Bei dieser Methode wird die Kraft direkt auf den Kern ausgeübt. Dadurch entkoppelt sich der Kraftübertragungseffekt von der Zellplasmamembran und dem Zytoskelett und enthüllt die molekularen Mechanismen der Kernmechanosensing. Die Kraft wird in den lebenden Zellen nicht-invasiv angewendet.
Im Vergleich zu optischen Pinzetten beeinflussen das Magnetfeld und die Magnetkraft die Zellfunktionen nicht und haben einen höheren Durchsatz. Beginnen Sie mit der Kultivierung der Zellen mit magnetischen Mikroperlen, indem Sie 0,2 Gramm Carbonyleisen-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von sieben Mikrometern wiegen. Die Mikrokügelchen werden mit einer Pipette in einem Milliliter RPMI 1640-Kulturmedium aufgehängt.
Dann bringen Sie die Petrischale mit B2B-Zellen zur Biosicherheitswerkbank und geben schnell 200 Mikroliter des Mediums mit Mikroperlen in die Petrischale. Legen Sie die Petrischale in einen Inkubator, bis Mikroperlen von den Zellen verinnerlicht sind. Öffnen Sie das inverse Mikroskop und bestimmen Sie mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzbildgebung alle sechs Stunden den optimalen Zeitpunkt für die Internalisierung der Zelllinien, indem Sie die Mikroperlen-, Kern- und Zellgrenze visualisieren.
Die internalisierten Mikrokügelchen werden innerhalb der Zellgrenze vorhanden sein. Öffnen Sie für die Anwendung kleiner Kräfte und die Bildgebung lebender Zellen die Softwareanwendung Elements. Um die magnetische Suche in der Konfiguration zu definieren, klicken Sie auf die Schaltfläche eins über zwei, um die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro zwei Sekunden einzustellen.
Stellen Sie die Lochgröße auf 1,2 Airy-Einheit ein. Überprüfen Sie nur den FITC-Kanal und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um den magnetischen YAP-Kern für die Konfiguration zu definieren, stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro vier Sekunden ein, indem Sie auf die Schaltfläche eins über vier klicken.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche 1.2 Airy-Einheit, um die Lochgröße auf 1.2 Airy-Einheit einzustellen und den FITC-Kanal zu überprüfen. Stellen Sie PMT HV auf 70, versetzt auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um die Kerngrenze und die Intensität der Kernfärbung abzubilden, überprüfen Sie den Cyanin-5-Kanal.
Klicken Sie nicht auf die Taste 1.2 Airy Unit und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null und Laserintensität auf 10 ein. Die Pinhole-Größe wird für die dreidimensionale YES-assoziierte Proteinbildgebung optimiert. Aktivieren Sie als Nächstes die DIA über Elemente.
Öffnen Sie die Spin-Ansicht, verwenden Sie ein Hellfeld und passen Sie den Fokus des Objekts an, um ein klares Bild der Zellen im Fokus zu erhalten. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv, um mehrere einzelne Zellen unter drei Bedingungen zu finden, z. B. eine Zelle mit einer einzelnen Mikroperle im Inneren, mit mehreren Mikroperlen im Inneren und ohne Mikroperle im Inneren. Wechseln Sie dann zum 40X-Objektiv und benennen Sie diese Position mit der entsprechenden Positionsnummer.
Öffnen Sie Elemente, klicken Sie auf Magnetsuche, entfernen Sie die Verriegelung, scannen Sie dann Registerkarten und wählen Sie dann die oberen und unteren Tasten, um die Z-Position der Fokusebene anzupassen, um die untere und obere Grenze für den Z-Stapel der ausgewählten Zellen festzulegen. Beenden Sie den Scanvorgang, indem Sie erneut auf Scan klicken. Wechseln Sie zur magnetischen YAP-Kernkonfiguration und setzen Sie den Dateinamen auf before_small_force.nd2.
Klicken Sie auf den Run-Button mit dem aufgezeichneten Z-Stack. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie die Spin-Ansicht und klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche.
Bewegen Sie den Magneten auf 46 Millimeter über dem Petrischalenboden, indem Sie den Knopf der Magnetbewegungsvorrichtung drehen. Speichern und überprüfen Sie das Video, um die durch Magnetkraft induzierte Mikroperlenverschiebung zu bestätigen. Wiederholen Sie den Scanvorgang, indem Sie den Dateinamen auf after_small_force.nd2 festlegen.
Wechseln Sie anschließend zum rechten Lichtpfad, schalten Sie DIA ein und öffnen Sie die Spin-Ansicht, bevor Sie auf die Aufnahmeschaltfläche klicken. Drehen Sie den Magnet-Moving-Device-Knopf bis zu 120 Millimeter über dem Petrischalenboden und speichern Sie eine Hellfeld-Bildsequenz oder ein Video. Wiederholen Sie die Schritte zum Scannen, indem Sie den Dateinamen auf before_large_force.nd2 setzen.
Die Mikrokügelchen können unter Laseranregung im FITC- oder Cyanin-5-Kanal keine Fluoreszenz emittieren. So wurden die internalisierten Mikrokügelchen durch die dunkle Mulde identifiziert, die sich in der konfokalen Bildgebung der Fluoreszenz von YES-assoziiertem Protein und Zellkern befindet. Die Kernzirkularität zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontrollzellen und Zellen mit Mikroperleninternalisierung.
Das YES-assoziierte Proteinzellkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis von Kontrollzellen, die mit Mikroperlen, aber ohne Internalisierung kokultiviert wurden, und Zellen mit Mikroperleninternalisierung zeigten ebenfalls keinen signifikanten Unterschied. Die Kernverformung und Depolymerisation von Aktin wurde durch die Kompressionskraft verursacht, die von den Mikroperlen in zytoskeletthaltigen Zellen ausgeübt wird. Die Kalibrierkurve der quantitativen Bildanalyse, die durch die quantitative AFM-Kraftverschiebungsbeziehung bereitgestellt wird.
Basierend auf dieser Beziehung wurde die aufgebrachte Kraft der Perlen geschätzt. Die Kernverformung und die YES-assoziierte Proteintranslokation wurden bei Anwendung oder Freisetzung der magnetischen Kraft beobachtet. Die Intensitätsänderungen des YES-assoziierten Proteins im grünen Kanal und keine Änderung der Kernfärbung im roten Kanal bestätigten, dass die durch die Magnetkraft induzierte Kernverformung durch die YES-assoziierte Proteintranslokation ausgelöst wurde.
Die Quantifizierung der Nettoänderung des YES-assoziierten Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnisses innerhalb von zwei Gruppen bestätigte, dass die Magnetkraft, die auf die Mikroperlen innerhalb des Zytoplasmas ausgeübt wird, die YES-assoziierte Proteintranslokation induzierte und das YES-assoziierte Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis veränderte. Bevor Sie Kraft und Bildgebung anwenden, stellen Sie sicher, dass die Zellen die magnetischen Mikroperlen verinnerlicht haben und sich die Perlen innerhalb der Zellgrenze befinden.
