Die Transduktion unreifer Thymozyten mit retroviralen Vektoren und die Kultivierung dieser Zellen auf OP9 DL4 Stromazellen ist eine anspruchsvolle Technik. Dieses detaillierte Protokoll spart den Forschern Zeit und Mühe und optimiert diese Systeme. Diese Technik bietet ein flexibles In-vitro-System zur Untersuchung der Auswirkungen genetischer Veränderungen auf unreife T-Zellen und kann für die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung und von Krebs nützlich sein.
Das Verfahren wird von Gisele Rodrigues, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn werden die Retrovirus-Produzentenzellen 18 bis 24 Stunden vor der Transfektion mit einer Konfluenz von 70 bis 90 % in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte mit zwei Millilitern Retrovirus-Produzentenzelle oder RPC-Medium ausgesät. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Um die Zellen zu transfizieren, ersetzen Sie das Medium eine Stunde vor der Transfektion durch frisches RPC-Medium. Stellen Sie Lipofektionsmischungen her, indem Sie vier Mikrogramm DNA, die zwei Mikrogramm Helferplasmid pCL-Eco und zwei Mikrogramm Transferplasmid pMIG enthält, in 250 Mikrolitern reduziertem Serummedium verdünnen und schonend mischen. Als nächstes werden 10 Mikroliter Transfektionsreagenz und 250 Mikroliter reduziertes Serummedium gemischt und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Kombinieren Sie nach fünf Minuten Inkubation die verdünnte DNA mit dem verdünnten Transfektionsreagenz. Vorsichtig mischen und 20 bis 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie die 500 Mikroliter der Mischung aus DNA und Transfektionsreagenz vorsichtig in die Vertiefung mit den Retrovirus-Produzentenzellen, indem Sie sie mit kreisenden Bewegungen auf die Zellen tropfen.
Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Platte hin und her schaukeln, und inkubieren Sie die Platte dann 16 bis 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Etwa 16 Stunden nach der Transfektion wird das alte Medium durch zwei Milliliter frisches RPC-Medium ersetzt und die Zellen 20 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Um die einzellige Thymozytensuspension herzustellen, legen Sie einen geernteten Thymus von euthanasierten Mäusen in fünf Milliliter PBS in eine Petrischale.
Platzieren Sie den Thymus mit sterilen Objektträgern zwischen den mattierten Oberflächen der Objektträger und reiben Sie die Objektträger vorsichtig aneinander, wobei Sie den Thymus zwischen den beiden Objektträgern rollen. Spülen Sie die Objektträger aus, um die Zellen zu sammeln, und entsorgen Sie das verbleibende Thymusstromagewebe. Filtern Sie fünf Milliliter der Thymussuspension durch einen 30- oder 40-Mikrometer-Siebfilter und zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300 G.
Nach dem Entfernen des Überstandes werden die roten Blutkörperchen lysiert, indem Sie eine Minute lang einen Milliliter eines ACK-Lysepuffers pro Röhrchen hinzufügen. Fügen Sie fünf Milliliter Zelldepletionspuffer hinzu, um den ACK-Lysepuffer zu deaktivieren, zentrifugieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 300 G und resuspendieren Sie sie zum Zählen in ein bis fünf Millilitern Zelldepletionspuffer. Nachdem Sie die Zellen gezählt und 10 Minuten lang bei 300 G zentrifugiert haben, resuspendieren Sie die Zellen einmal 10 bis zum siebten in 80 Mikroliter Zellerschöpfungspuffer.
Fügen Sie je 10 Mikroliter CD4- und CD8-Mikrokügelchen pro einmal 10 zu den siebten Zellen hinzu. Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln im Kühlschrank inkubieren. Bereiten Sie als Nächstes eine Verarmungssäule vor, indem Sie sie mit zwei Millilitern Erschöpfungspuffer spülen und den Durchfluss verwerfen.
Waschen Sie die inkubierten Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter Depletionspuffer pro ein mal 10 der sieben Zellen hinzufügen. 10 Minuten bei 300 g zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Tragen Sie dann die resuspendierte Zellsuspension auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss der unmarkierten Zellen.
Waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter Puffer und fangen Sie den Durchfluss auf. Bestimmen Sie die Kontrolle der Depletionseffizienz, indem Sie die 200 Mikroliter Zellen, die vor der Depletion gesammelt wurden, in vier FACS-Röhrchen aufteilen, ungefärbt, CD4 einfachgefärbt, CD8 einfach gefärbt und CD4 und CD8 doppelt gefärbt. Verwenden Sie die ungefärbten und einfach gefärbten Proben, um die Durchflusszytometrieparameter festzulegen.
Verwenden Sie die 1.000 Mikroliter Zellen, die nach der Erreicherung gesammelt wurden, um CD4 und CD8 zu färben, und vergleichen Sie sie mit der doppelt gefärbten Probe, die vor der Verarmung gesammelt wurde. Um die Thymozyten zu kultivieren, werden zwei bis fünf mal 10 bis fünf bis ein mal 10 bis sechste Thymozyten nach der Depletion in einen T25-Kolben mit 80 bis 90 % konfluenten OP9 DL4-Zellen in OP9-Medium gegeben, das Zytokine enthält. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden auf OP9 DL4-Zellen.
Um das Retrovirus zu ernten, sammeln Sie den Überstand mit den Retroviren aus den durchtrennten Zellen, indem Sie die Sechs-Well-Platte kippen und dann eine Drei- bis Fünf-Milliliter-Spritze am Boden der Platte positionieren, während Sie den Kolben ziehen, um den Überstand anzusaugen. Filtern Sie den Retrovirus-Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter frisches RPC-Medium und inkubieren Sie die Zellen für die zweite Transduktion 20 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Entnahme der Thymozyten aus der OP9 DL4-Kultur durch aggressives Pipettieren, um die Thymozyten und OP9 DL4-Zellen von der Kolbenoberfläche zu entfernen. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, um die meisten OP9 DL4-Zellen zu entfernen, und sammeln Sie das Filtrat in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Thymozyten und das Filtrat bei 300 G für fünf Minuten und verwerfen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie die Thymozyten in 0,5 bis einem Milliliter OP9-Medium mit Zytokinen. Fügen Sie ein bis zwei Milliliter RPC-Medium hinzu, das das Virus enthält. Fügen Sie dann Hexamethrinbromid mit acht Mikrogramm pro Milliliter Gesamtzellsuspension hinzu.
Spinokulieren Sie den Inhalt, indem Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 850 g zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in sechs Millilitern OP9-Medium mit Zytokinen pro Kolben und geben Sie die Suspension wieder auf die OP9 DL4-Zellmonoschicht. Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Wiederholen Sie die Schritte der Retrovirus-Ernte mit einer neuen Vertiefung des Retrovirus-haltigen Zellüberstands. Bewahren Sie die transduzierten Thymozyten zwei bis fünf Tage lang in OP9 DL4-Kultur auf oder frieren Sie sie nach Bedarf ein. Die Depletionseffizienz wurde flusszytometrisch bestimmt, indem die magnetisch-unmarkierte Zellfraktion für CD4 und CD8 nach immunmagnetischer Zelltrennung markiert und an einem zweidimensionalen bivarianten Punktdiagramm analysiert wurde.
Eine gute Ausbeute an doppelt negativen Zellen für CD4 und CD8 liegt bei 95% oder mehr, wie hier dargestellt. Bei der Verwendung von Vektoren, die screenbare Marker wie ein Fluoreszenzgen exprimieren, kann die Transsektion und Transduktion grob und empirisch mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden. Die Transduktionseffizienz wurde durch Ernte der Thymozyten aus der OP9 DL4 Monoschicht analysiert.
und die Expression eines Fluoreszenzgens mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen. Die Effizienz der Transduktion mit einem leeren retroviralen Vektor mit GFP als Reportergen betrug 84,2%-T-Zelldifferenzierung auf OP9 DL4-Zellen wurde vier Tage nach der Transduktion beobachtet. Durchflusszytometrische Analyse der Zelldifferenzierung, die durch die Co-Kultur auf OP9 DL4-Zellen und die Transgenexpression induziert wurde, wobei die Zellen für CD4, CD8, CD44 und CD 25 markiert wurden.
Die Transduktion von doppelt negativen Thymozyten mit dem leeren retroviralen Vektor pMIG zeigte ungefähr die gleichen Anteile von einfach positiv, doppelt positiv, doppelt negativ und seinen Unterstadien doppelt negativ eins bis vier wie die nicht transduzierten Thymozyten, was darauf hindeutet, dass die T-Zell-Entwicklung durch den Transduktionsprozess nicht beeinflusst wurde. Die schwierigste Aufgabe bei dem Versuch, dieses Protokoll zu replizieren, besteht darin, sicherzustellen, dass die verschiedenen Zelltypen gleichzeitig auf koordinierte Weise verwaltet werden. Eine Überexpression von Onkogenen in unreifen Thymozyten kann gelegentlich die normale T-Zell-Entwicklung beeinträchtigen, so dass die anschließende Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie ein hilfreicher Weg ist, um zu lernen, welche Richtung einzuschlagen ist.
Das onkogene Potential von transduzierten T-Zellen, die auf Zellen der fötalen Schicht differenziert sind, kann durch Injektion in immungeschwächte Mäuse weiter untersucht werden.
