Einführung MicroRNAs wurden als wichtige Regulatoren der Genexpression, die die Aktivität von vielen wichtigen biologischen Prozessen modulieren entstanden. Mit mehr als 700 Menschen miRNAs bisher 1 identifiziert, ist es nicht verwunderlich, dass Mutationen und unsachgemäße Regulierung von miRNAs auf eine Vielzahl von physiologischen Störungen wie Krebs und Herzerkrankungen 2,3 verbunden worden sind. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Mehrheit der miRNA regulatorischen Bindungsstellen in 3&#39;UTRs 4,5 gefunden werden, und einige Forscher haben geschätzt, dass es Hunderte von Zielen pro miRNA in der Zelle 6. Angesichts der biologischen Bedeutung von miRNAs, die große Zahl von miRNAs, die es gibt und die große Anzahl von Zielen für jeden von ihnen, ist es entscheidend, dass die Forscher in der Lage, zuverlässig zu identifizieren endogenen Ziele von miRNAs, vorzugsweise auf Plattformen zugänglich High-Throughput-Studien sind. Unter Ausnutzung Computational Tools wie miRBase, TargetScan und PicTar 1,6,7 ist eine leistungsstarke Möglichkeit, Listen von vermeintlichen mRNA Ziele für jede miRNA zu generieren, sind die Vorhersagen noch nicht genau genug, um auf allein 8 herangezogen werden. Deshalb haben die Forscher auch nutzen eine Reihe von experimentellen Ansätzen, um Ziele de novo zu identifizieren oder prognostizierten Ziele zu überprüfen. Viele Teams haben sich auf High-Throughput-Maßnahmen der steady-state mRNA oder Protein-Ebene verlassen, um Gene für die Expression ändert sich, wenn miRNA-Aktivität gestört wird 4,9,10 identifizieren. Solche Veränderungen sind zweifellos biologisch sinnvoll und stellen einen wichtigen ersten Schritt, aber die Messung von Veränderungen in insgesamt Ausdruck nicht zwischen direkten Auswirkungen einer miRNA unterscheiden auf ein Transkript und indirekte oder nachgeschalteten Signalwirkung. Weitere leistungsstarke Werkzeuge, die Beweise für unmittelbare miRNA-mRNA Interaktionen sind Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Strategien, die Cross-Link-Argonaut-Proteine ​​(und damit die RISC-Komplex), um miRNAs und mRNAs, wenn die Identifizierung der Interaktionspartner nicht sofort zeigen die funktionellen Auswirkungen eine solche Bindung bei 5,11. So haben 3&#39;UTR-Reporter-Assays, die funktionelle Beweise für eine miRNA-Effekt auf einen bestimmten UTR bieten zu einem wichtigen Bestandteil einer gründlichen miRNA-Studie. Solche Zell-basierte Assays Daten zusammen mit Computational Ziel Vorhersagen oder Ausdruck und Proteomik-Daten übernommen bietet starke Beweise dafür, dass eine bestimmte 3&#39;UTR direkt durch die miRNA von Interesse geregelt. In einem 3&#39;UTR-Reporter-Assay ist der 3&#39;UTR von einem Gen von Interesse, um das Ende eines Luciferase-Reportergen fusioniert. Wenn die 3&#39;UTR ist ein Ziel von miRNA wird der Reporter-Transkript Stabilität und / oder ihre Übersetzung Effizienz mit einer Variation in der funktionellen miRNA-Konzentration ändern. So anders als Transkript-only basierte Assays, helfen Reporter-Assays identifizieren Wirkungen sowohl auf die steady state mRNA und Protein-Ebene. Reporter-Systeme können auch verwendet werden, um die funktionalen Auswirkungen der Mutagenese einer vermeintlichen miRNA-Bindestelle in einer 3&#39;UTR zu bestätigen, dass es erforderlich ist, für die interaction8 studieren. Und während groß angelegte Studien mit Expressions-Arrays, Proteomik Techniken und Argonaut ChIP wertvolle genomweite Daten für eine kleine Anzahl von experimentellen Bedingungen, zellbasierte Reporter-Assays liefern, sind die meisten zugänglich Scaling-up für das Studium der miRNA-3 &#39; UTR Interaktionen in Hunderte oder Tausende von Bedingungen, wie könnte es für das Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen oder andere Bibliothek-basierte Effektoren notwendig. Viele Wissenschaftler haben Reporter-Assay-Technologie, um die Untersuchung von miRNA-3&#39;UTR Wechselwirkungen angewendet. Doch mit der Idee, dass viele miRNAs jedes Ziel Hunderte von verschiedenen Abschriften, es wurde für die Forscher schwierig, diese leistungsfähigen Ansatz auf einem High-Throughput-Skala verwenden, da das Klonen, Validierung und Optimierung Schritte zum Erstellen Tausende von verschiedenen 3&#39;UTR- Reporter Vektoren sind oft kostspielig. In dem Bemühen, kleine und große 3&#39;UTR-Reporter Studien zugänglich zu jedem Forscher zu machen, haben wir eine genomweite Sammlung menschlicher 3&#39;UTRs in die hoch-optimierte LightSwitch Luciferase Assay System vor geklonten erstellt. Der Reporter-System beinhaltet auch validierten Vektoren, einen Satz von mehr als 700 synthetische miRNA Ziel-Reporter-Konstrukte für die Verwendung als positive Kontrollen, sowie eine Reihe von standardisierten experimentellen Protokolle. Mit dem folgenden Protokoll, können Sie fragen, ob ein bestimmtes menschliches 3&#39;UTR ein Ziel Ihrer miRNA von Interesse ist. Die entscheidenden Schritte in diesem Workflow werden experimentelle Design, die Transfektion von Reporter-Konstrukte und miRNA imitiert, Luciferase-Reporter-Assays und Datenanalyse. Für die experimentelle Design, ist es wichtig, nachdenklich wählen Sie eine transfizierbare Zelllinie, Experimental-und Kontrollgruppe Reporter-Konstrukte, und miRNA imitiert und nicht-Targeting-Kontrollen. Gemeinsame hoch transfizierbare adhErent Zelllinien wie HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, und andere, oft gut mit diesem Protokoll. Wichtige Hinweise zum experimentellen Design Die LightSwitch Luciferase Assay System ist ein voll optimiertes Reporter-System, das GoClone Konstrukte unter Verwendung der RenSP Luciferase-Gen und LightSwitch Luciferase Assay Reagenzien enthält. Verwenden Sie alle Komponenten des LightSwitch System als empfohlen, um eine optimale Reporter-Assay Ergebnisse zu erhalten. Co-Transfektion von Oligos / Plasmide mit Schaltanlagen GoClone Reporter-Konstrukte reduziert insgesamt Luciferase-Signale in einem nicht-spezifischen Art und Weise. Deshalb ist es wichtig, die nach der Transfektion Kombinationen ausführen: Reporter nur, Reporter + non-targeting Kontrolle miRNA und Reporter + spezifische miRNA. Unsere empty_3UTR Vektor (starken Promotor, keine UTR) bietet eine sehr hohe Luciferase-Signal und dient als positive Kontrolle für die Transfektionseffizienz und eine synthetische miRNA Ziel-Reporter Vektor kann als positive Kontrolle für mimische Aktivität dienen. Darüber hinaus empfehlen wir die Verwendung des GoClone 3&#39;UTR Hauswirtschaft Kontrollen und stichprobenartige Kontrollen für die präzise Trennung von Sequenz-spezifische vs unspezifische Effekte. Study Ihr Protokoll und wann immer möglich zu machen Mastermixen, um die Variabilität in Ihrer Daten durch Pipettieren Fehler oder Verdunstung zu verringern. Dieses Protokoll verwendet DharmaFect Duo Transfektionsreagenz (Dharmacon). Tag 1 Wichtiger Tipp: Wählen Sie Ihre Zelllinie mit Bedacht aus. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit einer Zelllinie, die bekanntermaßen transfizierbare ist. Wir haben auch festgestellt, dass die messbare Reaktion eines 3 &#39;UTR-Reporter zu einem miRNA imitieren gedämpft wird in Zell-Linien mit hohen endogenen, dass insbesondere miRNA. Wenn Sie nicht wissen, wie viel Ihr Zellinie exprimiert miRNA, versuchen SGG ist synthetische microRNA Ziel, die indirekt misst die Häufigkeit eines bestimmten miRNA in einer Zelle als auch darüber informiert, wie der dynamische Bereich des Assays. 1. Seed-Zellen zu ≥ 80% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erhalten. <ol><li> Seed-Zellen in einer 96-well weißen TC Platte in 100 &amp;mgr; l Gesamtvolumen. </li><li> In parallel, Saatgut der entsprechenden Anzahl von Zellen in einer klaren 96-Well-Platte für die Beurteilung der Mündung. </li></ol> WICHTIGER TIPP 1: Confluence ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen in einer mimischen Experiment. Für eine optimale Zuschlag sollten die Zellen zu 100% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden. WICHTIGER TIPP 2: Verwenden niedrigen Durchgang Zellen für die besten Ergebnisse. Zellen, die zu oft haben passagiert eher lauten Transfektion Daten zu erhalten. Tag 2 Bereiten GoClonereporter Konstrukte und miRNAs, dann in die konfluenten Zellen zu transfizieren. 2. Bereiten Konstrukte <ol><li> Thaw GoClone Konstrukte (Plasmid-DNA) bei Raumtemperatur. Gut mischen. </li><li> Zentrifuge, um Kondensation von der Kappe entfernen. </li></ol> 3. Bereiten Micro RNAs <ol><li> Thaw microRNAs (spezifische Mimik und non-targeting-Kontrollen) bei Raumtemperatur und zentrifugieren, um Kondensation von den Kappen zu entfernen. </li><li> Verdünnen, um eine funktionierende Konzentration von 2 nM in RNase-freiem Wasser. </li></ol> Zusätzlich zu einer experimentellen miRNA imitieren immer ein non-targeting miRNA-Steuerung. Co-Transfektion ein Plasmid und ein kleines RNA-Oligo führt zu geringeren Signal als Transfektion der Plasmid allein. Fügen Sie einen oder mehrere positive Kontrollen. Erwägen Sie die Verwendung einer der Hunderten von synthetischen miRNA Ziel-Reporter-Vektoren in SGG-Katalog. Fügen Sie eine oder mehrere negative oder unspezifische Kontrollen. SGG hat eine Reihe von Kontrollen einschließlich 3 &#39;UTRs von Housekeeping-Genen, zufällige Fragmente und / oder die leere (kein UTR insert) zu kontrollieren. Die Verwendung von einem oder mehreren dieser Kontrollen neben einem experimentellen Aufbau ermöglicht es Ihnen, für alle nicht-spezifische Effekte auf die Überexpression von Ihren spezifischen miRNA oder die Nicht-Targeting Kontrolle zu normalisieren. 4. Bereiten Transfektionen <ol><li> Für jede Transfektion kombinieren die folgenden Reagenzien für einen einzigen Test: </li></ol> Mischung 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Individuelle GoClone Reporter: </td><td> 3,33 ul </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> Variiert * </td></tr><tr><td> Serum-freien Medien: </td><td> bis 10 ul </td></tr></tbody></table> * Effektive Konzentration der miRNA kann von 10 nM-100 nM variieren. Consult miRNA Hersteller für entsprechende Konzentration. Wichtiger Tipp: Fügen Sie nicht zu viel zu imitieren. Ein vernünftiger Bereich für imitieren Konzentrationen 10-50 nm in den letzten 100 ul Reaktion. Führen Sie mindestens drei Replikate Transfektionen für jede Behandlung / UTR Kombination und zusätzliche Volumen für das Pipettieren Fehler erlauben. Zum Beispiel, multiplizieren Sie die einzelnen Reaktionsvolumina von 3,5 bis genug Transfektion Mix für 3 replizieren Transfektion Brunnen inklusive Verlängerung zum Pipettieren Fehler oder Verdunstung zu bekommen. Für jeden Reporter, Einrichten Wiederholungen für die folgenden: Reporter nur, Reporter + non-targeting Kontrolle miRNA und Reporter + spezifische miRNA. Set up Transfektionen für das Targeting microRNA zur gleichen Zeit wie die für eine nicht-Targeting zu kontrollieren. <ol start="2"><li> Make up der DharmaFECT DUO (Dharmacon)-Gemisch wie folgt für jede Transfektion: </li></ol> Mischung 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 ul </td></tr><tr><td> Serum freie Medien: </td><td> 9,85 ul </td></tr></tbody></table> Die Höhe der DharmaFECT Duo hinzugefügt werden kann Zelllinie abhängig sein. Die oben angegebenen Mengen sind für HT1080-Zellen. Wenden Sie sich an die Dokumentation des Herstellers, um den entsprechenden Betrag für Ihre Zelllinie zu bestimmen. Tipp: Machen Sie einen großen Transfektion Mischung durch Multiplikation der Mengen von mehr als durch die Zahl der Journalisten, repliziert die Anzahl und die Anzahl der miRNAs getestet werden. Bei der Berechnung der Höhe der Transfektion Mix zu erstellen, sollten Sie eine kleine Menge extra für Pipettierfehler und Verdunstung Konto gehören. <ol start="3"><li> Lassen Sie die DharmaFECT Duo Mischung bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. </li><li> Nach 5 Minuten, fügen Sie 10 &amp;mgr; l der DharmaFECT Duo-Gemisch (Gemisch 2) für jeden vorbereitet Rohr 10uL Plasmid-und / oder miRNA (Gemisch 1). Jedes Rohr sollte dann enthalten ein Volumen von 20 &amp;mgr; l pro Wiederholung Transfektion. </li><li> Inkubieren jeder Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 20 Minuten, fügen Sie 80 ul vorgewärmtes (37 ° C), Antibiotika-freien, vollständigen Medien je Wiederholung in jedes Röhrchen für eine Gesamtmenge von 100 &amp;mgr; l pro Wiederholung Transfektion. Ein Deep-Well-Block kann für die Herstellung von vielen Wiederholungen und Proben gleichzeitig verwendet werden. Mischen Sie die Lösung durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie die gesetzte Platte aus dem Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die Zellen mindestens 80% konfluent sind. </li><li> Sorgfältig Pipette aus den Medien von jeder Vertiefung. </li><li> Add 100 &amp;mgr; der Transfektion Gemisch (20 ul DNA / Reagenzienmix + 80uL Medien) in jede Vertiefung. </li><li> Legen Sie Platte in Inkubator über Nacht. </li></ol> Nicht zu bebrüten. Die meisten imitiert wird zu signifikanten Ergebnisse auf bona fide Ziele innerhalb von 24 Stunden. Das Niveau der Repression messbare nach 48 Stunden kann größer sein, aber so wird das auch gut Variabilität. Mimic Experimente sind einfacher als Inhibitor Experimente. Während die meisten imitiert deutlich unterdrücken wird wahr Ziele innerhalb von 24 Stunden, erhebliche de-Repression auf die Inhibitor kann 48 Stunden messbar sein und wird fast immer weniger ausgeprägt als die Wirkung des zu imitieren. Tag 3 Hinweis: Luciferase-Assays können sofort durchgeführt werden oder die Platten können bei -80 ° C eingefroren werden (Einfrieren der Regel erhöht Zelllyse und Luciferase-Signal). Einfrieren und Auftauen Ihre Zellen vor Testbeginn für beste Ergebnisse. REMEMBER auf gefrorenen Zellen auftauen auf Raumtemperatur lassen, bevor Sie LightSwitch Assay Reagent. 5. Messen Sie die Luciferaseaktivität mit LightSwitch AssayReagents <ol><li> Entfernen Platte von Inkubator und auf Raumtemperatur bringen. </li><li> Bereiten LightSwitch Assay Reagenzien (für LS010-Kit, Protokolle von anderen Kit Größen können online gefunden werden): <ol><li> Rekonstituieren 100X Substrat durch Zugabe von 100 &amp;mgr; l des Substrats Solvent zu Tube lyophilisiert Assaysubstrat. Vor Licht und möglichst wenig Zeit bei Raumtemperatur. 100X Substrat kann bei -20 ° C für 2-3 Wochen gelagert werden. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit frisch wiederhergestellten Substrat. </li><li> Bereiten Assay-Lösung durch Auftauen 10ml Flasche Assay-Puffer bei Raumtemperatur Wasserbad und fügen 100 &amp;mgr; rekonstituierter 100X Substrat vor dem Gebrauch. Gut mischen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie ein Multi-Kanal-Pipette auf 100 &amp;mgr; LightSwitch Assay-Lösung (Puffer + Substrat) direkt zu jeder Probe gut (mit 100 ul Zellen + Medien) in einem weißen 96-Well-Platte hinzufügen. Wenn Zellen wurden in einer anderen Platte oder Kolben-Format übertragen Proben gewachsen um einen weißen 96-Well-Platte in 100 &amp;mgr; l Gesamtvolumen (Medien oder PBS). </li><li> Abdeckplatte, vor Licht zu schützen, und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bei Testung mehr als eine Platte, taumeln Zugabe von Assay-Lösung, so dass jede Platte für 30 Minuten vor dem Lesen brütet. </li><li> Lesen Sie jede gut für 2 Sekunden in eine Platte lumiLuminometer (SpectraMax L oder gleichwertig). </li><li> Berechnen Sie den Zuschlag durch die Berechnung Luciferase-Signal-Verhältnis für jedes Konstrukt für spezifische miRNA über die nicht-Targeting-Steuerung (Lumineszenz = spezifische miRNA / non-targeting-Steuerung). Verwenden Sie die Daten aus Haushalt, zufällige und leere Konstrukte für Nicht-UTR spezifische Behandlung Effekte zu steuern. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse 3&#39;UTR Ziele in der Gegenwart eines Targeting-miRNA zeigen Luciferase Zuschlag. Der Knockdown von 3&#39;UTR-Luciferase-Reporter-Aktivität durch let-7a wurde in HT1080-Zellen durch Co-Transfektion von 100 ng von jedem Reporter gemessen Konstrukt mit 20nm let-7a imitieren oder nicht-Targeting-Kontrolle, Inkubation für 24 Stunden, dann liest der Lumineszenz-Reporter Signal mit LightSwitch Luciferase Assay-Reagenzien. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Punktiert und ARID3B menschlichen 3&#39;UTRs sind die Ziele des let-7a microRNA. Signale von menschlichen 3&#39;UTR-Reporter für die punktiert und ARID3B Gene sind deutlich in der Gegenwart des let-7a microRNA klopfte imitieren, während Signale für Hauswirtschaft und zufälliger Reihenfolge UTRs nicht.

<ol>
	<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cancer+connection:+the+beginning+of+a+new+tale.">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li><li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure.">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li><li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li><li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance.">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in.">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li><li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122.">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li><li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs.">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li><li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function.">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li><li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing.">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li><li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p.">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , (2011).</li></ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von Schaltanlagen Genomics, die Werkzeuge und Reagenzien erscheinen in diesem Artikel machen. Die Produktion dieser Artikel wurde von Schaltanlagen Genomics gesponsert.

Wir haben eine genomweite Sammlung von pre-geklonten menschlichen 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte geschaffen, um Studien von miRNA-3&#39;UTR Interaktionen in lebenden Zellen zu ermöglichen. Hier haben wir eine reproduzierbare und High-Throughput-Methode für die Co-Transfektion miRNA ahmt mit 3&#39;UTR-Reporter mit einem Luciferase-Reporter-System gezeigt. Diese Methode basiert auf Forscher mit Hilfe eines hoch transfizierbare Zelllinie und störende miRNA-Aktivität mit einer Überexpression Technik. Forscher mit schlecht transfizierbare Zelllinien können sollten Sie unser Begleiter lentiviralen 3&#39;UTR-reporter-Sammlung in Verbindung mit Sigma (Mission 3&#39;UTR Lenti GoClones) erstellt. Die Behandlung der Zellen mit miRNA imitiert führt zu einer Überexpression Typ Experiment, und mit einer solchen Studie, Forscher ist zu berücksichtigen, dass dies kann, muss aber nicht die tatsächlichen physiologischen Bedingungen. Um eine Überexpression betrifft, können die Forscher miRNA-Inhibitoren zusätzlich zur Mimik verwenden, um die Interaktion mit zwei verschiedenen Arten von Störung 14.12 studieren. Sobald wahrscheinlich miRNA Ziele identifiziert werden, können die Forscher wollen die vermeintliche miRNA Bindungsstellen mutagenisieren, um festzustellen, ob die Websites, die für die funktionelle Wechselwirkung sind. Sie können auch wollen Maßstab bis hin zur Prüfung Hunderte von verschiedenen potenziellen Ziel UTRs (Boutz). Darüber hinaus, wenn Forscher interessiert, ob die miRNA ist betroffen Transkriptstabilität oder Übersetzung Effizienz sind, kann Luciferase-Reporter-Daten an Maßnahmen der steady-state-Transkript Ebenen verglichen werden. Jede Änderung in Luciferase-Signal, das nicht mit einer proportionalen Änderung in Transkripten verbunden werden, um einen Effekt aus der Währungsumrechnung Effizienz Punkt. Schließlich können Forscher nutzen Reporter-Vektoren erzeugen eine Dosis-Wirkungs-Kurve der relativen Empfindlichkeit der verschiedenen UTRs Änderungen in miRNA-Konzentration 14 Vergleichen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Verkäufer </td><td> Catalog Number </td></tr><tr><td> Weiß-Zellkulturplatten (96-well mit festem Boden) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Klare Zellkulturplatten (96-well) mit Deckel </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch Luciferase Assay Reagent </td><td> Schaltanlagen </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo Transfektionsreagenz (0,75 ml) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010 bis 02 </td></tr><tr><td> Foil Platte Dichtungsband </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Atmungsaktive Platte Dichtungsband </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Platte Luminometer </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und spielen eine Rolle in vielen biologischen Prozessen. Mehr als 700 Menschen miRNAs wurden bisher mit jeweils bis zu Hunderte von einzigartigen Ziel-mRNAs identifiziert. Computational Tools, Meinungs-und Proteomics-Assays und Chromatin-Immunopräzipitation-basierte Techniken liefern wichtige Hinweise zur Identifizierung mRNAs, die direkten Ziele eines bestimmten miRNA sind. Darüber hinaus haben 3&#39;UTR-Reporter-Assays zu einem wichtigen Bestandteil einer gründlichen miRNA Ziel-Studien, da sie funktionelle Beweise für und bieten Quantifizierung der Auswirkungen von spezifischen miRNA-3&#39;UTR Interaktionen in einer Zelle-basiertes System. Um mehr Forscher zu nutzen 3&#39;UTR-Reporter-Assays und die Scale-up von solchen Assays mit hohem Durchsatz Ebenen zu unterstützen, haben wir eine genomweite Sammlung menschlicher 3&#39;UTR Luciferase Reporter in der hoch optimierten LightSwitch Luciferase erstellt Testsystem. Das System beinhaltet auch synthetische miRNA Ziel-Reporter-Konstrukte für die Verwendung als positive Kontrollen, verschiedene endogene 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte, und eine Reihe von standardisierten experimentellen Protokolle. Hier beschreiben wir eine Methode zur Co-Transfektion von einzelnen 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte zusammen mit einem miRNA nachahmen, ist eine effiziente, reproduzierbare und zugänglich Analyse mit hohem Durchsatz.

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells at 

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und haben gezeigt, dass eine Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Um besser zu verstehen miRNA-UTR-Interaktionen, haben wir eine genomweite Sammlung von 3 UTR Luciferase Reporter mit einem neuartigen Luciferase-Gen und Assay-Reagenz, das LightSwitch System gepaart erstellt.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

36.0K Aufrufe.  SwitchGear Genomics. MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und haben gezeigt, dass eine Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Um besser zu verstehen miRNA-UTR-Interaktionen, haben wir eine genomweite Sammlung von 3 UTR Luciferase Reporter mit einem neuartigen Luciferase-Gen und Assay-Reagenz, das LightSwitch System gepaart erstellt.

Serie: Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Forschung

Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Eine Stoff Screening Verfahren für die Glucocorticoid-Signalisierung mit einem Zebrafisch-Larve Luciferase-Reportersystems

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.