Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Süden von Texas Technologiemanagement (POCrr 2009,041), das Institut für die Integration von Medizin und Wissenschaft vom National Center for Research Resources (UL 1RR025767), und vom National Institute of Dental &amp; Kraniofaziale Forschung (gefördert 5R21DE017294).

1. Synthese von funktionalisierten Folien <ol><li> Legen Sie die Objektträger in einem herausnehmbaren Objektträgergestell, und waschen zweimal durch Eintauchen in eine Küvette mit 99% Ethanol (Grading). Wischen Sie die Folien mit Papiertüchern reinigen (Sicherstellung nicht um Papierstaub zu generieren), trocken und mit einem Strahl aus unter Druck stehendem Stickstoffgas. </li></ol> HINWEIS: Verwenden Sie nicht Kim-Wipes, um die Folien wischen, wie es Feinpapier Staub erzeugen würde. <ol start="2"><li> Tauchen Sie die Dia-Rack mit den Objektträger in einer Küvette mit konzentrierter Schwefelsäure und inkubieren Sie bei Raumtemperatur über Nacht gefüllt. </li></ol> HINWEIS: Um Berührung mit der Haut zu vermeiden, verwenden chemikalienbeständige Handschuhe und Schutzbrille beim Arbeiten mit konzentrierten Säuren und giftige und ätzende Chemikalien. <ol start="3"><li> Beschallen die Folien für 30 Minuten waschen und mit Milli-Q (18 MOhm) Wasser für 30 Minuten, mit einem weiteren Waschgang in einer folgencetone für 5 min. Diese Behandlung macht die Silanolgruppen auf der Glasoberfläche. </li><li> Die gereinigte Objektträger mit 2,5% (vol / vol in Wasser) von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES)-Lösung, durch Eintauchen des Objektträgergestell in APTES für 30 min, 3-maligem Waschen in Milli-Q Wasser für 15 Minuten bei jedem Waschen und Backen die Folien in einem Ofen bei 110 ° C für 15 min. Backen ermöglicht Vernetzung der APTES, was zu-NH 2-Funktionalisierung der Oberfläche. </li></ol> HINWEIS: Stellen Sie die APTES Lösung in einem Kunststoffbehälter seit APTES Ablagerungen bevorzugt an den Wänden der Glasbehälter. <ol start="5"><li> Verwendung einer Spinbeschichtungsvorrichtung, Beschichtung der Folien mit 1% (Gew. / Vol. in Toluol) Polystyrol-Co-Maleinsäureanhydrid (MA-PS) (Sigma), um eine Mono-Schicht aus hydrophoben Beschichtung 6 zu erreichen. Fügen Sie 2,0 ml PS-MA auf einen sauberen Objektträger aus Glas auf einem Spin-Coater und Mantel bei 3.000 rpm für 30 s montiert. Diese Bedingungen können auf Spin-Coating-Beschichtung Parameter wie variieren, sosung, Substrat, Dicke der Beschichtung und geregelt durch die folgende Gleichung 7 </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> wobei h Dicke von Film-Beschichtung, E Verdampfungsrate sind η, C und ρ Viskosität, Konzentration und Dichte der Beschichtungslösung, jeweils, und ω die Winkelgeschwindigkeit. HINWEIS: Toluol ist gesundheitsschädlich, wenn für eine lange Zeit und die Verwendung von einem Abzug eingeatmet wird empfohlen. <ol start="6"><li> 8 ° C - Die Dias können in einem Dia-Rack für bis zu einem Monat in trockenen, staubfreien Bedingungen bei 2 </li></ol> 2. Herstellung von Hefe-Inokula und Collagen Encapsulation <ol><li> Bereiten Sie eine Übernachtkultur von C. albicans SC5314, in Hefe-Pepton-Dextrose [YPD; 10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton und 20 g / l Dextrose] flüssigen Medium durch Beimpfen eines einzelnen Kolonie von C albicans in 10 - 20 ml YPD-8. Inkubieren Kultur in einem Schüttler (ca. 150 bis 200 rpm) bei 30 ° C über Nacht. Ernte 1 ml Hefe Candida albicans Zellen aus Kulturen über Nacht YPD (durch Zentrifugation bei 5.000 UpM für 5-10 Minuten) und waschen zweimal für 10 min in 1 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM Phosphat-Puffer, 2,7 mM Kaliumchlorid, 137 mM Natriumchlorid, pH 7,4) (Sigma) pro Wäsche. Ernte gewaschenen Zellen auch durch Zentrifugation bei 1900 UpM für 10 Minuten. Resuspendieren der gewaschenen Zellen in 1 ml Rekonstruktion Puffer (0,2 N NaOH-Lösung mit 2,2% (Gew / Vol) Natriumbicarbonat und 4,8% (Gew / Vol) HEPES, pH 7,2). </li></ol> HINWEIS: C. albicans ist ein Risk Group 1/BSL1 Mikroorganismus. Immer daran denken, gute aseptische / sterile Techniken für die Arbeit nutzen mit diesem Mikroorganismus und folgen institutionellen Verfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung biologischer Gefahrenstoffe. <ol start="2"><li> Zählen von Zellen mit Hilfe eines hemocytBeschleunigungsaufnehmer auf einem Hellfeld-Mikroskop und stellen bis zu einer Zelldichte von 5 × 10 7 Zellen / ml. </li><li> Weitere Die Suspension zehnmal durch Zugabe von 10 × RPMI-1640 mit L-Glutamin und gepuffert mit Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) Säure (pH 7,2). </li><li> Kapseln der Hefezellen in Kollagen durch Mischen der Zellsuspension in RPMI-1640 mit Kollagen (1,8 mg / ml) (Typ 1 aus Rattenschwanz, BD Biosciences, Bedford, MA), um eine Endkonzentration von 4 × 10 6 Zellen / zu erhalten ml. Halten Sie die Kollagen-Zell-Suspension auf Eis, um die Gelierung von Kollagen vor dem Druck zu verhindern. </li></ol> 3. Herstellung von Ca BChip <ol><li> Reinigen und desinfizieren Sie alle Oberflächen des Microarrayer, einschließlich der Quelle Platte Station, Wasch-und Vakuum-Station, Vakuum und Druck Teller gleiten Kammer, durch Abreiben mit 70% Isopropanol. </li><li> Platzieren und halten durch Vakuum die gewünschte Anzahl von PS-MA-beschichteten Glas-Objektträger auf dem Objektträger Deck des Mikrofonroarrayer. </li><li> Vortex die Zellsuspension in Kollagen und kräftig saugen 100 ul des gut gemischten Suspension in eine Vertiefung einer 96-Well Platte kurz vor dem Drucken. Legen Sie diese Quelle Platte in der Ladestation. </li><li> Schalten Sie den Luftbefeuchter auf eine relative Luftfeuchtigkeit von 100% in der Microarray-Kammer während des gesamten Druckprozesses. </li><li> Drucken 50 nl der Zellsuspension in einem Array von 48 Zeilen und 16 Spalten mit Flecken 1,2 mm voneinander unter Verwendung eines Mikroarray (Pyxsis Omnigrid Micro Digilab Inc., Holliston, MA) durch berührungslose Abscheidung mit konisch zulaufenden Öffnung 190 um Keramikspitzen beabstandet (Digilab). </li><li> Prime gründlich und unter Vakuum getrocknet zweimal die Spitzen nach jeder Runde der Drucklegung. </li><li> Unmittelbar nach dem Druck, legen Sie die Folie in einem luftdichten, feuchten Kammer (Hybridisierung Kassette, Arrayit Corporation, Sunnyvale, CA) und Inkubation bei 37 ° C für 24 h bis zur Bildung von Biofilmen zu ermöglichen. </li></ol> 4. Empfindlichkeitsprüfung von Preformed Biofilme in Ca BChip gegen Antimykotika <ol><li> Ab Lager Lösungen oder Pulver von Antimykotika, bereiten eine funktionierende Lösung in RPMI-1640 Medium. Typische maximale Konzentration der Arbeitslösung sind 1.024 ug / ml für Fluconazol und 16 ug / ml für Amphotericin B 5. Andere Konzentrationen können für verschiedene Mittel verwendet werden. </li><li> Planen acht verschiedenen Konzentrationen der Verbindung, die durch Verdünnen der Stammlösung in zweifachen Verdünnungen, die einen Bereich mit dem geschätzten IC 50 der Verbindung in der Mitte. </li><li> Nach 24 Stunden von Biofilmwachstum, verwenden Sie die Microarrayer zu 50 nL von acht verschiedenen Konzentrationen der Medikamente zu drucken, zusammen mit positiven (kein Medikament, dh Zellen, die in nur Medien) und negativen (behandelt mit Natriumhypochlorit für 20 min) Kontrollen in mindestens sechs Wiederholungen am Anfang der Biofilme. </li></ol> HINWEIS: Achten Sie auf eine relative Luftfeuchtigkeit von 100% auf die Trocknung der Spots während Add verhindernÝng die Drogen. <ol start="4"><li> Bald nach der Zugabe der Medikamente, Inkubieren des Chips mit den Medikamenten in einer befeuchteten Kammer bei 37 ° C für 24 Stunden. </li><li> Waschen der Medikamente durch Eintauchen des CaBChip 3-5 mal für 2 min jedes Mal in PBS und Flecken durch Inkubation des Ca BChip mit 0,5 uM FUN1 bei 37 ° C für 30 min 9. </li><li> Waschen Sie den Fleck durch Eintauchen der Ca BChip 3-5 mal in PBS für 1-3 min jeden Dunk, und trocknen Sie das Ca BChip mit einem Stickstoffstrom. Lesen Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines Mikroarray-Abtastvorrichtung (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) bei einer Wellenlänge von 532 nm mit einer PMT-Verstärkung von 380. </li><li> Stellen Sie die Intensität der Fluoreszenz der positiven Kontrolle (kein Medikament) und tot (Bleich-behandelten) Biofilm Flecken bei 100% und 0% betragen. </li><li> Der prozentuale Hemmung durch die Verringerung der Intensität der Fluoreszenz (F) relativ zu dem Durchschnitt der Kontrollflecken Verwendung der folgenden Gleichung </li></ol><img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> wo F, F max und F o sind rohe Fluoreszenzintensitäten von Arzneimittel-behandelten, nicht-Drogen-und Bleichmittel behandelten Flecken, jeweils. Die Scanner-Einstellungen wurden so eingestellt, C max und F o von 30000 und 4000 RFU bzw. zu erhalten. <ol start="9"><li> Berechnen Sie die 50% hemmende Konzentration oder IC 50 durch Einsetzen des variablen Steigung Hill-Gleichung unter Verwendung von GraphPad Prism Software (La Jolla, CA). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Eine repräsentative Ca BChip, bestehend aus einem 48 × 16-Anordnung von Nano-Biofilme von C. albicans, ist in 2 gezeigt. Die Hellfeld-Mikroskopie zeigt eine Gesamtansicht architektonische Merkmal des Nano-Biofilm. Die REM-Aufnahmen von dem Biofilm zeigen, dass die Hyphen in der Matrix eingebettet sindKollagenfasern, die etwa 2 um und 100 nm im Durchmesser sind, jeweils. Die FUN1-gefärbten Microarray-Scanner Bilder zeigen die Hefe und Hyphen-Formen, die charakteristisch für Pilz-Biofilmen sind. Die 2D-und 3D-konfokale Fluoreszenz-Bilder von FUN1-gefärbten Biofilmen zu sehen, dass räumliche Heterogenität aufweisen, mit Regionen von metabolisch aktiven Zellen in der extrazellulären Matrix (bestehend aus Kollagen als Einkapselungsmaterial und höchstwahrscheinlich auch von exopolymere Material hergestellt durch eingestreute Biofilm-Zellen), die nicht durch den metabolischen Farbstoff gefärbt. Die Dicke der Biofilm wurde auf etwa 50 um. Die Ca BChip wurde verwendet, um die antifungale Empfindlichkeit von zwei Medikamenten, Fluconazol und Amphotericin B zu schätzen, und die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. In Übereinstimmung mit veröffentlichten Berichten über Industriestandard 96-Well-Platte Assays sind in den Biofilmen gegen Fluconazol 10 und der berechneten IC 50 für resistente<html> Amphotericin B ist 0,3 ug / ml 11. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flussdiagramm für die Herstellung von Ca BChip. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ein Bild der Hochdurch-Ca BChip, bedruckt mit einem Roboter-Microarrayer und mit 768 Punkten auf PS-MA-beschichtete Objektträger. Jeder Spot ist halbkugelförmigen 50 nl Volumen, ca. 700 um im Durchmesser und mit einem 1,2 mm Abstand zwischen Flecken. Ebenfalls gezeigt (im Uhrzeigersinn) sind die Lichtmikroskopie, Microarray-Scanner, 2D-und 3D-Fluoreszenz-Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie Bilder der einzelnen Biofilmen auf der Ca BChip. Die REM-Abbildung bei hoher Vergrößerung von 25.000 x zeigt eine Hyphen Filament mit einer Breite von 2 um. Abbildung 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Ergebnisse der antimykotische Empfindlichkeitsprüfung und Bestimmung der IC 50-Werte für (A) und Fluconazol (B) Amphotericin B mit Ca BChip. Die Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen von Amphotericin B-behandelten Biofilme sind in (C) gezeigt. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler für zwei separaten Chips mit 10 bedeuten Wiederholungen für jede Bedingung.

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	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

Jose L. Lopez-Ribot und Anand K. Ramasubramanian Eigenkapital in MicrobeHTS Technologies, Inc., die Entwicklung von Antimykotika ist. MicrobeHTS Technologies, Inc. zur Verfügung gestellt keine finanzielle Unterstützung für diese Studien.

Wir haben eine zell-basierte High-Density-Microarrays, Ca BChip, bestehend aus Nanoliterbereich Candida albicans Biofilmen entwickelt. Der Mikroarray wurde auf modifizierten Glas-Substrate, die für robuste Befestigung Kollagengel Stellen erlaubt und gleichzeitig Hydrophobie, die für eine nicht anzulegen, halbkugelförmigen 3D-Gel gedruckt. Eine einzelne Ca BChip ersetzen etwa acht 96-Well-Platten und mehrere Chips können ausgedruckt und zur gleichen Zeit verarbeitet werden. Der Chip nutzt N...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> Polystyrol-Co-Maleinsäureanhydrid (MA-PS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> Glas-Folien-Mikroskopie </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> Rat Tail Typ I Kollagen </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Robotic Microarrayer </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Microarray Scanner </td><td> Genepix Persönliche 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> Hybridisierung Cassette </td><td> Arrayit GmbH </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2-ChlorRo-4-(2,3-Dihydro-3-methyl-(Benzo -1,3-thiazol-2-yl)-methyliden)-1-phenyl quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen Corp </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Fluconazol </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc. </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Sigma </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> Keramik Spitze 190 um Öffnung </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad Prism Software </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Genepix Pro V4.1 </td><td> Molecular Devices </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

Candida albicans vor der wichtigste Erreger der Candidiasis, die derzeit die vierthäufigste nosokomiale Infektion der Blutbahn in US-Krankenhäusern ein. Diese opportunistische Infektionen stellen eine wachsende Bedrohung für eine wachsende Zahl von kompromittierten Individuen und tragen inakzeptabel hohen Sterblichkeitsraten. Dies ist zum Teil aufgrund der begrenzten Arsenal von Antimykotika, sondern auch auf die Entstehung von Resistenzen gegen die am häufigsten verwendeten Antimykotika. Eine weitere Komplikation der Behandlung ist die Tatsache, dass eine Mehrheit der Manifestationen der Candidiasis mit der Bildung von Biofilmen assoziiert sind, und Zellen innerhalb dieser Biofilme zeigen erhöhte Beständigkeit gegen die meisten klinisch-Antimykotika 2 verwendet. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines High-Density-Microarray, die aus C besteht albicans Nano-Biofilme, die wir Ca BChip 3 benannt haben. Kurz gesagt, wird ein Roboter-Microarrayer t verwendeto Druck Hefezellen C albicans auf ein festes Substrat. Während des Druckens werden die Hefezellen in einer dreidimensionalen Matrix mit einem Volumen von nur 50 nl und immobilisiert auf einem Glassubstrat mit einer geeigneten Beschichtung eingeschlossen. Nach anfänglichen Druck werden die Folien bei 37 ° C für 24 Stunden inkubiert, um für Biofilmentwicklung ermöglichen. Während dieser Zeit wachsen die Flecken in voll entwickelte &quot;Nano-Biofilme&quot;, ​​das zeigen die typischen Struktur-und phänotypische Merkmale mit altem C verbunden albicans Biofilmen (dh morphologische Komplexität, dreidimensionale Architektur und drug resistance) 4. Insgesamt ist das Ca BChip von ~ 750 entspricht und räumlich unterschiedlichen Biofilme bestehen; mit dem zusätzlichen Vorteil, dass mehrere Chips gedruckt und verarbeitet werden können simultan. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Messen der Fluoreszenzintensität der FUN1 metabolischen Färbung unter Verwendung eines Mikroarray-Abtastvorrichtung geschätzt. Dieser Pilz-Chip eignet sich ideal für u geeignetse in echter High-Throughput-Screening für antimykotische Wirkstoffforschung. Im Vergleich zu aktuellen Standards (dh der 96-well Mikrotiterplatten-Modell der Biofilmbildung 5), sind die wichtigsten Vorteile des Pilz-Biofilm-Chip-Automatisierung, Miniaturisierung, Einsparungen bei den Mengen und Kosten der Reagenzien und Analysen Zeit, sowie die Beseitigung von Arbeitskräften intensive Schritte. Wir glauben, dass solche Chips wird erheblich beschleunigen den antimykotischen Wirkstoff-Forschung.

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Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von entwickelten<em&gt; C albicans</em&gt; Genannt<em&gt; Ca</em&gt; BChip. Die Anfälligkeit Profil von Medikamenten auf ein getestet<em&gt; Ca</em&gt; BChip ist vergleichbar mit dem konventionellen 96-Well-Platte-Modell, was darauf hindeutet, dass der Pilz-Chip ist ideal für echtes High-Throughput-Screening von Antimykotika geeignet.

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K Aufrufe.  University of Texas at San Antonio. Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von entwickelten C albicans Genannt Ca BChip. Die Anfälligkeit Profil von Medikamenten auf ein getestet Ca BChip ist vergleichbar mit dem konventionellen 96-Well-Platte-Modell, was darauf hindeutet, dass der Pilz-Chip ist ideal für echtes High-Throughput-Screening von Antimykotika geeignet.

Serie: Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

Anwendungen für Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...