Name: functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
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Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant (R01-DE025985) und durch eine amerikanische Krebs Gesellschaft Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch unterstützt durch Zuschüsse aus dem US Department of Agriculture (2015-67015-23268 und 2014-67015-21787) und neue Research Initiative Grant University of California, Davis.

Achtung: Zelllinien verwendet in diesem Verfahren infektiöse Viren enthalten, seien Sie vorsichtig und nur in Stufe 2 BSL Anlage oder höher gehen.
1. Handy-Vorbereitung und Wartung
<ol><li>Kulturzellen TREx-K-RTA BCBL-1 (oder ein anderes KSHV infiziert PEL-Zell-Linien) in RPMI1640 Medium mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung ergänzt.</li>
	<li>Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) sicherstellen, dass kontinuierlich wachsen und Zellen geteilt durch ein Verhältnis von 1:4 alle 2 – 4 Tage.</li>
	<li>Überwachen Sie Zellkulturen mit einem Lichtmikroskop jeden Tag bestätigen gute Zellwachstum und Morphologie, ansonsten empfiehlt es sich, die Zellkultur neu zu starten oder die Zelle Kulturbedingungen entsprechend anpassen.</li>
</ol>(2) Thymidin-Synchronisation und lytischen Induktion
<ol><li>In einer 10 cm Petrischale Platte TREx-K-Rta BCBL-1 Zellen in frisch zubereitete Medien (1 x 106 Zellen/2 mL der Medien)</li>
	<li>Fügen Sie 200 mM Thymidin (Endkonzentration: 2 mM) in die Schale mischen und 18 h inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen, die S-Phase für 8 h beenden.</li>
	<li>Hinzufügen von Thymidin (Endkonzentration: 2 mM), mischen und 16 h inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Um virale Reaktivierung zu induzieren, 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, Endkonzentration 20 ng/mL) und Doxycyclin (DOX, Endkonzentration 100 ng/mL) für die Zellkultur, mischen und 4 h inkubieren. Stimulieren Sie für Zell-Linien ohne eine K-Rta induzierbaren Kassette Reaktivierung mit TPA (Endkonzentration 20 ng/mL und Natrium Butyrat (1 mM)).</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in komplette Kulturmedien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In komplette Kulturmedien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen für 24 h zu wachsen.</li>
</ol>(3) Fixierung und Permeabilisierung
Hinweis: Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher Befestigung Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC-behandeltem PBS) Diethyl Pyrocarbonate behandelt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DEPC-PBS), Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) und Permeabilizating Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) sind bereit. In der Regel wird jede Folie benötigen mindestens 0,5 Millionen Zellen, vermehren, wenn notwendig und umfassen zusätzliche Zellen für Rücken vor allem, wenn Zellen nicht gesund sind.
<ol><li>Sammeln Sie Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Zentrifuge für 2 min bei 200 X g. waschen den Zellen die Zellen 3 Mal mit 1 mL sterile DEPC PBS. In 1,2 mL DEPC PBS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Legen Sie die entsprechende Anzahl von Deckgläsern (bestimmt durch den Versuchsaufbau) in den Böden der 6-Well-Platte.</li>
	<li>Pipette 200 µL der Zelle DEPC PBS-Mischung auf jeden Deckglas, sicherzustellen, dass mindestens 0,5 Millionen Zellen auf jeder Folie. Können Sie die Zellen für 2 min zu begleichen, und aspirieren Sie überschüssige DEPC PBS verlassen nur eine dünne Schicht von Zellen. Es ist normal, dass Zellen in diesem Prozess entfernt werden. Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 1 mL der Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC PBS) für jede Deckglas Befestigung. Lassen Sie die Zellen für 10 min beheben.</li>
	<li>Waschen Sie Deckgläsern 3 Mal mit DEPC PBS.</li>
	<li>Sorgfältig fügen Sie 1 mL Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) auf jeder Deckglas. Lassen Sie die Zellen für 5 min zu stillen.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber vorsichtig in die hand zu, für 1 min. Absaugen des überschüssigen DEPC PBS. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 1 mL permeabilizing Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) für jede Deckglas sorgfältig. Lassen Sie die Zellen, die für 15 min permeabilize. Hinweis: An dieser Stelle können die Deckgläsern in einem Gefrierschrank-20 ° C nicht länger als eine Woche gespeichert werden. Vermeiden Sie einfrieren zu oder minimieren Sie die Zeit in den Gefrierschrank, wie schnell die Bildqualität verschlechtern kann. Sicherstellen Sie, dass wenn Sie in den Gefrierschrank, den die Zellen bleiben feucht und bedeckt in Methanol/Aceton und um sicherzustellen, dass sie nach der Entnahme aus der Tiefkühltruhe richtig mit DEPC PBS rehydrieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber sanft in der hand für 1 min. aspirieren Sie die überschüssige DEPC PBS, achten Sie darauf, die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.</li>
</ol>4. IFA und RNA-Fisch
Hinweis: In Bezug auf RNA Fisch Sonde Kennzeichnung und Vorbereitung: für die K-Rta Intron 959 Basenpaare, 31 verschiedenen Sonden wurden generiert, die begnügten 20 Basenpaare jeweils mit einem GC von etwa 50 %. Arbeits- und Lager Lösungen der Sonden wurden bzw. regelmÄÑig in 100 µM und 2,5 µM Konzentrationen.
<ol><li>Objektträger mit notwendigen experimentellen Daten oder irgendeine Art von unterscheidbar Label zu kennzeichnen.</li>
	<li>Linie unten einen verschließbaren Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch.</li>
	<li>
Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung (1,5 µL LANA Antikörper, 0,75 µL RNA-Pol-II-Antikörper, 3 µL des Bäckers Hefe tRNA, DEPC PBS bis zu 30 µL), und multiplizieren Sie Rezept für jede vorhanden Deckglas. Platz 30 µL Primärantikörper Lösung auf jeder beschrifteten Objektträger.
	<ol>
<li>Titrieren Sie zunächst den primären Antikörper von Interesse und nutzen Sie die optimale Menge. Achten Sie darauf, gereinigte IgG zu verwenden, da Serum (Aszites-Flüssigkeit) große Menge von RNase enthalten kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Deckgläschen (Zellen mit Blick auf die Lösung) auf die beschrifteten Objektträger und verschieben Sie die Folien in den Behälter mit der feuchten Papiertuch. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Das äußere des Containers mit Plastikfolie abdecken. Bewegen Sie den Container in einen Inkubator, eingestellt auf 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Fisch-Waschpuffer (2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer (SSC) (final), 10 % Formamid, 90 % DEPC dH2O).</li>
	<li>2 x Hybridisierung Puffer vorzubereiten (4 X SSC, 20 % Dextran Sulfat).</li>
	<li>Bereiten Sie den sekundären Antikörper und Fisch Intron Sonde Puffer (20 µL 2 x Hybridisierung Puffer (letzte 1 x Hyb-Puffer), 4 µL der Bäckerhefe tRNA (letzten 10 %), 4 µL Formamid (letzten 10 %), Intron K-Rta-Sonde (final 125 nM), 0,8 µg Sekundärantikörper, DEPC dH2 O bis zu 40 µL). Multiplizieren Sie Rezept für jede Folie benötigt.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubation Zellen 3 Mal mit DEPC PBS in einer 6-well-Platte für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie mit Waschpuffer Fisch 3 Mal für 5 Minuten. Halten Sie Deckglas in Fisch-Waschpuffer bis Ziel vorbereiten Mischung von Zweitens Antikörper und Intron Sonde (Schritt 4,7).</li>
	<li>Sauberen Objektträger für Primärantikörper Inkubation für die Hybridisierung verwendet.</li>
	<li>Platz 40 µL der Sekundärantikörper und Fisch Intron-Sonde, die Lösung in jedem Glas Folie enthalten.</li>
	<li>Legen Sie Deckgläsern mit den Zellen auf dem Objektträger mit der Zelle-Seite nach unten auf den Puffer, darauf achten, nicht sein, Luftblasen einzuführen.</li>
	<li>Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch auf den Boden. Wickeln Sie Kunststoffbehälter in ersten Plastikfolie und dann in Alufolie.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Container mit den Folien bei 37 ° C für 16-24 h.</li>
	<li>Nach der Inkubation sorgfältig schieben Sie das Deckglas aus der Glas-Folie-Rand und setzen Sie wieder in 6 well-Platten nach oben und waschen Sie Zellen mit Fisch-Waschpuffer 3 Mal in einem 6-well-Platte für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.</li>
	<li>Fügen Sie DAPI (1:1 000) in den 2 X SSC und für 5 min bei Raumtemperatur sitzen lassen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.</li>
	<li>Reinigen Sie die Glas-Folien für die Hybridisierung verwendet, und fügen Sie 10 µL Montagelösung auf den Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie das Deckgläsern Gesicht nach unten auf die Montage-Lösung. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einem Labor Gewebe vorsichtig das überschüssige Befestigungslösung, wobei Sie darauf achten, nicht um die Zellen zu zerquetschen.</li>
	<li>Mit Nagellack, ein reichlich auftragen um den Rand der Deckgläsern und trocknen lassen.</li>
	<li>Fahren Sie mit Fluoreszenz-Mikroskopie durchzuführen.</li>
</ol>5. 3D Fluoreszenz-Mikroskopie
Hinweis: Protokolle variiert mit der Art der Fluoreszenz-Mikroskop-System verwendet, werden die folgenden Schritte helfen, um den Erwerb von optimalen Bilddaten für die Quantitative Analyse zu gewährleisten.
<ol><li>Vorbehandeln Sie feste Proben und montieren Sie in Anti-Fade Medien, Immunofluoreszenz Fluoreszenz während der Bildgebung zu verzögern.</li>
	<li>Verwenden Sie ein hochwertiges Ziel (z. B. ein 60 X 1,42 N.A Ölimmersion Objektiv), das eine ganze Zelle (oder einen Zellkern) erfassen kann in das Blickfeld.</li>
	<li>Belichtungsparameter (z.B.Erregerleistung, Belichtungszeit) für jeden Farbkanal Fluoreszenz, mit positiven und negativen Kontrollproben festgelegt. Fluoreszenzbilder zu erwerben. Hinweis: Positivkontrolle Proben, die nur eine fluoreszierende Label enthalten sollte auch zur Bestimmung der Höhe des "Übersprechen" zwischen Farbkanäle verwendet werden. Für bildgebende feste Zelle Proben kann Fluoreszenz Erregerleistung (mit etwas längeren Belichtungszeiten) reduziert werden, um Immunofluoreszenz zu minimieren.</li>
	<li>Sobald das Image-Protokoll festgelegt worden, erhalten die gleichen Belichtungsparameter konsistent für alle Proben in einer Studie — so dass Bilddaten genau analysiert und verglichen werden können.</li>
	<li>Führen Sie nach der Übernahme Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion. Identifizieren Sie die K-Rta-Transkripte von RNA-FISH-Signal (rot), LANA-Moleküle durch Immunfluoreszenz (grün) und nuklearen Chromatin (falls zutreffend) gebeizt mit DAPI (blau). Hinweis: Regionen des Zellkerns, in denen K-Rta und LANA Co gruppierten sind sind somit vermutlich virale Transkription Fabriken und Replikation komplexer zugeordnet werden.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren dieses Papiers haben keine finanziellen Verbindungen oder konkurrierenden Interessenkonflikte.

Es gibt einige Aspekte des Protokolls, die geändert werden können, um außergewöhnliche Umstände zu berücksichtigen. Die Wahl der Fixierung und Permeabilisierung Puffer kann auch geändert werden. Für Fixierung Puffer Paraformaldehyd ist auch wirksam und Ethanol für Permeabilisierung genutzt werden.
Abschrecken von Formaldehyd mit Glycin, die PBS empfohlen wird, da es verhindert, dass Formaldehyd deaktivieren die Antikörper in Abwesenheit von Rinderserumalbumin (BSA), aber wenn die Dec...

Es ist immer deutlicher geworden, dass die räumlich-zeitliche Organisation des Kerns eine wichtige Rolle spielt bei der Modulation der fein abgestimmten Genexpression in den Eukaryotes. Die meisten Gewebe spezifische Gene über viele Chromosomen verteilt sind und synchron geregelt werden, um auf bestimmte Reize in einer koordinierten Art und Weise1reagieren müssen. Zellen bauen aktiv Chromatin Naben (ACH) als eine Möglichkeit der Zusammenführung von Genen und deren Cis-regulatorische Komponenten auf einem bestimmten nuklearen Raum1.
Es wurde auch durch verschiedene Studien nachgewiesen, dass obwohl der Kern sehr dicht und Viskose scheint, biologisch aktive Molekülen Nucleus ziemlich schnell per Diffusion2durchlaufen können. Als Folge dieser ephemeren Eigenschaft springen"" die meisten DNA-bindende Proteine von verbindlichen Website Website, Gefühl, ihren Weg um die nuklearen Raum, ermöglicht eine sehr anpassungsfähige und vielseitige Kern2als verbindlich.
Trotz dieses dynamische Verhalten von Biomolekülen innerhalb des Zellkerns, nukleare Einrichtungen ohne Membranen wie z. B. (aber nicht beschränkt auf) die Nukleolus, Cajal Körper und Promyelocytic Leukämie nuklearen Einrichtungen (PML-NB) noch vorhanden sind. Es ist durch eine Vielzahl von Mechanismen wie DNA Tandemwiederholungen (Nukleolus), rRNA (Nukleolus) und Strukturproteinen wie coilin (Cajal Bodies) oder PML Proteine (PML-NB), die diese Konstrukte zusammen3,4,5 halten . Diese Strukturen und anderen Gemeinden wie Transkription Fabriken dienen als Gerüste, die erhöhen nicht nur die lokale Konzentration von erforderlichen Komponenten, sondern Regeln auch die Zusammensetzung von Proteinen und Nukleinsäuren in ihnen letztendlich schaffen eine zentraler Standort für effiziente Zellfunktionen6.
Wann und wo atomare Strukturen Form bietet eine Fülle von Informationen für Forscher studieren Epigenetik zu visualisieren. Aus Sicht der Virologie der Reaktivierung der latent infizierten Viren, z. B. KSHV, erheblich verändert die Landschaft des Kerns und Verteilung der nuklearen Enzyme, Transkription in erster Linie aus zellulären Genen auf virale Gene, letztlich zu verlagern, voll funktionsfähige virale Nachkommen7,8zu produzieren. Wie manipuliert KSHV zelluläre gen Ausdruck Maschinen, virale Genexpression zu erleichtern? Solche Informationen könnten auch Aufschluss über zeitliche zelluläre gen Regulationsmechanismen.
Wie alle anderen Herpesviren hat KSHV zwei Lebenszyklen lytischen Replikation und Latenz genannt. KSHV befindet sich in erster Linie in der Latenz-Phase, in der die meisten seiner viralen Gens Ausdruck zum Schweigen gebracht wird, außer Latenz Gene9,10verbunden. Während der Wartezeit, die KSHV produziert verbundene Latenz nuclear Antigen (LANA), die konstitutiv bindet das virale Genom und Anbindehaltung virale Chromatin der menschlichen Chromosom11. Wegen Lanas intime Beziehung mit das virale Genom ist es möglich, IFA und DAPI zu färben und zu lokalisieren, wo der viralen Episomes in Bezug auf die Host-Chromatin waren zu verwenden.
Um KSHV Reaktivierung auf der Ebene der einzelnen Episome und die Assoziation mit anderen viralen Episomes in einer infizierten Zelle zu untersuchen, wurde eine Strategie suchen aktiv Transkription viraler Chromatin in Situ gegründet. Dementsprechend wurden LANA und RNAPII IFA mit Intron-RNA-Fisch kombiniert, durch die Generierung von RNA-FISH-Sonden, die an der Intron-Region (genaue Sonde finden Sie Sequenzen in die Izumiya Lab neueste Veröffentlichung8) binden KSHV K-Rta-die wichtigsten virales Protein, das ist, notwendig und ausreichend für KSHV Reaktivierung-es möglich war, wo Transkription tatsächlich nahm Platz8,11,12,13,14,15 . Diese Intron-RNA-FISH-Technik ermöglicht Forschern zu visualisieren, wo mRNA transkribiert ist, sofort bevor es gespleißt und, Zytoplasma16,17 exportiert.
KSHV kann reaktiviert werden, durch verschiedene chemische Reize, einschließlich Phorbol Ester wie 12-O-Tetradeconoyl-Phorbol-13acetate (TPA) und Histon-Deacetylase-Hemmer wie Natrium Butyrat, zusätzlich KSHV durch Überexpression von reaktivieren induziert werden können die virale Transkriptionsfaktor, K-Rta-19. Forscher haben erfolgreich erhöht die Effizienz der KSHV Reaktivierung durch die Synchronisation der Zelle Zyklen vor Induktion Reaktivierung18. So wurden für diese Spezialuntersuchungen Zellen synchronisiert, mit einen doppelten Thymidin-Block (Protokoll beschrieben) und für eine kurze Zeit mit TPA und Doxycyclin (Dox) inkubiert. Doxycyline wurde verwendet, weil in diesen Experimenten verwendeten Zelllinie eine Doxycyclin-induzierbaren K-Rta-Kassette, die wurde von cDNA kloniert und beinhaltet nicht die Intron-Region von K-Rta hat. Es ist zwar möglich, reaktivieren KSHV mit K-Rta Ausdruck nur induziert, es ist von anderen Forschern nachgewiesen worden, dass aufgrund einer Vielzahl von verschiedenen biochemischen Faktoren K-Rta Ausdruck allein erweist sich als ein schwacher Reaktivierung Reize20. Durch die Kombination aller dieser, und durch die Droge Inkubationen für einen kurzen Zeitraum zu begrenzen wurde eine robuste, aber nicht übermäßig künstliche KSHV Reaktivierung für die Bildgebung erreicht.
Nach LANA, RNAPII, Kennzeichnung K-Rta Introns und DNA als in diesem Dokument beschriebenen, 3D Fluoreszenz-Bildgebung erfolgte mittels einer Weitfeld Dekonvolution Mikroskop. Nach der Bearbeitung mit imaging-Software kann die räumliche Verteilung der aktiven viralen Episomes richtig ausgewertet werden. Mit dieser Technik können die zentralen Fragen über die grundlegende Natur der Bildung von aktiven Chromatin Hubs und andere atomaren Strukturen untersucht werden. Mit identischen virale Episomes in eine einzelne Zelle, die die gleichen regulatorischen Elemente verarbeitet kann eine einzigartige Recherche-Tool zur Vertiefung des Verständnisses der raumzeitlichen gen Regulationsmechanismen darstellen.
Eine Einschränkung von imaging-mehrere Zelle Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert um eine von Natur aus molekularen Dynamik zu charakterisieren ist, dass subtile oder kleine Änderungen bei Fluoreszenz Verteilung unentdeckt oder als unbedeutend. Dies gilt, sofern in dem seltenen Fall, jede Zelle beobachtet die gleiche subtile Änderung zeigt. Daher kann nicht die volle raumzeitliche Beziehung aktive virale Transkription und anderen atomaren Strukturen mit festen Bildgebung kritisch beurteilt werden. Um diese technischen Herausforderungen zu begegnen, ist der beste Ansatz, Bild lebenden Zellen, die virale Episomes geprägt haben und die Lage der wichtigsten zellulären Enzymen im Laufe der Zeit folgen.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Needs to be warmed to 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Solution</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Butyrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>Corrosive, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>Acute toxicity&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>Flammable, toxic</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>67-56-1</td><td>Flammable, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleic acid, transfer from baker&amp;rsquo;s yeast (S. cerevisiae)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15557044</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;rsquo;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D imaging software</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

Es ist bekannt, dass räumliche und zeitliche Regelung der Gene Bestandteil ist des Regierens richtige Genexpression. Daher ist es von unschätzbarem Wert zu verstehen, wo und wann Transkription in nuklearen Raum stattfindet und die Beziehung zwischen Episomes innerhalb der gleichen Zellkern infiziert zu visualisieren. Hier, Immunfluoreszenz (IFA) und RNA-Fische wurden Combinedto identifizieren aktiv Transkription Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) Episomes. Durch Färbung KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA), ist es möglich, zu finden, wo virale Episomes im Zellkern vorhanden. Darüber hinaus können durch die Gestaltung von RNA-FISH-Sonden, um der Intron-Region eines viralen Gens zu Zielen, die nur während der produktiven Infektion ausgedrückt wird, im Entstehen begriffenen RNA-Transkripte befinden. Mit dieser Kombination aus molekularen Sonden, ist es möglich, die Montage von großen virale Transkription Fabriken visualisieren und analysieren die räumlichen Regulierung der viralen Genexpression während KSHV Reaktivierung. Durch die Einbeziehung Anti-RNA-Polymerase II Antikörper Färbung, kann man auch die Assoziation zwischen RNA-Polymerase II (RNAPII)-Aggregation und KSHV Transkription bei Reaktivierung sichtbar machen.

Eine leicht gekürzte Protokoll wurde durchgeführt, wo BCBL-1-Zellen dienten und nur LANA und K-Rta RNA (Abbildung 1 gefärbt wurden). Dieses Experiment kann wir prüfen, wo aktiv Universalklassifikation virale Episomes sind und die Heterogenität der Reaktion auf KSHV Reaktivierung Reize in einer Bevölkerung der Zellen. In der Zelle wird durch den Pfeil in Abbildung 1ist die verschiedene K-Rta-Fluoreszenz in Regionen, in denen...

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Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K Aufrufe.  University of California, Davis. Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Serie: Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Biotechnik

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Biologie

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...