Dieses Protokoll bietet eine relativ schnelle und kostengünstige Methode sowie eine automatisierte Erfassung und Analyse, wodurch ein Screening mit geringer Empfindlichkeit von 5-Methylcytosin, einem gängigen epigenetischen Biomarker, erzeugt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Flexibilität, die sie einem experimentellen Design bietet, das Benutzer an ihr Modell und ihren Entwicklungsstand anpassen können. Diese Technik kann verwendet werden, um zu erkennen, wie chemische Exposition die relative Häufigkeit von 5-Methylcytosin in einem sich entwickelnden Organismus verändert, was normalerweise nur durch teure Methoden mit hohem TrpA-Wert wie Sequenzierung erreicht werden könnte.
Diese Methode ist nützlich für jede Forschung, die darauf abzielt, NCG-Methoden zu verwenden, um epigenetische Veränderungen von 5-Methylcytosin als Reaktion auf Umweltreize zu verstehen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer frischen Belichtungslösung am Morgen der Entnahme. Geben Sie fünf Milliliter partikelfreies Systemwasser in eine 60 Millimeter Glas-Petrischale.
Verwenden Sie dann eine 10-Mikroliter-Mikrokapillarglaspipette, um 10 Mikroliter Dimethylsulfoxid oder chemische Stammlösung in Systemwasser zu übertragen. Schwenken Sie die Glaspetrischale, um sicherzustellen, dass sich die Stammlösung auflöst. Fügen Sie weitere fünf Milliliter Systemwasser in die Glas-Petrischale und schwenken Sie die Schale, um die Belichtungslösung zu homogenisieren.
Verschließen Sie das Glasgeschirr mit Glasdeckeln, um die Verdunstung zu minimieren. Als nächstes verwenden Sie eine mit RO-Wasser gefüllte Spritzflasche, um die Embryonen aus dem Fischnetz in eine 100-Millimeter-Schale zu übertragen. Sortieren Sie zufällig 50 lebende Embryonen 0,75 Stunden nach der Befruchtung und entfernen Sie überschüssiges RO-Wasser.
Nach Ablauf der Expositionsdauer werden die Embryonen aus dem Inkubator entnommen. Alle lebenden Embryonen werden in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Residuale Expositionslösung absaugen, ohne Embryonen abzusaugen.
Fügen Sie 500 Mikroliter gekühltes 4% Paraformaldehyd hinzu und mischen Sie die Embryonen mehrmals durch Inversion. Lassen Sie die Embryonen fixieren und 4% Paraformaldehyd über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Fixierung der Embryonen aspirieren Sie die 4% Paraformaldehyd, verbringen Sie die Embryonen erneut in 1X PBS und mischen Sie sie durch sanftes Pipettieren für 30 Sekunden.
Übertragen Sie fixierte Embryonen vorsichtig mit einer Glaspipette in eine mit RO gefüllte Glasschale. Schwenken Sie vorsichtig für 30 Sekunden und wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Unter einem Stereomikroskop mit fünffacher Vergrößerung die Embryonen mit Spritzennadeln dekorieren.
Punktieren Sie das Chorion mit der Nadelspitze und schälen Sie es vorsichtig vom Eigelb und der Zellmasse ab. Nachdem die Embryonen dekoriert wurden, verwenden Sie eine Glasmikrokapillarpipette, um bis zu 25 intakte Embryonen in einen immunhistochemischen Korb zu übertragen. Legen Sie den IHC-Korb in eine 24-Well-Platte.
Dann saugen Sie das Wasser aus jedem Brunnen ab. Resuspendieren Sie die Embryonen in 500 Mikroliter Blockierpuffer pro Vertiefung, wickeln Sie die Platte mit Paraform und Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 100 U/min.
Nach der Inkubation saugen Sie den blockierenden Puffer aus jeder Vertiefung ab. Ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter primäre Antikörperlösung. Denken Sie daran, eine Teilmenge von Vehikelkontrollembryonen mit dem blockierenden Puffer zu inkubieren, um Hintergrundgeräusche zu berücksichtigen.
Wickeln Sie die Platte und Paraform- und Aluminiumfolie neu ein und lassen Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung aus jeder Vertiefung entfernen und durch 1x PBST ersetzen. Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 1x PBST für fünf Minuten pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler.
Aus jedem Brunnen 1x PBST absaugen und den IHC-Korb in eine mit RO-Wasser gefüllte Glas-Petrischale geben. Unter einem Standard-Stereomikroskop sortieren Sie zufällig intakte Embryonen in eine 96-Well-Platte, um einen Embryo pro Welle zu gewährleisten. Dann entfernen Sie das gesamte RO-Wasser aus den einzelnen Brunnen und fügen Sie 200 Mikroliter 1x PBS hinzu.
Zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei einem G.Stellen Sie die Embryonen mit einem zweifachen Objektiv unter Durchlicht und FITC vor. Wählen Sie Autofokus, um sicherzustellen, dass sich der Fokus der Kamera auf der Unterseite der Platte befindet und um die Bodendicke versetzt ist. Wählen Sie eine FITC-Wellenlänge mit einer Belichtungsdauer von 100 Millisekunden und stellen Sie den Autofokus auf Laser mit Z-Offset ein.
Beobachten und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Bildaufnahme und mehrere Vertiefungen, bevor Sie mit der Plattenaufnahme beginnen. Nach der Bildaufnahme führen Sie eine Datenanalyse mit dem High-Content-Screening-System und einem benutzerdefinierten automatisierten Bildanalyseverfahren durch. Wählen Sie jeden Embryo auf der 96-Well-Platte aus, der auf Gesamtfläche und integrierte Intensität der Fluoreszenz analysiert werden soll.
Tabellieren Sie dann die Datenpunkte und exportieren Sie sie aus dem High-Content-Screening-System, indem Sie zum Messen gehen und offenes Datenprotokoll auswählen, um die Daten in eine Tabelle zu exportieren. Laden Sie die exportierte Tabelle in das Deployer-Paket hoch, um die Daten für jedes Bohrloch zu sortieren und zusammenzufassen und nach Bohrlochnummer zu filtern. Verwenden Sie dann das richtige Excel-Paket, um die zusammengefassten Daten in eine Tabelle zu exportieren.
Die Verteilung und die integrierte Intensität der 5-Methylcytosin-spezifischen Gesamtfläche wurden für Zebrafischembryonen sechs Stunden nach der Befruchtung bewertet. Die x-Achse zeigt die Exposition gegenüber DMSO als Fahrzeug oder TDCIPP als Positivkontrolle. Die Y-Achse bezeichnet die relative Fluoreszenz.
Die Schwellenwerte unterschieden sich signifikant von den mit Vehikeln behandelten Embryonen, wie die Gesamtfläche von 5-Methylcytosin zeigt, die in Embryonen nachgewiesen wurde, und die integrierte Intensität innerhalb desselben Bereichs, die ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis anzeigt. Es ist äußerst wichtig, die Integrität des Jochs und der Zellmasse für eine ordnungsgemäße IHC-Detektion zu erhalten. Diese Methode ist relativ unempfindlich und liefert nur relative Abundanz-RFU-Daten.
Wenn eine Quantifizierung erforderlich ist, kann ein gezielterer Ansatz verfolgt werden.
