Die Autoren schätzen die Beratung und technische Unterstützung durch Dr. Richard Konz und Personal an der Durchflusszytometrie-Core Facility sofern an der University of Massachusetts Medical School. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center Stipendium DK032520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem National Institute of Mental Health (NIMH), das National Institute of Drug Abuse (NIDA) und dem National Institute of Child Health and Human Development unterstützt.

Kerne Extraction <ol><li> Legen Sie 250 mg des gefrorenen postmortem Gehirngewebe in 5 ml Lysepuffer 1 in einem douncer und legen Sie sie auf Eis. So empfangen Sie ca. 5 Millionen Keime nach FACS-Sortierung verwenden wir im allgemeinen 1000 mg Gewebe pro Probe. </li><li> Sobald das Gewebe aufgetaut, Dounce das Gewebe für 1 Minute, während auf dem Eis. </li><li> Nehmen Sie die homogenisierte Gewebe und legen Sie sie in eine 15 ml klare Ultrazentrifuge Röhre. Setzen Sie das Rohr auf dem Eis. </li><li> Nehmen 9 ml Saccharose-Lösung 2 mit einer Pipette, legen Sie die Pipette an der Unterseite des klaren Ultrazentrifuge Rohr, und lassen Sie die Saccharose-Lösung 2 zu einem Konzentrationsgradienten mit dem homogenisierten Gewebe Lösung auf der Oberseite des Saccharose-Lösung 2 zu erstellen. </li><li> Wiegen der Ultrazentrifuge Röhren, um sicherzustellen, dass sie alle werden ausgeglichen, während sich drehenden innerhalb der Ultrazentrifuge werden. Nehmen Sie die Anpassungen, um das Gewicht, indem Lysispuffer 1, um die oberste Schicht. </li><li> Nach dem Röhrchen gewogen wurden, legen Sie sie in den Rotor der Eimer. </li><li> Legen Sie alle Eimer in einen SW28 Rotor und setzt vorsichtig den Rotor in der Ultrazentrifuge. </li><li> Ultrazentrifuge der Proben bei 107163,6 RCF 2,5 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand, zusammen mit der Schicht aus Schutt an der Konzentrationsgradient gefunden, mit dem Einsatz von Vakuum, während man aufpassen, nicht das Pellet enthält die Kerne am Boden des Röhrchens zu stören. </li><li> Add 500 mL 1X PBS in jedes Pellet und lassen Sie sich auf dem Eis für 20 Minuten. Dies ermöglicht das Pellet ein wenig auf seine eigene Auflösung, so dass es später leichter mechanisch löse es durch Auf-und Abpipettieren, die verringert die Menge der Stress der Kerne zu erleben. </li><li> Nach der Kerne auf Eis für 20 Minuten haben inkubiert, mechanisch Pipette auf und ab um sich vollständig aufzulösen die Kerne innerhalb 1XPBS. </li><li> Entfernen Sie die Kerne-haltigen Lösung aus der Ultrazentrifuge Rohre und kombinieren Sie die Inhalte von zwei Rohren in einem einzigen 2 mL Reaktionsgefäß. Auch hier legen Sie die Proben auf Eis. </li></ol> Immunfärbung für FACS <ol><li> An dieser Stelle, machen Sie eine Immunfärbung Mischung aus primären und sekundären Antikörpers zusammengesetzt und Blocking Mix. Für jede Probe kombinieren 300 ul 1XPBS mit 1,2 ul der NeuN Antikörper, 100 L Blocking Mix, die 0,5% BSA und 10% normales Ziegenserum in 1XPBS und 1 ul Alexa Fluor 488 enthält. Für den Kontrollproben, schließen Sie die primäre Antikörper NeuN und statt dessen einfach mehr 1XPBS. </li><li> Vortex die Immunfärbung Mischung und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Während die Färbung Mischung inkubiert, um die Steuerelemente für die Proben. Für FACS-Sortierung, eine Probe, die Kerne allein, die so genannte &quot;ungefärbte Kontrolle&quot; notwendig ist, eine zweite Probe, eine negative Kontrolle, welche die Kerne mit dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488, ohne den primären Antikörper NeuN auch benötigt wird. </li><li> Aliquot 20 ul der Kerne enthaltenden Lösung in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit 1XPBS für die ungefärbten Kontrolle, und weitere 20 ul in eine andere 2 ml Tube mit 980 uL der 1XPBS für die negative Kontrolle. Erhöhen Sie die Lautstärke der Kerne enthaltenden Probe wieder auf 1 ml mit 1XPBS. Alle Proben sind wieder auf Eis gelegt. </li><li> Nun, da die Immunfärbung Mischung fertig Inkubation, fügen Sie den Inhalt von 401 ul in die entsprechenden Proben. Die Kerne Probe erhalten die Mischung, die sowohl NeuN und Alexa Fluor 488, während die negative Probe der Mischung, die nur den sekundären Antikörper Alexa Fluor 488 erhalten. </li><li> Nehmen Sie die Proben in den kalten Raum im Dunkeln für 45 Minuten zu drehen. </li><li> Nachdem die Proben im Dunkeln für 45 Minuten inkubiert wurden, legte sie auf Eis und bringt sie zu den FACS-Anlage. Während des Transports in der FACS-Anlage, sollten die Proben auf Eis und im Dunkeln gehalten werden. </li></ol> FACS <ol><li> Bei der FACS-Anlage, filtern Sie die Proben durch einen 40 um Filter. Dann führen sie durch das Instrument für ein paar Minuten, während sie kalt gehalten, um einige vorläufige Daten vor dem Sortieren zu bekommen. </li><li> An dieser Stelle ist es notwendig, die entsprechenden Tore für die Sortierung gesetzt werden müssen. Mehrere verschiedene Tore sind zu sortieren Proben verwendet. Das erste Tor gibt eine Vorstellung von der Größe der verschiedenen Kerne in der Probe gefunden, und ermöglicht separatation von Schutt von den tatsächlichen Kernen. Das zweite Tor ermöglicht es uns, Kerne einzeln zu sortieren. Entsorgen Sie alle Aggregate sind an dieser Stelle verworfen. Schließlich ist das dritte Tor zu einer bestimmten Fluoreszenzwellenlänge gesetzt, passend, dass der Fluorochrom in unserem sekundären Antikörper gefunden. Platzieren dieses Tor ermöglicht es uns, zu sortieren und trennen NeuN +, also neuronale Kerne aus NeuN - Kernen. </li><li> Nach all den Toren gewählt sind, können die Kerne in 1XPBS sortiert werden. </li><li> Sobald dergesamte Probe durchlaufen hat, überprüfen Sie die Reinheit der Art, indem Sie einen aliquoten Teil der Probe sortiert durch das Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Probe die Fluoreszenz nicht ausgebreitet, sondern in einem einzigen Quadranten enthalten. Am besten ist es Proben, die mehr als 90% rein sind zu wählen. </li></ol> Nach FACS <ol><li> Sobald die Probe wurde sortiert, kann beginnen Verarbeitung der Kerne. Nehmen Sie sich 10 mL Probe sortiert und fügen Sie 2 ml Saccharose-Lösung 2, 50 ul 1 M CaCl 2 und 30 ul von 1m Mg (Ace) 2. Zur Erinnerung: immer sicher sein, um die Probe auf Eis zu halten, da die Kerne unfixierten sind. </li><li> Wenn es weniger als 10 ml sortiert Probe, die Lautstärke zu erhöhen bis zu 10 mL, indem 1XPBS, oder stellen Sie die zusätzlichen Materialien entsprechend. </li><li> Kehren Sie die Probe mehrmals und auf Eis für 15 Minuten. </li><li> Nachdem die Proben auf Eis für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert sie in einer Schaukel Eimer Rotor bei 1786 RCF für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand mit dem Einsatz von Vakuum, ohne die weiße Pellet am Boden des Röhrchens gefunden. </li><li> Lösen Sie das Pellet in 200 ul, was für Sie optimalen Lösung für das Verfahren Experimente und Pipette auf und ab. </li><li> Übertragen Sie die Lösung in ein kleineres Rohr und legen Sie sie in die -80 ° C Gefrierschrank bis zur weiteren Verwendung. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Das Protokoll hier vorgestellten sollte besonders nützlich für Studien zu epigenetischen Veränderungen der neuronalen Chromatin und ganz allgemein ausgerichtet, auf der molekularen Phänotyp der neuronalen Zellkern, während der normalen Entwicklung und Alterung, oder in neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen. Die Methode ist von besonderem Vorteil, wenn die zelluläre Heterogenität des Hirngewebes, einschließlich der möglichen Verschiebungen in Neuron-to-Glia Ration im Verlauf des Alterns oder wegen Krankheit eine Sorge <su...

Reagenzien: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysispuffer </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Sucrose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetat) 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 pl </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Saccharose-Lösung </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sucrose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetat) 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce Puffer </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Der pH-Wert auf 7,5 und das Volumen auf 200 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Neuronen im menschlichen Gehirn postmitotischen weitgehend geworden während der pränatalen Entwicklung, und behalten so ihre Kerne während der gesamten Lebensdauer. Es ist jedoch wenig über die Änderungen in der neuronalen Chromatin und nukleare Organisation im Laufe der Entwicklung und Alterung, oder bei chronischen neuropsychiatrischen Krankheit bekannt. Doch bis heute die meisten Chromatin und DNA basierenden Tests (außer Fisch) fehlen einzelne Zelle Auflösung. Zu diesem Zweck stellt die erheblichen zellulären Heterogenität des Hirngewebes eine erhebliche Einschränkung, denn in der Regel verschiedene Subpopulationen von Neuronen mit verschiedenen Arten von Gliazellen und anderen nicht-neuronalen Zellen vermischt. Eine mögliche Lösung wäre, Zelltyp-spezifische Kulturen wachsen, aber die meisten ZNS-Zellen, einschließlich Neuronen, sind ex vivo eine nachhaltige, am besten, denn nur ein paar Wochen und somit würde ein unvollständiges Modell für epigenetische Mechanismen potentiell Betriebskosten über die gesamte Lebensdauer liefern . Hier bieten wir ein Protokoll zu extrahieren und zu reinigen Kerne aus gefrorenem (nie fest) menschlichen post mortem Gehirn. Das Verfahren beinhaltet die Extraktion der Kerne in hypotone Lyse-Puffer, durch Ultrazentrifugation und immunotagging mit anti-NeuN-Antikörper. Labeled neuronale Kerne werden dann separat mit Fluoreszenz-aktivierter Sortierung gesammelt. Diese Methode sollte für jede Region des Gehirns in eine Vielzahl von Arten und für Chromatinimmunpräzipitation Studien mit Ort-und Umbau-spezifischen anti-Histon-Antikörper, und für die DNA-Methylierung und andere Assays.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

Serie: Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Forschung

Biologie

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Isolierung, Charakterisierung und therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel aus kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy homeostasis and the metabolism of xenobiotics, among others. These tasks are performed through tight coordination between hepatic parenchymal and non-parenchymal cells. Additionally, various metabolic activities are confined to specific areas of the hepatic lobule-a phenomenon called liver zonation. Recent advances in single-cell sequencing technologies have empowered researchers to investigate tissue heterogeneity at a single-cell resolution. In many complex tissues, including the liver, harsh enzymatic and/or mechanical dissociation protocols can negatively affect the viability or the quality of the single-cell suspensions needed to comprehensively characterize this organ in health and disease.
This paper describes a robust and reproducible protocol for isolating nuclei from frozen, archived liver tissues. This method yields high-quality nuclei that are compatible with downstream, single-cell omics approaches, including single-nucleus RNA-seq, assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq), as well as multimodal omics (joint RNA-seq and ATAC-seq). This method has been successfully used for the isolation of nuclei from healthy and diseased human, mouse, and non-human primate frozen liver samples. This approach allows the unbiased isolation of all the major cell types in the liver and, therefore, offers a robust methodology for studying the liver at the single-cell resolution.

Here, we present a protocol for isolating nuclei from flash-frozen, archived liver tissues for single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq, and joint multiomics (RNA-seq and ATAC-seq).

Isolierung von Zellkernen aus schockgefrorenem Lebergewebe für Einzelzell-Multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Isolierung und Profilierung einzelner Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Author Spotlight: Enhancing Drug Discovery - Entwicklung automatisierter, standardisierter Protokolle für die Zellkernextraktion aus gefrorenem Gewebe 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung