Die Autoren bedanken sich bei Amanda Tardo, Dr. Mostafa Bouljihad, Stephanie Feely, Carol Coyne, Dr. Erin Ribka, Dr. Pete Didier und Dorothy Kuebler für ihre technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01-DK076653 und 3R01-DK076653-02S1 zu KS und die Basis Betriebskostenzuschuss der TNPRC RR000164 unterstützt.

1. Hautbiopsie Probenentnahme <ol><li> Vor Hautbiopsie Verfahren, betäuben Tieren intramuskulär mit 2,5 mg / kg Tiletamin angewendet Hydrochlorid und Zolazepam Hydrochlorid telazol Mischung (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Überwachen Sie die Tiere aus der Anästhesie bis zum Liegen und entfernen Sie dann aus ihrem Gehege. </li><li> Entfernen Sie die Haare aus der Haut Gebiet von Interesse unter Verwendung eines Oster Golden A5 Single Speed ​​Veterinary Clipper mit einer Größe 40 Klinge (Oster Professional Products, McMinnville, TN) und aseptisch mit wechselnden betadine Peeling und Alkohol vorzubereiten. Sichern Sie sich eine sterile gefenstert Tuch über den ausgewählten Biopsiestelle. </li><li> Mit einer sterilen Technik, statt einer 4,0 mm Miltex Punsch Dermal Biopsie-Instrument (Miltex, York, PA) gegen die Haut beim Drehen des Geräts um 180 Grad im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn mit leichtem Druck bis zum Biopsiestanze Transekte durch die Hautschichten in das subkutane tissue. Entfernen Sie die Biopsie-Probe und fassen Sie die durchtrennten Teil der Haut mit einer Pinzette und frei aus dem subkutanen Gewebe. </li><li> Schließen Sie die Hautdefekt mit 3-0 Nylonfaden an einem 3 / 8 Kreis schneidende Nadel (Ethilon, Ethicon, Johnson &amp; Johnson Medical Limited, Berkshire, UK) in einer Kreuzband-Muster. Gib alle Tiere 0,01 mg / kg Buprenorphin-Hydrochlorid (Hospira, Lake Forest, IL) intramuskulär für postoperative Analgesie. </li></ol> 2. Aufbereitung der Probe <ol><li> Die Arbeit mit der Haut Biopsie-Proben von chronischen Dermatitis und gesunden Kontrollpersonen Rhesusaffen. Erhalten zwei vor drei (4 mm im Durchmesser) Biopsie-Proben von jedem Tier. </li><li> Fix erste Probe in Zink Formalin (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) für 24 Stunden in Wasser waschen für 30 min, waschen kurz in 70% Ethanol, und platzieren Sie in ASP300 Leica Gewebe-Prozessor (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS), bei der Gewebe entwässert mit aufsteigenden Klassen von 70%, 80%, 95% und 100% Ethanol 48min jeweils (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), gefolgt von zwei Änderungen Xylol (Fisher) gefolgt. </li><li> Embed in Paraffin Medien (Fisher) für die langfristige Lagerung bei Raumtemperatur. Legen Sie bei -20 ° C für 20 min vor dem Schneiden. Bereiten Sie 6 um Abschnitte mit einem Rotationsmikrotom (HM325, Microm International, Waldorf, Deutschland). Legen Sie Bereiche auf geladene Objektträger (Fisher) und an der Luft trocknen bei 60 ° C über Nacht. Stain mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Standard-Methode (siehe unten). </li><li> Fix zweite Probe in 2% Paraformaldehyd (USB Corp, Cleveland, OH) für 30 min bei Raumtemperatur, waschen dreimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), in 30% Saccharose (Fisher) für 4 Stunden, und betten in OCT Einfriermedium (Sakura Finetek, Torrence, CA). Keep at-80oC für 20 min vor dem Schneiden. Bereiten 15 um Abschnitte mit dem Kryostaten (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). </li></ol> 3. H &amp; E Färbung <ol><li> Entparaffinieren einbettended Schnitte durch drei Änderungen der Xylole (Fisher) und rehydrieren durch abgestufte ethanole: drei Änderungen von 100%, zwei Änderungen von 95%, eine Veränderung von 80% und destilliertes Wasser, 2 min je. </li><li> Stain mit Hämatoxylin (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) für eine Minute und folgen Sie durch einen kurzen waschen in fließendem Leitungswasser. </li><li> Gegenfärbung mit Eosin (Sigma) für 6 min. </li><li> Entwässern gefärbten Geweben bis 95% und absolutem Ethanol, zwei Änderungen von je 2 min und deaktivieren Sie dann in drei Änderungen der Xylole, jeweils 3 min. </li><li> Berg Deckglas mit Cytoseal Eindeckmedium (Richard-Allan Scientific) über die H &amp; E-gefärbten Gewebeschnitten. </li></ol> 4. Histopathologische Beurteilung Überprüfen Sie H &amp; E-gefärbten Biopsie Haut Abschnitte unter einem Lichtmikroskop mit den 4 - 40-facher Vergrößerung und Leica-Mikroskop mit einem SPOT Insight Digitalkamera (Digital Instruments Inc., Michigan, USA). 5. Immunfluoreszenz staiPlanung <ol><li> Arbeiten Sie mit OCT-embedded Haut Abschnitte für Immunfluoreszenzfärbung. Vor dem Färben, für 20 min in PBS mit 0,2% Fischhaut Gelatine (FSG, Sigma) mit 0,1% Triton X-100 (Sigma) für die ÜLG zu entfernen und das Gewebe permeabilisieren einweichen. </li><li> Nach dem Waschen der Objektträger mit 10% normalem Ziegenserum (NGS, Sigma), in PBS-FSG für 1 Stunde verdünnt, bei Raumtemperatur inkubieren, in einem befeuchteten Objektträger Kammer. </li><li> Um die Ablagerung von IgA und tTG2 Antikörper sichtbar zu machen, inkubieren Folien mit Anti-Rhesus-IgA und tTG2 Primärantikörper, in 10% NGS-PBS-FSG für 1 Stunde verdünnt. </li><li> Waschen mit PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) für 10 min, von PBS-FSG für 10 min. </li><li> Inkubieren mit sekundären, Isotyp-spezifischen Antikörper mit Alexa Fluor Fluorochrom 488 (grün), 568 (rot) oder 633 (blau) (Molecular Probes-Invitrogen) bei 1:1000 Verdünnung getaggt. Verwenden Sie die TOPRO-3 Farbstoff auf die Kern-DNA sichtbar zu machen. Verwenden Sie die 10% NGS-PBS-FSG als Antikörperverdünnung. </li><li> Verwenden Sie die Anti-Abschrecken Lösung (Sigma), um den gefärbten Gewebeschnitten zu montieren. </li></ol> 6. Konfokale Bildgebung Führen Sie die Belichtung mit einer Leica TCS SP2 Wahre konfokale Laser Scanning Mikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland) mit drei Lasern (sechs Zeilen für die Anregung zur Verfügung) ausgestattet: einem Argon-Krypton-Laser bei 488 nm (grün), einer Krypton-Laser bei 568 nm ( rot) und einem Helium-Neon-Laser bei 633 nm (blau), die von den sichtbaren bis in den Fernen-roten Seite des Spektrums erstrecken. Rekord Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder für die Bewertung von nicht-markierten Gewebe-Architektur. 7. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für positive Anerkennung der ETG von beiden tTG2 und IgA-Antikörper ist in Abb. dargestellt. 3A. In Übereinstimmung mit Situation in menschlichen Patienten und wegen der viel geringeren Prävalenz von DH-ähnliche Dermatitis als CD-like Glutenempfindlichkeit auch in Rhesusaffen, sind die meisten der Haut Biopsie-Proben, um sho erwartetw die positive Reaktion mit Antikörpern tTG2 aber ohne die Anwesenheit von tTG2 + IgA + Doppel-positiven Zellen (Abb. 4). Diese DH-unabhängigen Fällen, einschließlich Dermatitis Fällen mikrobiellen Ursprungs, wird zeigen, einige Einzel-positive IgA + Zellen unter dem Epithel verstreut, aber nicht spektrale Überlappung zwischen den tTG2 und IgA-markierten Marker (Abb. 3B und 4). Daher ist es wichtig, die Reihenfolge der vorgeschlagenen Prüfverfahren zu erhalten, beginnend mit der klinischen Untersuchung (Abb. 1), von histopathologischen Auswertung (Abb. 2) und nur dann, wenn keine andere, häufiger Dermatitis erregenden Stoffe identifiziert werden können, konfokale gefolgt mikroskopische Untersuchung von Hautbiopsien für tTG2 und IgA gebeizt gerechtfertigt ist. Klinische und / oder histopathologischen Auswertungen alleine sind nicht ausreichend für eine positive Diagnose dieser Erkrankung. In jenen Fällen, in denen doppelt positiven (tTG2 + IgA +)-Zellen in der Gegend von dermalen Papillen sind identifiziert, DH-ähnliche Dermatitis Diagnose ausgegeben werden können. In solchen Fällen, Entzug von Nahrung Glutenund Verwaltung von glutenfreien Diät wird empfohlen, um die Dermatitis Symptome zu lindern. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Inguinalgegend der EM96 Makaken vor (A) und nach (B) Entzug der Nahrung Gluten für 5 Wochen. Die Wiedereinführung der Nahrung Gluten fiel mit dem Wiedererscheinen der Dermatitis (C). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. HE-Färbung der EM96 Makaken Hautbiopsien gesammelt vor (A) und nach (B) Entzug der Nahrung Gluten für 9 Wochen. A: Das Epithel ist verdickt (7-15 Lagen von Epithelzellen) mit einer dicken Kruste von oberflächlichen hyperkeratotic Zellen infiltriert mit degenerierenden Neutrophilen. Neutrophile erscheinen auch im Inneren des Epithels und sind mit moderaten Anzahl von Lymphozyten, Plasmazellen und Histiozyten um die Adnexe in der oberen Dermis gemischt. B: Einige hyperkeratosis noch vorhanden ist, ist Epitheldicke normalisiert (4-7 Schichten) mit minimalem lymphoplasmazelluläre Infiltration in der oberen Dermis. C: Normal Bauchhaut von FR56 Makaken, ohne lymphoplasmazelluläre Infiltration, wird für den Vergleich einbezogen. Vergrößerung 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Konfokale Mikroskopie Bilder EM96 Makaken Hautbiopsien gesammelt vor (A) und nach (B) Entzug der Nahrung Gluten für 9 Wochen. A: IgA-Färbung (grün), tTG2 (rot) und Topro-3 Kern-DNA-Marker (blau). Co-Lokalisation von IgA und tTG2 erscheint in Gelb um den Bereich der dermalen papilae. B: Hautprobe nach 9 Wochen entnommen glutenfreie Ernährung zeigt keine IgA im Epithel, während einige subepitheliale IgA noch vorhanden ist (grün), tTG2 (rot) und Topro-3 Kern-DNA-Marker (blau). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. </strong&gt; Die konfokale Mikroskopie Bilder von GI24 Rhesusaffen Hautbiopsien gesammelt, während Tier war ausstellenden die Symptome der chronischen (DH-unabhängigen) Dermatitis. Die IgA-Färbung ist in grün, tTG2 in rot und Topro-3 Kern-DNA-Marker in blau. Die tTG2 +-Zellen vorhanden sind, in das Epithel, wenig IgA + Zellen unter dem Epithel, während keine umfassende spektrale Überlappung zwischen den roten und grünen Markierungen zu sehen ist. <table border="1"><tbody><tr><td> Tierische Tag </td><td> Sex [M / F] </td><td> Alter [Jahre] </td><td> Klinische Symptome </td><td> Plasma tTG2 Antikörper </td><td> Diät [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1,3 </td><td> Gesund </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1,4 </td><td> Gesunde, gelegentlich Durchfall </td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5,4 </td><td> Chronische idiopathische Durchfall </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5,0 </td><td> Chronische Dermatitis </td><td> + / - (Grenzwertig) </td><td> 1 und 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4,6 </td><td> Chronische Dermatitis </td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. TNPRC Rhesusaffen für die Sammlung von Hautbiopsien verwendet * Diät 1 - regelmäßige Affen chow (Gluten-haltigen); Diet 2 - glutenfreie Ernährung

<ol>
	<li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+the+adaptive,+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients.">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li><li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+epidemiology,+pathogenesis,+diagnosis,+and+nutritional+management.">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li><li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+transglutaminase+(TGase+3)+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis.">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li><li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet.">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li><li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques.">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li><li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+&#x03B1;-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques.">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from &#x03B1;-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li><li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+from+pathogenesis+to+novel+therapies.">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li><li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response.">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li><li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis.">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unsere neu gegründete nicht-menschlichen Primaten Modell der Glutenunverträglichkeit eingesetzt wurde, um die intestinale Permeabilität Veränderungen durch diätetische glutenfreie 5,6 ausgelöst zu studieren. Plasma tTG2 Antikörper sowie Darm tTG2 + IgA + Einlagen wurden in einigen gluten-sensitive Makaken entdeckt. Da wir selten Fälle von idiopathischer Dermatitis vor kurzem in Kolonie identifiziert Rhesusaffen, bei denen keine übliche (infektiöse / Stoffwechsel) Ätiologie festgestellt werden konnt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer / Product Code </td><td> Note </td></tr><tr><td> Anti-Human IgA-FITC * </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> F-5259 </td><td> 1:100 Gebrauchsverdünnung </td></tr><tr><td> Anti-Human tTG2 </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> MS-300-P1ABX </td><td> 1:100 Gebrauchsverdünnung </td></tr><tr><td> Anti-Mouse IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> A-21124 </td><td> 1:1000 Gebrauchsverdünnung </td></tr><tr><td> TOPRO-3-DNA-Sonde *** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> T-3605 </td><td> 1:1000 Gebrauchsverdünnung </td></tr><tr><td> Zink Formalin (Z-fix) </td><td> Anatech Ltd, Battle Creek, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Oktober Freezing Medium </td><td> Sakura Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal Montage Medium </td><td> Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Quenching Lösung </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (Nylonfaden) </td><td> Ethicon, Johnson &amp; Johnson, Berkshire, UK </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Punsch Dermal Biopsieinstruments </td><td> Miltex, York, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Oster Golden A5 Single Speed ​​Vet Clipper mit einer Größe 40 Blatt </td><td> Oster Produkte, McMinnville, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Tissue Processor </td><td> Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> Rotationsmikrotom </td><td> Microm International, Waldorf, Deutschland </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica, Wetzlar, Deutschland </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * Fluoresceinisothiocyanat ** Secondary (Alexa Fluor 568-konjugiert) Antikörper nach tTG2 Primärantikörper verwendet ** Dye

recognition of epidermal transglutaminase by iga and tissue transglutaminase 2 antibodies in a rare case of rhesus dermatitis

Tissue Transglutaminase 2 (tTG2) ist ein Verdauungsenzym im Darm, die bereits teilweise verdaute Nahrung Gluten zB Gliadinpeptide deamidates. In genetisch vorbelasteten Personen, löst tTG2 autoimmune Reaktionen, die durch die Produktion von tTG2 Antikörpern und deren direkte Ablagerung in kleine Darmwand 1,2 gekennzeichnet sind. Das Vorhandensein solcher Antikörper ist eine der wichtigsten Kennzeichen der Zöliakie (CD). Epidermal Transglutaminase (ETG) ist ein weiteres Mitglied der Transglutaminase-Familie, die auch als Autoantigen in einer kleinen Minderheit von Patienten CD funktionieren kann. In dieser relativ seltenen Fällen löst ETG eine Autoimmunreaktion (Hautausschlag) klinisch als Dermatitis herpetiformis (DH) bekannt. Obwohl der genaue Mechanismus der CD und DH Pathogenese ist nicht gut verstanden, es ist bekannt, dass tTG2 und ETG Aktien antigene Epitope, die durch Serum-Antikörper von CD-und DH-Patienten 3,4 erkannt werden können. (Macaca mulatta) mit Dermatitis (Tabelle 1, Abb.. 1 und 2) wurde verwendet, um die betroffenen Gewebe zu studieren. In einem Tier (EM96) eine spektrale Überlappung von IgA und tTG2 Antikörper (Abb. 3) wurde demonstriert. Die Anwesenheit von Doppel-positive tTG2 + IgA + Zellen wurde in den tiefen Epidermis, um die dermalen Papillen konzentriert. Dies steht im Einklang mit Läsionen in DH-Patienten 3 beschrieben. Wenn EM96 auf eine glutenfreie Diät, die Dermatitis, sowie gelegt wurde tTG2 + IgA + Ablagerungen verschwunden und wurden nicht mehr nachweisbar (Abb. 1-3). Dermatitis jedoch auf Wiedereinführung der Nahrung Gluten in EM96 (nicht dargestellt) wieder auf. In anderen Makaken einschließlich Tier mit nicht verwandten Dermatitis wurden die tTG2 + IgA + Ablagerungen nicht erkannt. Gluten-freie Diät-abhängige Vergebung der Dermatitis in EM96 zusammen mit Anwesenheit von tTG2 + IgA + Zellen in der Haut deuten auf eine Autoimmunerkrankung, DH-likeMechanismus für die Entwicklung dieses Zustandes. Dies ist der erste Bericht von DH-ähnliche Dermatitis in jeder nicht-menschlichen Primaten.

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) ist eine chronische entzündliche Erkrankung durch eine Autoimmunreaktion zwischen IgA und epidermalen Transglutaminase (ETG) gekennzeichnet. DH entwickelt sich in einem sehr kleinen Teil der gluten-sensitive und / oder Zöliakie-Patienten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass DH kann auch in einem Rhesusaffen-Host mit Symptomen der idiopatic Dermatitis zu entwickeln.

Die Anerkennung der Epidermal Transglutaminase von IgA und Tissue Transglutaminase 2 Antikörper in einem seltenen Fall von Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

24.4K Aufrufe.  Tulane National Primate Research Center. Dermatitis herpetiformis (DH) ist eine chronische entzündliche Erkrankung durch eine Autoimmunreaktion zwischen IgA und epidermalen Transglutaminase (ETG) gekennzeichnet. DH entwickelt sich in einem sehr kleinen Teil der gluten-sensitive und / oder Zöliakie-Patienten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass DH kann auch in einem Rhesusaffen-Host mit Symptomen der idiopatic Dermatitis zu entwickeln.

Serie: Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Forschung

Immunologie und Infektion

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

IgY-Technologie: Extraction of Chicken Antikörper aus Eidotter durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

Zerkarien Transformation und In-vitro- Anbau von Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research. 
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&amp;#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (V&#954;) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.

Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V &amp; kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

Auswirkungen der Exposition von Formaldehyd zu einem Rattenmodell der Neurodermitis durch Behandlung der Neugeborenen Capsaicin induziert

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...