This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium &#8220;Tolerage&#8221;, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-W&#252;rttemberg.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Regierungspräsidium Karlsruhe zugelassen. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) untergebracht ist. Für alle Kulturexperimenten Maus Jungtieren, die von 1 bis 7 Tage alt verwendet. 1. Isolierung von mTEZ aus Thymus HINWEIS: Die folgenden Schritte Verdauung wurden wie zuvor 1 unter sterilen Bedingungen mit einigen Modifikationen wie folgt beschrieben durchgeführt. <ol><li> Enthaupten die Maus Welpen und nehmen Sie den Thymus. Setzen Sie den Thymi auf Eis in einer Petri Platte mit RPMI 1640-Medium (enthaltend 5% FCS). </li><li> Schneiden Sie die Thymi in feine, kleine Stücke schneiden und in einem Rundrohr mit ~ 5-30 ml RPMI-Medium und sanft umrühren mit einem Magneten für 10 min bei RT. </li><li> Danach dekantiert die überstehende, die hauptsächlich Thymozyten und verdauen die verbleibende Gewebe nacheinander mit einer Runde collagenaSE-Typ IV (0,2 mg / ml und 57 U / ml Endkonzentration concentartion) für 15 min bei 37 ° C, gefolgt von Collagenase / Dispase (0,2 mg / ml und 1,2 U / ml Endkonzentration) für jeweils 25 min bei 37 &amp; deg; C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren bis zum Thymi vollständig verdaut. Verwenden Sie 1 ml Enzym pro zwei vor drei Thymi. </li><li> Man schüttelt das Gewebe einmal alle 7-10 min mit einer Pasteurpipette. Bündeln die Kollagenase / Dispase Fraktionen und durch ein 70 &amp; mgr; m Gaze. </li><li> Bereichern die mTEZ durch magnetische Zellsortierung (MACS). Führen die Reinigung von mTEZ durch magnetische Zellsortierung wie zuvor 11 beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt. HINWEIS: Bei Magnetsortierung mTEZ verwendeten wir die folgenden Antikörper: anti-CD80-PE (16-10A1, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) und Anti-EpCAM-bio (G8.8, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) 12. Unreifen und reifen mTEZ mit MACS wurden wie folgt definiert: CD45 - EpCAM + CD80 - und CD45 - CD80 + JEWEILIGENEly. </li><li> Nach Reinigung MACS (Reinheit von unreifen mTEZ = 83,1 ± 6,3% und reifen mTEZ = 79,23 ± 3,42%), die Samen mTEZ auf die organotypischen Kulturen, wie unten beschrieben (Abschnitt 2.3). </li><li> Alternativ Art mTEZ durch FACS (unter Verwendung von 100 &amp; mgr; m Düse) nach CD45 MACS Erschöpfung mit den folgenden Antikörpern: anti-CD45-PerCP (30-F11, Einsatz bei 1: 100 Verdünnung), Anti-Ly51-FITC (6C3, verwenden Sie bei 1 : 100-Verdünnung), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, Verwendung einer 1: 500 Verdünnung) und Anti-CD80-PE (16-10A1, Verwendung bei 1: 100 Verdünnung). Ausschließen toten Zellen mit Propidiumiodid (1: 5.000) (Tag 4). Unreifen und reifen mTEZ mit FACS wurden wie folgt definiert: - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - und PI - CD45 - Ly51 - PI EpCAM + CD80 + sind. </li></ol> 2. 3D Organotypische Co-Kulturen (OTCs) HINWEIS: Die 3D-Hautkonstrukte für organotypischen Kultivierung keratinocytes wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, 9,13. Bei allen Schritten wurden die Zellen bei 37 ° C inkubiert und 5% CO 2. Die OTCs Verwendung mTEZ wurden mit leichten Modifikationen, wie folgt hergestellt. <ol><li> Herstellung von menschlichen Fibroblasten HINWEIS: Die humanen Hautfibroblasten wurden aus Explantatkulturen von de-epidermised Dermis wie zuvor 9 beschrieben, erhalten. <ol><li> Kurz gesagt, geschnittenen Streifen der menschlichen Haut (~ 5 cm Länge) und behandle mit Thermo (0,5 mg / ml in Kochsalzlösung mit 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bei 4 ° C. </li><li> Danach trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette. </li><li> Fein in einer 10 cm Petrischale schneiden die Lederhaut in kleine Stücke, Ort und lassen Sie sie für 1-2 Stunden unter einem sterilen Luftstrom trocknen. Ergänzen die Explantate regelmäßig mit DMEM, das 20% FBS. </li><li> Teilen Sie die aus wachsenden Fibroblasten bei konfluenten (in der Regel etwa 3 Wochen) mit 0,1% Trypsin, sicherzustellen, dass die Explantate weiterhin auf die Platte für weitere con haftenaufeinander folgenden Runden der Auswuchs. </li><li> Erweitern Sie die Fibroblasten aus dem gleichen Explantate für bis zu 3-mal in DMEM mit 10% FBS und Kryo-bewahren 14. Verwenden Sie die gleiche Charge von Fibroblasten für jede Versuchsreihe. HINWEIS: Die Fibroblasten wurden nicht für den Aufbau der Hautäquivalente bestrahlt. </li></ol></li><li> Vorbereitung des Scaffold <ol><li> Schneiden Sie die 0,4-0,6 mm dicken Viskose, Vliesfasermaterial (Produktdetails bei der Unterstützung der Excel-Tabelle) in gut abgegrenzten Kreise mit einem scharfen 11 mm Durchmesser Metall Puncher genau in 12-Well-Filtereinsätze passen. Dann legen Sie sie in den 12-Well-Filtereinsatz (Polyester kapillare Porenmembran, 3 &amp; mgr; m Porengröße) als Gerüst. Setzen Sie den kompletten Filter-Setup in eine sterile 12-Well-Platte. </li><li> Vorbereiten des Fibringels Verwendung eines Fibrinkleber-Kit für die Chirurgie bestehend aus einer Kombination von Fibrinogen und Thrombin. Pre-Verdünnung des Fibrinogen- sowie die Thrombin-Komponente des Kits bis 8 mg / ml und 10Einheiten / ml. Für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte wie folgt vorgehen. <ol><li> 100 ul verdünnte Fibrinogen (8 mg / ml) mit 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+, pH 7,0. Verdünnter 100 ul Thrombin (10 Einheiten / ml) mit 100 ul FCS enthaltenden 270.000 Fibroblasten. </li><li> Verzichtet werden 200 ul Thrombin Fibroblasten enthaltende zell mischen auf das Stützgerüst, wozu 200 &amp; mgr; l Fibrinogen hinzuzufügen (1: 1-Mischung), was zu einer Endkonzentration von Fibrinogen von 2 mg / ml und Thrombin von 2,5 Einheiten / ml. Gut mischen und gleichmäßig zu verteilen über die gesamte Fläche des Gerüsts durch vorsichtiges Pipettieren (Tag 1). HINWEIS: Nach 30 Minuten bei 37 ° C ein Gerinnsel umschließt den Fibroblasten gebildet haben, Füllen vollständig die Innenräume des Gerüsts und eine glatte obere Oberfläche. </li></ol></li></ol></li><li> Co-Kultur mit mTEZ <ol><li> Für Vorkultur, Tauchen Sie das Organkulturen inDMEM mit 10% FBS, 50 &amp; mgr; g / ml L-Ascorbinsäure und 1 ng / ml TGF-β1 mit einem Mediumwechsel alle zwei Tage für 4-5 Tage. </li><li> Am Tag der Aussaat mTEC Ersetzen des Mediums durch RFAD Medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) mit 10% FBS, 10 -10 M Choleratoxin, 0,4 mg / ml Hydrocortison, 50 &amp; mgr; g / ml L-Ascorbinsäure, RANK-Ligand (0,1 ug / ml) und 500 Einheiten / ml Aprotinin, wodurch frühreifen Fibrinolyse von Serinproteasen durch Fibroblasten sezerniert. </li><li> 7-8 Stunden später, die Co-Kulturen Set-up durch Impfen 250.000 mTEZ (entweder komplett mTEZ oder CD80 lo und CD80 hallo Untergruppen) in einem Volumen von 100 ul pro Vertiefung auf der Oberseite des Fibroblasten-Gerüst. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Neubauer Kammer (Tag 4). HINWEIS: Zu allen Zeiten der Thymus 3D organotypischen Kulturen werden in den Medien im Gegensatz zu Haut OTCs, die Klima aufgehoben sind untergetaucht. </li><li> Nach 24 Stunden Inkubation, liefern die Kulturen mit Medium (insgesamt Trägeraustausch) wie oben (Schritt 2.3.2) genannte jetzt haltendeng reduzierten Mengen Aprotinin, 250 Einheiten / ml (Tag 5). </li><li> Um die proliferative Aktivität von mTEZ beurteilen, fügen EdU (6,7 &amp; mgr; M / ml, das heißt 10 &amp; mgr; / Vertiefung) zu OTCs für 4 Stunden vor der Beendigung der Kultur. Führen Sie die Färbung von OTC Kryo-Abschnitte, wie in der EdU Imaging Kit in Kombination mit Co-Färbung von Keratin 14 in zwei Abschnitte einer jeden Kultur Probe oder durch Strömungs beschrieben Bestimmen Sie die proliferative Indizes mTEZ, entweder durch Zählen der K14 + EdU + Zellen Durchflusszytometrie (EDU Durchflusszytometrie, Abschnitt 1.7, aber statt Ly51-FITC verwendet CDR1-PB 15 bei einer 1: 100 Verdünnung und 2.3.6.4). </li><li> Nach 4-7 Tagen der Co-Kultur, kündigen die OTCs und Verfahren zur RNA-Isolierung, Kryo-Schnitte oder FACS-Analyse (Tag 8-11). <ol><li> Beenden der Kulturen mit einer Pinzette, Abtrennen der Gerüst / dermales Äquivalent vom Filter des Bohrlochs Einfügen. </li><li> Für Kryo-Schnitte, betten die gesamte OTC in OCT-Verbindung und frieren in liquid Stickstoffdampf vor dem Kryo-Schnitte. Bereiten Sie 5-7 um dicke OTC Abschnitte mit einem Kryostaten und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Für Immuno-Histochemie von Kryo-geschnitten OTCs ein anti Keratin 14 (AF64, Verwendung einer 1: 1000 Verdünnung) und anti-Vimentin (GP53, die Verwendung einer 1: 100 Verdünnung) Antikörper. Führen Sie die indirekte Immunhistochemie Färbung mit entsprechenden Sekundärantikörper. </li><li> Für die RNA-Isolierung, 1 ml Denaturierungslösung (enthält Phenol und Guanidiniumthiocyanat) in einer Schraubkappe eines 2 ml RNase frei Rohr. Schneiden Sie die gesamte OTC in Stücke mit einem Skalpell und fügen Sie in das Röhrchen mit Denaturierungslösung. Mechanisch zerkleinern das OTCs mit FastPrep Instrument zweimal für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 6,0, legen Sie in zwischen auf Eis für 2 min (die Probe bei -80 ° C nach diesem Punkt gespeichert werden). Wenn bei -80 ° C eingefroren, aufgetaut auf Eis. Zentrifugieren der Rohre an 11,500-13,000 Upm 10 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen, Inkubation für 5 min bei RT und follow RNA Isolation Protokolle unter Verwendung von sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, wie vom Hersteller beschrieben. </li><li> Für die FACS-Analyse, entfernen Sie das Gerüst und trennen Sie die Membran aus dem Fibrin / Fibroblasten / mTEC Gel. Feinschnitt das Gel mit einem Skalpell und verdauen in einem FACS-Röhrchen für ~ 20 min oder bis vollständig mit 2 ml Collagenase / Dispase bei 37 ° C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren verdaut. Rühren der Enzymlösung mit einer Pasteurpipette einmal alle 5 min. Nach der vollständigen Verdauung, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 &amp; mgr; m-Filter; Flecken auf der Einzelzellsuspension mit den Antikörpern, wie in 1.7 beschrieben, und mittels Durchflusszytometrie analysiert. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self.">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li><li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+central+tolerance.">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li><li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells.">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li><li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens.">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li><li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture.">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li><li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts.">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li><li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanzielle oder kommerzielle Interessenkonflikt.

Neben RTOCs, haben die 3D-OTCs weit überlegen in Bezug auf die TEC Differenzierung und PGE Wartung / Induktion (Tabelle 1) im Vergleich zu anderen (i) &quot;vereinfachte 3D-Kulturen&quot; mit Hilfe gewesen - Fibroblasten allein, ohne das Gerüst; (Ii) 2D-Systeme mit - Fibroblasten / Feeder-Zellen co-kultiviert mit TECs 10, (iii) 3T3-J2-Zellen bei TEC Klone zu entwickeln, aber pGE verloren geht, (iv) Matrigel oder (v) ECM-Komponenten (unveröffentlichte Daten). PGE wurde für bis zu 7 Tage in...

Entwicklung von Thymozyten machen etwa 98% des Thymus, die restlichen 2% bestehen aus einer Vielzahl von Zellen, die zusammen bilden den Thymus-Stroma (dh Epithelzellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen). Die äußeren kortikalen Epithelzellen (CTEC) beschaffen Einwanderung von Pro-T-Zellen aus dem Knochenmark, T-Zell-Linie Induktion in multi pre-T-Zellen und positive Selektion von selbst MHC beschränkt unreifen Thymozyten. Die inneren Mark Thymusepithelzellen (mTEZ) in Toleranzinduktion dieser Thymozyten mit einer hochaffinen TCR Selbst Peptid / MHC-Komplexen durch entweder induzierende negative Selektion oder deren Abweichung in den regulatorischen T-Zelllinie beteiligt. Im Zusammenhang mit der zentralen Toleranzinduktion sind mTEZ, daß sie ein breites Spektrum von gewebe beschränkt Selbst-Antigene (TAA), die so Spiegeln des peripheren selbst exprimieren einzigartig. Dieses Phänomen wird als Promiscuous Genexpression (pGE)1,2. Die meisten aktuellen Studien zu diesem faszinierenden Zelltyp verlassen sich auf ex vivo isolierten Zellen, wie verschiedene kurzfristige 2D-Kultursystemen unweigerlich zum Verlust von PGE und Schlüsselregulator Moleküle wie MHC-Klasse II, FOXN1 und Aire in den ersten 2 Tagen 3-6 geführt . Es blieb jedoch unklar, welche bestimmte Komponenten und Funktionen des intakten 3D Geflecht des Thymus in 2D-Modelle fehlt. Die Reaggregation Thymus-Organkultur (RTOC) bisher das einzige 3D-System, das die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung ermöglicht, einerseits und stromal cell biology, auf der anderen Seite war, in einer intakten Thymus Mikro 7. Dennoch haben RTOCs bestimmte Beschränkungen, das heißt sie enthalten bereits eine komplexe Mischung von Zellen, erfordern die Eingabe von fötalen Stromazellen und ertragen einer maximalen Kultivierungsdauer von 5 bis 10 Tagen. Der Mangel an reduktionistischen in vitro Kultursystemen hat das Studium behindertmehrere Aspekte der T-Zell-Entwicklung und Thymus Organogenese nicht zuletzt die molekulare Regulation von PGE und seiner Beziehung zu der Entwicklungsbiologie mTEZ. Durch die enge Bezogenheit der strukturierten Organisation der Epithelzellen der Haut und der Thymus, entschieden wir uns für ein 3D organotypische Kultur (OTC) System, das ursprünglich entwickelt worden war, um die Differenzierung von Keratinozyten in vitro nachzuahmen und so eine dermale Äquivalent. Die OTC-System besteht aus einem inerten Gerüstmatrix mit dermalen Fibroblasten, die in einem Fibrin-Gel, auf die Keratinozyten ausgesät 8,9 gefangen sind überlagert. Hier ersetzt wir Keratinozyten mit gereinigtem mTEZ. Und dabei die grundlegenden Merkmale dieses Modells optimierten wir bestimmte Parameter. In der angenommenen OTC Modell mTEZ vermehrt unterzog terminalen Differenzierung und gepflegt mTEC Identität und PGE, somit eng in vivo mTEZ Entwicklung nachahmt <sup&gt; 10 ist. Dieses Datenblatt ein detailliertes Protokoll, das die schrittweise Einrichtung von Thymus OTCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River WIGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Microbeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)</td>
			<td>Ref. 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80-PE antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PerCP antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly51-FITC antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDR1-Pacific Blue</td>
			<td>Ref. 15</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>106-546-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">C10339</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">C10425</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well filter inserts (thincerts)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jettex 2005/45</td>
			<td>ORSA, Giorla Minore, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47302.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-049&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Gold</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin (Trasylol)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>4032037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>G117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Seromed (Biochrom)</td>
			<td>K3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#223;1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>462-TR-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;T-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>TissueTek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep FP120</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV&#160;</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS004189</td>
			<td>0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrale Protease (Dispase)</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS002104</td>
			<td>0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 284 932 001</td>
			<td>25 &#181;g/ml final conc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression

Intra-Thymus-T-Zell-Entwicklung erfordert ein kompliziertes dreidimensionales Maschenwerk aus verschiedenen Stromazellen, dh Nicht-T-Zellen. Thymocyten durchqueren dieses Gerüst in einem hoch koordinierten zeitliche und räumliche Ordnung, während sequentiell vorbei obligatorischen Kontrollpunkte, dh T-Zelllinie Engagement, gefolgt von T-Zell-Rezeptor-Repertoire und Auswahl vor der Ausfuhr in die Peripherie. Die beiden wichtigsten ansässigen Zelltypen bilden dieses Gerüst sind kortikalen (CTEC) und Mark Thymusepithelzellen (mTEZ). Ein Schlüsselmerkmal der mTEZ ist die sogenannte Promiscuous Expression zahlreicher gewebe beschränkten Antigenen. Diese gewebe beschränkten Antigenen präsentiert werden, um Thymozyten direkt oder indirekt durch unreife mTEZ oder Thymus-dendritische Zellen, die jeweils resultierenden Selbsttoleranz. Geeignete in vitro Modelle emuliert die Entwicklungswege und Funktionen der CTEC und mTEZ liegen noch lacKönig. Dieser Mangel an angemessenen experimentellen Modellen hat zum Beispiel beeinträchtigt die Analyse der Promiscuous Genexpression, die immer noch schlecht auf zellulärer und molekularer Ebene verstanden wird. Wir angepasst 3D organotypischen Co-Kultur-Modell zur Kultur ex vivo isolierten mTEZ. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um Keratinozyten derart zu kultivieren, um eine Hautäquivalents in vitro zu erzeugen. Das 3D-Modell beibehalten wichtigsten Funktionsmerkmale mTEC Biologie: (i) die Proliferation und terminale Differenzierung von CD80 lo, Aire-negative in CD80 hallo, Aire-positive mTEZ, (ii) Reaktionsfähigkeit auf RANKL, und (iii) nachhaltige Ausdruck FOXN1, Aire und gewebe eingeschränkt Gene in CD80 hallo mTEZ.

Wir nahm eine 3D organotypischen Co-Kultur-Modell (3D OTC), die ursprünglich für die in-vitro-Langzeitkultur von Keratinozyten 9 entwickelt hatte. MACS-angereicherten mTEZ (siehe MACS Anreicherung Schema Abbildung 1) wurden auf ein Gerüst aus einer Fibrin-Gel und eingeschlossene Fibroblasten ausgesät. Die Fibroblasten stellen die wesentlichen extrazellulären Matrix (ECM), welche mTEZ in vitro. MTEZ wurden in OTCs für 4-14 Tage in Gegenwart von RANKL in Submerskulturen ...

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Aufrufe.  German Cancer Research Center (DKFZ). Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression. 

Serie: 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to tissue and cell-type specific regulation of gene expression during the cellular differentiation. Thus, their identification and further investigation is important in order to understand how cell fate is determined. Integration of gene expression data (e.g., microarray or RNA-seq) and results of chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based genome-wide studies (ChIP-seq) allows large-scale identification of these regulatory regions. However, functional validation of cell-type specific enhancers requires further in vitro and in vivo experimental procedures. Here we describe how active enhancers can be identified and validated experimentally. This protocol provides a step-by-step workflow that includes: 1) identification of regulatory regions by ChIP-seq data analysis, 2) cloning and experimental validation of putative regulatory potential of the identified genomic sequences in a reporter assay, and 3) determination of enhancer activity in vivo by measuring enhancer RNA transcript level. The presented protocol is detailed enough to help anyone to set up this workflow in the lab. Importantly, the protocol can be easily adapted to and used in any cellular model system.

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended effects that extrinsic patterning factors might introduce into human pluripotent stem cell (hPSC) models of brain development or pathophysiology, such as masking disease phenotype. Here, we present two cerebellar differentiation protocols for hPSCs, designed with simpler startup method, fewer patterning factors, and less material requirements than previous protocols. Recently, we developed culture procedures, which generate free-floating 3-dimensional (3D) products consistent with other brain &#34;organoid&#34; protocols, including morphologies relevant to modeling brain development such as sub/ventricular zone- and rhombic lip-like structures. The second uses an adherent, 2D monolayer procedure to complete differentiation, which is shown capable of generating functional cerebellar neurons, as products are positive for cerebellar-associated markers, and exhibit neuron-like calcium influxes. Together, these protocols offer scientists a choice of options suited to different research purposes, as well as a basic model for testing other types of streamlined neural differentiations.

We describe a simplified 3D differentiation protocol for hPSCs, using defined medium and reduced growth factors, capable of generating cell aggregates with early neuroepithelial structures and positive for cerebellar-associated markers, as well as an optional 2D modification for differentiating cells as a monolayer to generate functional neurons.

Optimierte 3D zerebelläre Differenzierung Protokoll mit Optional 2D Modifikation

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of hematological pathologies. Despite the most relevant data that can be acquired using in vivo models or primary cultures, the low abundance of hematopoietic stem and progenitor cells considerably restricts the pool of suitable techniques for their investigation. Therefore, the use of cell lines allows sufficient production of biological material for the performance of screenings or assays that require large cell numbers. Here we present a detailed description, readout, and interpretation of proliferation and differentiation assays which are used for the investigation of processes involved in myelopoiesis and neutrophilic differentiation. These experiments employ the 32D/G-CSF-R cytokine dependent murine myeloid cell line, which possesses the ability to proliferate in the presence of IL-3 and differentiate in G-CSF. We provide optimized protocols for handling 32D/G-CSF-R cells and discuss major pitfalls and drawbacks that might compromise the described assays and expected results. Additionally, this article contains protocols for lentiviral and retroviral production, titration, and transduction of 32D/G-CSF-R cells. We demonstrate that genetic manipulation of these cells can be employed to successfully perform functional and molecular studies, which can complement results obtained with primary hematopoietic stem and progenitor cells or in vivo models.

Here detailed protocols for culturing the murine myeloid precursor 32D/G-CSF-R cell line, performing viral infections, and carrying out proliferation and differentiation assays are presented. This cell line is suitable for studying myeloid cell development, and the role of genes of interest in myeloid cell growth and neutrophilic differentiation.

Proliferation und Differenzierung der murinen Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Zellen

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...