Dieses in vitro, 96-Well-Plate-basierte Protokoll kann verwendet werden, um die hemmende Wirkung von Antikörpern auf neuartige Antimykotika auf die metabolische Aktivität von Pilzzellen in Candida-Biofilmen zu testen. Im Vergleich zu anderen Methoden ist dies eine hochempfindliche, genaue, durchsatzstarke, reproduzierbare, benutzerfreundliche und kostengünstige Technik zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern oder Antimykotika auf die Entwicklung von Candida-Biofilmen. Dieser Assay kann zur Beurteilung der Wirksamkeit neuartiger arzneimittel- oder antikörperbasierter Therapeutika sowie von Impfstoffkandidaten gegen Candida-Biofilme verwendet werden, die mit dem Schweregrad der invasiven Candidiasis assoziiert sind.
Diese Methode kann angewendet werden, um die Wirkung neuartiger Antimykotika oder Antikörper während der Biofilmbildung oder -reifung in verschiedenen Umgebungen unter Verwendung verschiedener Pilzstämme oder Antikörperquellen zu testen. Dieses Verfahren wird Herr Pankaj Chandley, ein Doktorand, der in meinem Labor arbeitet, demonstrieren. Fügen Sie zunächst 100 Mikroliter Candida tropicalis-Kultur zu einer 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu.
Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette die letzten beiden Säulen allein mit 100 Mikrolitern RPMI 1640 MOPS Medium. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit einem Deckel und Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter stationären Bedingungen. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab.
Drehen Sie die Platte vorsichtig auf Löschbleche und klopfen Sie, um das restliche Medium zu entfernen. Waschen Sie die Platte mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit einer Mehrkanalpipette. Saugen Sie das PBS vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab und waschen Sie es zweimal mit PBS.
Um überschüssiges PBS zu entfernen, trocknen Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Bereiten Sie serielle Verdünnungen von hitzeinaktivierten Serumproben in sterilem RPMI 1640 MOPS-Medium vor. Fügen Sie 100 Mikroliter der ausgewählten Serumverdünnung zu jeder Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu.
Fügen Sie in Spalte 10 nur RPMI 1640 MOPS medium für die reine Pilz-Positivkontrolle hinzu. Fügen Sie eine Verdünnung von Serum von eins bis 50 in alle Vertiefungen in Spalte 11 hinzu, um als pilzfreie plus Serumnegativkontrolle zu dienen. Nachdem Sie die Platte mit einem Deckel und Aluminiumfolie abgedeckt haben, inkubieren Sie die Platte für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag, nachdem Sie das Serum vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette abgesaugt haben, klopfen Sie vorsichtig auf die umgekehrte Platte, um das restliche Serum zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche dreimal und trocknen Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank, um überschüssiges PBS zu trocknen. Dann lösen Sie 25 Milligramm XTT in 50 Milliliter filtersterilisiertem Ringer-Laktat.
Aliquot 10 Milliliter in separaten Röhrchen. Decken Sie es mit Aluminiumfolie ab und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Als nächstes lösen Sie 8,6 Milligramm Menadion in fünf Milliliter Aceton auf.
Und nachdem Sie 50 Mikroliter in 100 separaten Mikroröhrchen verteilt haben, lagern Sie die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius. Nehmen Sie 10 Milliliter XTT und fügen Sie einen Mikroliter Menadion hinzu, um eine einmikromolare Arbeitslösung zu erhalten. Fügen Sie 100 Mikroliter der XTT-Menadion-Lösung pro Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu.
Nachdem Sie die Platte mit einem Deckel und Aluminiumfolie bedeckt haben, inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Übertragen Sie schließlich 80 Mikroliter des farbigen Überstands aus jeder Vertiefung in eine frische 96-Well-Platte und lesen Sie die Platte bei 490 Nanometern. Serum von Sap2-Parapsilose-immunisierten Mäusen könnte die Reifung von vorgeformten Candida tropicalis-Biofilmen um 65% verhindern, verglichen mit 45% im Serum von Sap2-albicans und 55% in Sap2-tropicalis-immunisierten Mäusen.
Im Allgemeinen war die Biofilmhemmung durch Sap2-Immunserum signifikant höher als durch Scheinimmunserum, das 16% und 13% im Präimmunserum beträgt. Die Biofilmhemmung war bei Verwendung von PBS und ohne Serumkontrolle nahezu vernachlässigbar. Bei der Durchführung der Waschschritte ist äußerste Vorsicht geboten, um eine Störung der Biofilme zu vermeiden.
Die XTT-Lösung sollte kurz vor Gebrauch vorbereitet und sofort auf die Platte gegeben werden. Nach diesem Verfahren können Anwender die Wirkung neuartiger Antimykotika, Impfstoffkandidaten oder Antikörper während der Candida-Biofilmbildung und -reifung in verschiedenen Forschungsumgebungen mit verschiedenen Pilzstämmen bewerten.
