Die erfolgreiche Etablierung des ASCJ-Inability-Mausmodells erweitert ein einfaches Sprunggelenksunfähigkeits-Tiermodell und liefert neue Konzepte für die Untersuchung klinischer Fußerkrankungen. Wir haben ein Tiermodell etabliert, das der tatsächlichen klinischen Situation besser entspricht und für die weitere Forschung zur Diagnose und Behandlung von Fußerkrankungen genutzt werden kann. Eine Woche vor dem Experiment werden die Mäuse einem Schwebebalken- und Gangtraining unterzogen, wobei sie von einem Ende eines Schwebebalkens oder eines U-förmigen Rohrs zum anderen gehen, ohne anzuhalten.
Nach der Betäubung und Entfernung der Haare am Knöchelgelenk der rechten Hintergliedmaßen der Maus desinfizieren Sie die freiliegende Haut mit einem Jodtupfer. Übertragen Sie die Maus mit einem sterilen OP-Pad in den Tieroperationssaal der Mikrochirurgie. Für die transversalen Hals- und vorderen Talofibularbandgruppen wird mit einem Skalpell ein sieben Millimeter schräger Längsschnitt nach unten auf die Haut oberhalb des rechten Sprunggelenks gesetzt.
Und Sonde mit mikroskopisch kleinen geraden Pinzetten an der Vorderseite des Sprunggelenks. Stellen Sie sicher, dass das vordere talofibuläre Ligamentum am unteren Rand des Taluskörpers und des Wadenbeins freigelegt wird, und schneiden Sie es vorsichtig mit einem Skalpell ab. Trennen Sie die langen und kurzen Fibularsehnen sowie die Sehnen des Extensor digitorum longus.
Legen Sie das Halsband frei und schneiden Sie es mit einem Skalpell durch. Für die Gruppe Halsband quer und Deltamuskel einen acht Millimeter langen vertikalen Schnitt auf der medialen Haut des rechten Sprunggelenks vornehmen und den DL stumpf vom medialen Knöchel trennen, um ihn zu durchtrennen. Durchtrennen Sie dann das Halsband, wie zuvor gezeigt.
Für die Scheingruppe führen Sie eine Scheinoperation am rechten Sprunggelenk durch. Nachdem Sie den Einschnitt mit steriler normaler Kochsalzlösung gespült haben, vernähen Sie ihn mit einem chirurgischen 5-0-Nylonfaden, gefolgt von der Desinfektion des vernähten Einschnitts mit einem Jodtupfer. Sobald die Schwellung des Winkelgelenks zwei Wochen nach der Operation zurückgegangen ist, trainieren Sie die Mäuse täglich eine Stunde lang in der Maus-Rotationsermüdungsmaschine.
Für den Schwebebalkentest klemmen Sie einen kreisförmigen, um 15 Grad geneigten Holzbalken an einem Ende mit einem Fotostativclip und legen das andere Ende auf eine Arbeitsfläche, die mit einer geschlossenen Kassette verbunden ist. Führen Sie eine Woche vor der Operation ein Schwebebalkentraining durch, um sicherzustellen, dass sich die Mäuse reibungslos von einem Ende des Balkens zum anderen bewegen. Stellen Sie sich vor, dass eine Maus den Test bestanden hat, wenn sie den Strahl zweimal in 60 Sekunden ohne Pause durchläuft.
Besprühen Sie den Schwebebalken nach jedem Versuch mit 75%igem Alkohol, um den Restgeruch der vorherigen Maus von der Beeinflussung der nächsten Maus zu zeigen. Führen Sie den Schwebebalkentest durch und notieren Sie die durchschnittliche Zeit, in der jede Maus zweimal hintereinander den Schwebebalken passiert. Und die Häufigkeit, mit der der rechte Hinterfuß vom Balken rutscht, als abhängige Variablen.
Platzieren Sie für die Fußabdruckanalyse einen U-förmigen Kunststoffkanal auf dem Versuchstisch und verbinden Sie ein Ende des Kunststoffkanals mit einer geschlossenen Kassette. Lege ein einfaches Pigmentpapier flach in den Kanal. Halten Sie dann die Maus mit beiden Händen fest und bemalen Sie die Vorder- und Hinterfüße gleichmäßig mit ungiftigen roten und grünen Pigmenten.
Platzieren Sie nun die bemalte Maus an einem Ende des Kanals und lassen Sie sie zum anderen Ende der Kassette wandern. Nehmen Sie das pigmentierte Papier mit den Fußabdrücken, markieren Sie es und lassen Sie es an einem belüfteten und schattigen Ort trocknen. Besprühen Sie den U-förmigen Kunststoffkanal nach jeder Maus mit 75%igem Alkohol, um zu verhindern, dass der Restgeruch der vorherigen Maus die nächste Maus beeinträchtigt.
Wählen Sie drei aufeinanderfolgende durchsichtige Maus-Footprints auf jedem Papier aus. Messen Sie mit einem Lineal die Schrittlänge des Fußabdrucks des rechten Fußes der Maus mit der Schrittbreite zwischen dem linken und rechten Fußabdruck. Verwenden Sie eine mikroskopisch kleine Pinzette und Schere, um überschüssiges Weichgewebe um die Knöchelproben herum zu entfernen.
Legen Sie dann die Proben in ein Zentrifugenröhrchen, das eine 10%ige EDTA-Entkalkungslösung enthält, und markieren Sie die verschiedenen Gruppen. Als nächstes legen Sie das Zentrifugenröhrchen zur Entkalkung auf einen Rütteltisch. Wechseln Sie die Entkalkungslösung einmal täglich und bestimmen Sie die Entkalkung der Proben.
Nach einem Monat der Entkalkung werden die Proben mit Gradientenalkohol dehydriert und dann acht Stunden lang N-Butanol zur Reinigung verwendet. Zum Schluss werden die gereinigten Proben zum Einbetten in koronaler Position in Paraffin getaucht. Vor dem Schneiden werden die Proben für etwa 10 Minuten aus dem Kühlschrank bei vier Grad Celsius in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius überführt, um den vollständigen Hobelschnitt zu erleichtern.
Fixieren Sie die Proben auf dem Mikrotom und schneiden Sie sie in einer Dicke von sechs Mikrometern. Beobachten Sie gleichzeitig mit einem Mikroskop, ob die Proben auf der erwarteten Höhe geschnitten wurden, um ein leichtes Eindringen einer Spritzennadel in das Knochengewebe zu ermöglichen. Nachdem Sie zwei oder drei vollständige Paraffinabschnitte hintereinander geschnitten haben, geben Sie sie in die auf 40 Grad Celsius eingestellte Tablettenmaschine, um sie vollständig auszudehnen.
Anschließend werden die Paraffinabschnitte mit einem Objektträger entfernt. Markieren Sie abschließend die Folien mit Gruppen und Nummern. Zur Beobachtung der intakten ASCJ-Gelenkstruktur unter dem Mikroskop.
Legen Sie die Abschnitte für 40 bis 50 Minuten in einen Inkubator, der auf 60 Grad Celsius eingestellt ist. Dann die Schnitte dreimal mit Xylol entwachsen, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie die entwachsten Abschnitte zweimal für drei Minuten in 100 % Ethanol, gefolgt von 90 % und 80 % Ethanol für jeweils fünf Minuten.
Waschen Sie die Abschnitte dann fünf Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser. Nachdem Sie eine Minute lang in Hämatoxylin eingeweicht haben, waschen Sie die Abschnitte mit doppelt destilliertem Wasser, bis sie farblos werden. Weichen Sie die Abschnitte 30 Sekunden lang in einer 1%igen Ethanol-Differenzierungslösung ein und waschen Sie sie mit doppelt destilliertem Wasser.
Sobald die Abschnitte mit 1%iger Ammoniaklösung gefärbt und mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen wurden, färben Sie die Proben eine Minute lang mit Eosin-Färbelösung. Und dann geben Sie sie nacheinander für jeweils eine Minute in 95% und 100% Ethanol. Zum Schluss behandeln Sie die Abschnitte eine Minute lang mit Xylol vier.
Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft und decken Sie sie mit einem Deckglas ab, nachdem Sie einen Tropfen Neutralharz auf die Proben auf den Objektträgern geklebt haben. Nehmen Sie dann Bilder mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop im Hellfeld bei fünf und 20X auf. Weichen Sie die Hämatoxylin- und Ammoniak-gefärbten Abschnitte zwei Minuten lang in 0,05%schnellem Grün ein.
Anschließend werden die Abschnitte 30 Sekunden lang in 1%iger Essigsäurelösung und fünf Minuten lang in 0,1%iger Safraninlösung eingeweicht. Verarbeiten Sie dann die Objektträger mit Ethanol und Xylol, wie zuvor gezeigt. Nehmen Sie Bilder mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop im Hellfeld bei 5X und 20X auf.
Nach drei Tagen, acht Wochen und 12 Wochen Operation brauchten die durchtrennten Bändergruppen deutlich länger, um den Schwebebalken zu passieren, als die Scheingruppe. Vor der Operation war die Schrittlänge des rechten Hinterfußes in den drei Mäusegruppen vergleichbar. 12 Wochen nach der Operation war die Schrittlänge jedoch in der Gruppe mit dem Bänderschnitt kürzer als in der Scheingruppe.
Vor der Operation ist die thermische Nozizeptionsreaktionszeit der Mäusefüße während der Aktivität in den drei Mäusegruppen ähnlich. Nach der Operation zeigten die Mäuse in der Gruppe mit dem Bänderschnitt längere Reaktionszeiten im Vergleich zur Scheingruppe. Der ASCJ des rechten Hinterfußes bei durchtrennten Bandgruppen zeigte raue Oberflächen, Osteophytenansammlungen, degenerative Veränderungen.
Und einen signifikant höheren Knochenvolumenanteil als in der Scheingruppe. Die Knorpelschicht des ASCJ in der Gruppe der Banddurchschnitte zeigte eine Diskontinuität und eine verringerte Anzahl von Chondrozyten. Auch die Werte der Malkin and Osteoarthritis Research Society International der Mäuse mit Bänderamputation waren signifikant höher als in der Scheingruppe.
Das Typ-2-Kollagen in der ASCJ-Gelenkknorpelschicht des rechten Hinterfußes der Scheingruppe war gleichmäßiger und höher als bei den beiden Gruppen von Mäusen mit durchtrennten Bändern. Diese Studie kann für die Diagnose und Behandlung der Sprunggelenkinstabilität verwendet werden und bietet eine experimentelle Referenz für die klinische Behandlung dieser Krankheit.
