Zytoskeletten in der Forschung synthetischer Zellen sehr hilfreich sein. Mit dieser Methode können wir heterogen große riesige unilamellare Vesikel mit einer hohen Ausbeute erzeugen.
Die Vesikelerzeugungszeit ist im Vergleich zur herkömmlichen cDICE-Technik deutlich verkürzt. Wir können zellfreie Transkriptions-Translationssysteme kapseln, die aus komplexen, gleichzeitig auftretenden zellulären Prozessen isoliert sind, um molekulare Signalwege zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um minimale Protozellen zusammenzusetzen, um funktionelle synthetische Zellen zu erzeugen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Öl-Lipid-Mischung, indem Sie Dioleoyl-Phosphocholin, Cholesterin und Rhodamin-PE auf eine 15-Milliliter-Glasdurchstechflasche übertragen. Dann fügen Sie 0,5 Milliliter Chloroform in die Durchstechflasche hinzu. Pipettieren Sie 7,2 Milliliter Silikonöl und 1,8 Milliliter Mineralöl in einem separaten 15-Milliliter-Rohr und mischen Sie die Öle durch Vortexing mit einer Geschwindigkeit von 3.200 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden.
Dann fügen Sie die Ölmischung zu der Durchstechflasche hinzu, die die Lipid- und Chloroformmischung enthält, und wirbeln Sie die Mischung mit einer Geschwindigkeit von 3.200 Umdrehungen pro Minute für 10 bis 15 Sekunden auf, bis die resultierende Lipid-in-Öl-Mischung leicht trüb ist, da die Lipide nicht vollständig im Öl gelöst sind. Als nächstes beschallen Sie das Lipid in Öldispersion in einem Badbeschallungsgerät mit einer Ultraschallleistung von 80 Watt und einer Betriebsfrequenz von 40 Kilohertz für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Wenn es nicht sofort verwendet wird, lagern Sie das Lipid-Öl-Gemisch bei vier Grad Celsius für 24 Stunden.
Um die Vesikel zu erzeugen, verwenden Sie die Baugruppe mit einer 3D-gedruckten Welle aus schwarzem Harz, die auf der Tischrührplatte mit einer Geschwindigkeit von 1.200 Umdrehungen pro Minute montiert ist. Montieren Sie dann die 3D-gedruckte durchgehende Tröpfchenschnittstellen-Kreuzungskapselung oder cDICE-Kammer, die aus dem klaren Harz auf dem schwarzen Harzschaft besteht. Bereiten Sie 1 bis 10 Mikromolar Aktinlösung in globulärem Aktinpuffer oder G-Puffer vor, einschließlich 10% ATO 488 Aktin.
Um die Aktinpolymerisation zu beginnen, fügen Sie filamentösen Aktinpolymerisationspuffer oder F-Puffer in Aktinlösung auf Eis hinzu und halten Sie die Lösungen dann auf Eis, um die Aktinpolymerisation zu verlangsamen, bevor Sie einen Vernetzer hinzufügen. Um die Aktin-bindenden Proteine oder ABPs aus 1,75 Milligramm pro Milliliter Faszinvorrat herzustellen, aliquot 1,57 Mikroliter Faszin in einem separaten Mikroröhrchen. Als nächstes fügen Sie 7,5% des Dichtegradientenmediums in die Aktinlösung hinzu, um einen Dichtegradienten zwischen der äußeren und der inneren wässrigen Phase zu erzeugen und die Sedimentation riesiger unilamellärer Vesikel oder GUVs zu erleichtern.
Dann geben Sie 700 Mikroliter 200-millimolare Glukose als äußere Lösung in die Kammer. Fügen Sie genügend Lipid-Öl-Gemisch in die Kammer hinzu, bis 60% bis 80% der Kammer gefüllt sind. Zwischen dem Lipid-Öl-Gemisch und der äußeren Lösung wird eine Grenzfläche gebildet.
Bereiten Sie ein Aktin-ABP-Gemisch vor, indem Sie ABPs in die Aktinlösung überführen. Verwenden Sie dann eine normale 100- bis 1.000-Mikroliter-Pipette, um die 700 Mikroliter des Lipid-Öl-Gemisches in das Aktin-ABP-Gemisch zu übertragen. Achtmal auf und ab pipettieren, um zellgroße Lipid-Monoschicht-Emulsionströpfchen mit einem Durchmesser von 7 bis 100 Mikrometern zu erzeugen.
Verwenden Sie die gleiche 100- bis 1.000-Mikroliter-Pipette, um die gesamte Emulsion in die rotierende Kammer zu dosieren. Die Tröpfchen erhalten ein zweites Blatt mit Lipiden, indem sie die Lipidmonoschicht an der Öl-Außenlösungs-Grenzfläche kreuzen und dadurch GUVs bilden. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Kammer von der Rührplatte und entsorgen Sie den größten Teil der Lipid-Öl-Mischung, indem Sie die Kammer im Abfallbehälter kippen.
Indem Sie die Kammer mit dem Deckel nach innen halten, öffnen Sie den Kammerdeckel und neigen Sie die Kammer leicht nach innen. Die Grenzfläche zwischen der äußeren Lösung, die GUVs enthält, und dem Lipid-Öl-Gemisch ist von der Kammeröffnung aus sichtbar, in der sich der Deckel befindet. Verwenden Sie eine Pipette, um genügend äußere Lösung zu sammeln, die GUVs enthält, und dosieren Sie 50 bis 300 Mikroliter der äußeren Lösung in eine 96-Well-Platte, um eine angemessene Dichte an GUVs zu erhalten.
Für die Abbildung der GUVs stellen Sie die 96-Well-Platte auf der Bühne eines inversen Mikroskops auf, das mit einem 60-fachen Objektiv für Ölimmersion ausgestattet ist. Öffnen Sie eine Bildsequenz von Interesse in einer Bildverarbeitungssoftware, ImageJ Fiji, und identifizieren Sie das Bild mit der höchsten Intensität. Halten Sie die Strg-Umschalttaste C gedrückt, um das Helligkeits- und Kontrastfenster zu öffnen, und klicken Sie auf die Registerkarte Zurücksetzen.
Gehen Sie im Menü ImageJ Fiji zu den Registerkarten Analysieren und Skalieren einstellen, um die bekannte physische Entfernung und Einheit für jedes Bildpixel einzugeben. Wenn Sie fertig sind, wechseln Sie zu den Schaltflächen Bild, Stapel und dann 3D-Projekt, um ein 3D-Bild aus dem Z-Stapel zu rekonstruieren. Legen Sie die Projektionsmethode auf Helligkeitspunkt, Schnittabstand auf 0,5 Mikrometer fest, und aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Interpolieren.
Verwenden Sie die Standardoptionen für den Rest der Einstellungen und erfassen Sie Bilder. Das repräsentative Bild zeigt ein konfokales Bild von Rhodamin-PE-markierten GUVs mit verkapselten Fascin-Aktin-Bündeln. Die Übertragung der Aktinbindungsproteine in die Aktinlösung, die anschließende Zugabe von Lipid-Öl-Gemisch und die Erzeugung von Lipid-Monolayer-Tröpfchen sollten in wenigen Sekunden erfolgen, um die Bildung von Aktinnetzwerken vor der Verkapselung zu vermeiden.
Wir haben diese modifizierte cDICE-Technik verwendet, um die Rolle verschiedener Aktinnetzvernetzer bei der Organisation von Aktinnetzwerken zu untersuchen. Wir erwarten, dass diese Methode anderen Forschern helfen wird, die Regulation anderer Zytoskelettproteine zu erforschen.
