Eine objektive Labormethode, die hier vorgestellt wird, könnte helfen, die Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion bei Mäusen zu untersuchen, die eine allergische Kontaktdermatitis beim Menschen nachahmt. Die Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion kann nicht nur durch Ohrödeme gemessen werden, sondern auch durch verschiedene Labortests, die es ermöglichen, zelluläre Mechanismen zu untersuchen, die an dieser Reaktion beteiligt sind. Das stärker kontaktbehaftete Hypersensitivitätsmodell kann verschiedene Umweltfaktoren und neue Substanzen testen, um zu zeigen, ob getestete Faktoren T-Zell-abhängige Immunantworten modulieren, was zur Implementierung neuer Therapien verwendet werden kann.
Beginnen Sie damit, die Maushaut mit einer Rasierklinge zu rasieren und die Pfote zu beschriften. Sechs Stunden vor der Induktion der Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) tragen Sie graue Seife mit Wasser auf und rasieren Sie einen zwei Zentimeter großen Bereich auf Brust und Bauch der Maus. Am selben Tag sensibilisieren Sie die Mäuse, indem Sie 150 Mikroliter frisch zubereitetes 5%hapten auf die zuvor rasierte Stelle auftragen.
Wenden Sie in der Steuermaus nur das Fahrzeug an. Trocknen Sie die haptene Stelle 30 Sekunden lang, bevor Sie das Tier wieder in den Käfig setzen. Messen Sie am vierten Tag die Ohrdicke einer anästhesierten Maus mit einem Mikrometer zur Stunde Null von einem Beobachter, der die Versuchsgruppen nicht kennt.
Tragen Sie dann in Test- und Kontrollgruppen 10 Mikroliter frisch zubereitetes 04%hapten auf beide Seiten der Ohren auf und lassen Sie es 30 Sekunden trocknen. Wiederholen Sie am fünften Tag, 24 Stunden nach der vorherigen Anwendung von 0,4 % die Messung der Ohrdicke für die 24-Stunden-Messung. 24 Stunden nach der Ohrdickenmessung, wenn sich die Maus noch in tiefer Narkose befindet, schneiden Sie die Ohren mit einer Schere so nah wie möglich am Schädel ab.
Machen Sie an der distalen Seite der Ohren mit einer Biopsiestanze einen Stanzer mit einem Durchmesser von sechs Millimetern. Messen Sie das Gewicht jeder Ohrbiopsie auf der Analysenwaage und drücken Sie es in Milligramm aus. Für den Myeloperoxidase- oder MPO-Assay werden die Ohrbiopsien in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Edelstahlperlen gegeben und 500 Mikroliter des vorbereiteten Puffers hinzugefügt.
Homogenisieren Sie die Biopsien für 10 Minuten in einem Homogenisator und kühlen Sie die Probe dann 15 Minuten bei 4 Grad Celsius ab, bevor Sie sie erneut für 10 Minuten homogenisieren. Nehmen Sie die Kügelchen heraus, sobald die Biopsien homogenisiert sind. Die Homogenate 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius einfrieren.
Tauen Sie die Proben auf, wirbeln Sie sie auf und wiederholen Sie den Homogenisierungs- und Gefriervorgang dreimal. Sobald Sie fertig sind, zentrifugieren Sie das Homogenat bei 3.000 G für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius. Ernten Sie den Überstand mit einer Pipette, um die MPO-Aktivität zu messen, und drücken Sie sie in Einheiten pro einem Milligramm Protein aus.
Um einen Gefäßpermeabilitätstest durchzuführen, sensibilisieren Sie die Mäuse am Nulltag und am vierten Tag direkt durch Auftragen von Hapten auf die Ohren mit dem zuvor erwähnten Verfahren. 23 Stunden später injizieren Sie der anästhesierten Maus intravenös 8,3 Mikroliter pro Gramm Körpergewicht von 1 % Evans-Blaufarbstoff in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Nach einer Stunde wird die Maus erneut betäubt, um die Ohrbiopsien zu entnehmen, wie zuvor beschrieben.
Um den Farbstoff aus dem Gewebe zu extrahieren, werden die Biopsien in den Röhrchen mit einem Milliliter Formamid bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid für 18 Stunden inkubiert. Nach der Entnahme von Ohrbiopsien, wenn die Maus noch unter tiefer Narkose steht, entfernen Sie den Augapfel mit einer Pinzette. Üben Sie sanften Druck auf die Maus aus und sammeln Sie Blut aus dem Sinus retroorbitalis in den Röhrchen, um das Serum zu entnehmen.
Drehen Sie den Schlauch sechsmal um und warten Sie 30 Minuten, bis das Blut geronnen ist. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.300 bis 2.000 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Sensibilisieren Sie die Spendermäuse mit TNCB-Hapten am Tag Null mit dem zuvor erwähnten Verfahren Am vierten Tag, nach der Desinfektion der Haut, isolieren Sie die axillären und inguinalen Lymphknoten (ALNs) mit einer Pinzette aus der anästhesierten Maus und isolieren anschließend die Milz.
Zerdrücken Sie das Gewebe zwischen den mattierten Enden zweier Objektträger und führen Sie die Zellsuspension durch ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 Mikrometern. Waschen Sie dann die Zellen mit DPBS, das mit 1 % fötalem Kälberserum ergänzt ist, und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das verbleibende Zellpellet in ein bis fünf Milliliter DPBS.
Bereiten Sie ein 1:1-Gemisch aus ALNs und Milz vor, um eine Konzentration von bis zu 7,0 mal 10 bis siebten Zellen in 200 Mikrolitern DBPS zu erreichen, bevor das Gemisch aus CHS-Effektorzellen intravenös in eine anästhesierte Maus injiziert wird. Messen Sie die Dicke der Ohren zur Stunde Null und nach 24 Stunden der Challenge. Die Daten zeigten, dass Mäuse, die auf TNCB sensibilisiert waren und vier Tage später in den Ohren herausgefordert wurden, im Vergleich zu scheinsensibilisierten und dann ähnlich herausgeforderten Kontrollmäusen eine signifikant erhöhte Ohrschwellung entwickelten.
Die Zunahme des Ohrödems in der Testgruppe führte zu einem erhöhten Ohrgewicht, einer erhöhten MPO-Aktivität, einer Interferon-gamma-Konzentration in den Ohrextrakten, ödematösen Dermisveränderungen in der histologischen Untersuchung und einer ohrförmigen Gefäßpermeabilität. Die TNP-spezifischen IgG1-Antikörper waren in den Seren der Versuchsmäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren erhöht. Die Tiere, die die CHS-Effektorzellen von Spendern erhielten, die zuvor mit TNCB sensibilisiert worden waren, zeigten im Vergleich zu Tieren, die die Zellen nicht erhalten hatten, eine signifikant erhöhte Ohrschwellung. Der kritischste Moment ist das Auslösen einer Kontaktüberempfindlichkeit.
Die Haptenlösung ist sehr flüchtig und lichtempfindlich, daher muss sie schnell auf die Haut der Tiere aufgetragen werden. An den isolierten Effektorzellen können zusätzliche Tests durchgeführt werden. Zum Beispiel können Zellkulturen etabliert werden, um die Fähigkeit zur Proliferation in Gegenwart von Antigenen zu beurteilen.
