In diesem Artikel stellen wir ein optimiertes Ex-vivo-Protokoll für die Verwundung menschlicher Haut vor, das wichtige Wirksamkeitsdaten als Teil einer klinischen translationalen Pipeline liefern kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue Beurteilung der Wundreparatur in lebender menschlicher Haut mit hohem Durchsatz ermöglicht. Elizabeth Roberts, eine Postdoktorandin, und Alexandria Kidd, eine Forschungsassistentin aus unserem Labor, demonstrieren das Verfahren.
Um eine Hautgewebeprobe auf die Verwundung vorzubereiten, legen Sie die Hautdermis mit der Seite nach unten in eine 90 Millimeter Petrischale und entfernen Sie mit einer sterilen Schere das Fettgewebe. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, legen Sie die Haut in 25 Milliliter HBSS, die mit Antibiotika für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit intermittierendem Schütteln ergänzt werden, um Restblut im Fettgewebe zu entfernen. Nach 10 Minuten die Haut in 25 Millilitern DPBS ausspülen.
Wiederholen Sie nach 10 Minuten die HBSS-Spülung ohne Antibiotika und führen Sie dann eine abschließende Spülung in 25 Millilitern DPBS durch. Legen Sie dann eine sterile Nylonfiltermembran auf den absorbierenden Pad-Stapel und trocknen Sie die Hautseite auf steriler Gaze in einer 90-Millimeter-Petrischale, um verbleibende DPBS zu entfernen. Legen Sie die getrocknete Hautdermis mit der Seite nach unten auf einen sauberen 90-Millimeter-Petrischalendeckel, um eventuelle DPBS-Reste zu entfernen, und tupfen Sie die Epidermis mit frischer steriler Gaze trocken.
Um eine Wunde zu erzeugen, drücken Sie einen zwei Millimeter großen Biopsiestempel gegen die Haut, während Sie die Haut fest halten und sanft verdrehen. Nehmen Sie mit einer gekrümmten Zahngewebezette jede Seite der etwa zwei Millimeter großen Wunde auf und haken Sie die gekrümmte Irisschere unter die Wunde. Verwenden Sie einen Sechs-Millimeter-Biopsiestempel, um die zentrale Zwei-Millimeter-Wunde zu biopsieren, um eine Sechs-Millimeter-Explantierung mit einer Teildicke von zwei Millimetern in der Mitte zu erzeugen.
Legen Sie dann die Wundentstehungsepidermis mit der Seite nach oben auf den Nylonfiltermembranstapel für eine ein- bis siebentägige Inkubation bei 32 bis 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Für die fluoreszierende Färbung die Wundexplants in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern Hautfixiermittel pro Röhrchen sammeln und die Explanten über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel durch einen Milliliter Färbewaschpuffer.
Nach dem Waschen jede Probe mit ca. 150 Mikrolitern Sperrpuffer abdecken und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Entfernen des Blockierenden Puffers 150 Mikroliter primärer Antikörper, verdünnt in Blockierpuffer pro Röhrchen, und die Wundentnahmen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Morgen spülen Sie die Proben mit 500 Mikrolitern Färbewaschpuffer mit 0,2% Natriumazid, gefolgt von drei Spülungen im regulären Waschpuffer.
Nach dem Waschen werden 150 Mikroliter eines geeigneten floreszenzkonjugierten sekundären Antikörpers, der in Färbewaschpuffer verdünnt ist, für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur in jede Vertiefung gegeben. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Explantation dreimal für 30 Minuten in 500 Mikrolitern Färbewaschpuffer pro Waschgang ab, bevor Sie jede Explantation mit 150 Mikrolitern DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur gegenfärben. Zum Schluss die Explant zwei Mal für 30 Minuten mit 500 Mikrolitern Waschpuffer pro Waschgang waschen.
Für die Explant-Bildgebung legen Sie eine 60-Millimeter-Petrischale auf die Bildgebungsplattform eines konfokalen Mikroskops und fügen Sie der Schüssel eine etwa einen Milliliter große DpBS-Schicht hinzu. Verwenden Sie eine Zette, um die Wunderregungen in die Schüssel zu übertragen. Nachdem Sie die Bildgebungssoftware entsprechend dem Experiment eingerichtet haben, positionieren Sie die Wunde in der Mitte der Bildgebungsebene und erfassen Sie Bilder der Wundbiopsien.
Um eine drahtlose digitale Mikroskopbildgebung durchzuführen, um qualitativ hochwertige Bilder auf kostengünstige Weise zu erhalten, schließen Sie ein Telefon oder einen Laptop an ein drahtloses Digitalmikroskop an. Legen Sie die mit der Seite nach oben aufgezogenen Explanten auf ein Stück Laborgewebe und entfernen Sie den verbleibenden Waschpuffer aus der Probe. Positionieren Sie dann die Explant in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops und erfassen Sie Bilder mit der angeschlossenen Kamera.
Immunperoxidase und Immunfluoreszenz können für die Färbung des gesamten Mount-Gewebes verwendet werden. Darüber hinaus können lebende / tote Flecken auf frischem Gewebe durchgeführt und vor oder nach der Fixierung abgebildet werden. Die Ganzkornfärbung von Wunden kann verwendet werden, um die Wundverschlussraten reproduzierbar zu bestimmen.
In dieser repräsentativen Analyse wurde ein gesunder Hautwundverschluss nach vier bis fünf Tagen beobachtet, während diabetische Hautwunden innerhalb des siebentägigen Analysezeitraums nicht vollständig geschlossen wurden. Die K14-Expression erreichte am zweiten Tag in gesunden Hautwunden ihren Höhepunkt, bevor sie mit erhöhter epidermaler Differenzierung schnell abnahm. Diese Reepithelisierung und anschließende epidermale Differenzierung verzögerte sich in den diabetischen Hautwunden.
Die Reformation der frühen epidermalen Barriere schließt die Durchdringung von K14-Antikörpern innerhalb der differenzierten epidermalen Schichten aus. Zu Beginn des Reepithelisierungsprozesses wandern K14-positive Basalschichtkeratinozyten über die offene Wunde nach innen, so dass sich die Epidermis näher am äußeren Wundrand bildet als die Epidermis näher am inneren Wundrand. Später in der Reparaturphase geht die K14-Färbung verloren, da sich die Epidermis nach innen von außen unterscheidet.
Die Färbung des gesamten Mounts kann auch verwendet werden, um die Expression und Lokalisation anderer wundrelevanter Marker in der Haut sowie das Vorhandensein von Immunzellen von Interesse an der Wundstelle in verschiedenen Stadien der Heilung zu untersuchen. Die Erzeugung reproduzierbarer Exzisionswunden kann zunächst eine Herausforderung sein. Wir empfehlen, das Wundverfahren mit überschüssiger Haut zu üben.
