Wir danken den Mitgliedern der Marder Lab. Wir danken unseren Berater, Dr. Eva Marder, für ihre Unterstützung und Ermutigung. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grants NS-17813 und NS-058110 gefördert.

1. Gross Dissection <ol><li> Legen Sie eine Krabbe auf Eis für 30 Minuten zu langweilig die sensorischen und motorischen Systemen des Tieres. Surround es von allen Seiten mit Eis. Die Handschuhe sollten bei der Handhabung des Krabben werden. </li><li> Bereiten Sie sich auf die Brutto-Dissektion durch Auslegen der Dissektion Pfanne und Werkzeuge, die Sie verwenden möchten. Rongeure sind Knochen schneiden Schere, eine kleine Schere, gezahnte Pinzetten, Spatel mit einem sich verjüngenden Rand, eine schwarze Sylgard-beschichtete Schale, und Insekten Pins benötigt werden. </li><li> Entfernen Sie die Katze aus dem Eiskübel durch seine Hinterbeine, um es von nicht gequetscht wird und es in der Sektion Pfanne. </li><li> Entfernen Sie die Krallen erst durch Verdrehen jeweils nach innen. Dann entfernen Sie jedes Bein mit der gleichen Drehbewegung. </li><li> Mit dem Rongeure, entfernen Sie den Oberkiefer für den Mund. Entfernen Sie auch die weichen maxillule. </li><li> Mit dem Rongeure wieder von den seitlichen hinteren Ende des Panzers zu starten und einen guten Halt auf der Kante ist. Einen Riegel vorschieben mit dem Rongeure und brechen das Stück des Panzers aus. Achten Sie darauf, genug des Panzers zu entfernen, damit der Spachtel auf die Öffnung geben. Entfernen Sie weiterhin den Rand des Panzers bis zu den Augen und wiederholen Sie auf der anderen Seite. </li><li> Mit der verjüngten Seite des Spatels vorsichtig kratzen die weiche innere Gewebe vom Dach des dorsalen Panzer. Halten Sie den Spachtel in Kontakt mit dem Panzer um eine Beschädigung der Tln. Verwenden Sie die Rongeure zu brechen die Teile des Panzers, die aus dem Gewebe getrennt wurden. Auch separaten einige der Weichgewebe von der ventralen Carapax achten Sie darauf, keine Adduktoren Befestigung des Gewebes auf den Panzer zu trennen. </li><li> Brechen Sie die dorsale Carapax so weit posterior als das Herz, wenn es zwei kleine Knöchelchen ragt aus dem Panzer. Cut soweit vorderen wie möglich. Stabilisieren Sie die Cephalon (das &quot;Gesicht&quot;) mit einem Finger, während Loslösung der vorderen Teile der dorsalen Panzer. </li><li> Auf der Bauchseite des Panzers, ziehen Sie den Unterkiefer ein zu einer Zeit durch die Verankerung der Rongeure auf einen Unterkiefer, das Drehen von ihnen nach außen, um den Unterkiefer aus den beigefügten Epistom zu vertreiben, und zieht ihn weg. Zwei lange Gehörknöchelchen mit Muskeln sollten die extrahierten Unterkiefer angebracht sein, wenn man es richtig macht. </li><li> Separate weg das Gewebe an den Seiten des Cephalon in der Nähe der Augen mit dem Spatel. Mit kleinen Dissektion Schere, über das Gewebe möglichst nahe am Grat des Gehörknöchelchen geschnitten wie möglich Schicht für Schicht. </li><li> Rest der Krabben gegen eine Wand der Dissektion Pfanne und stützt es die Sicherung es im Ort (die Krallen können für diese verwendet werden). Schneiden Sie das Labrum (&quot;upper lip&quot;) vom Epistom darf dabei nicht verlassen jedes Gewebe angebracht. Mit Knochen-Scherenschnitt machen zwei diagonale Schnitte in die ventralen Carapax, die Cephalon entfernen. </li><li> Nehmen Sie das Labrum mit gezahnten Pinzette und schneiden das Labium (&quot;Unterlippe&quot;) weg von der Gehörknöchelchen auf der Bauchseite. Dann heben die Lippe vom übrigen ventralen Carapax. Verwenden Sie die kleine Schere zum ventralen Teil des Magens aus dem Gewebe Innenfutter des Panzers zu trennen. Wenn der Pylorus Ampullen sichtbar sind, schneiden Sie den Bauch weg aus dem Gewebe auf beiden Seiten, bis der Magen von der Krabbe gewonnen wird. </li><li> Dennoch hält der Magen durch die Lippe mit einer Pinzette, Rest des Magens gegen die Handfläche und gießen in den Mund Kochsalzlösung. Dies erweitert den Magen und macht es einfacher, aufgeschnitten. Cut aus der Öffnung an der Mündung nach unten zwischen den Pylorus quer durch die Gehörknöchelchen zwischen den Ampullen. Dann schräg nach unten schneiden durch die beiden kardialen Äste. Schneiden Sie die Spitzen der drei Zähne im Inneren des Magens. </li><li> Setzen Sie den Magen auf eine große, schwarz, Sylgard-beschichtete Platte mit der Innenseite des Magens nach unten. Pin auf der fünf Ecken der Zubereitung mit dem Insekten-Pins und füllen Sie die Schale mit kalter Kochsalzlösung, das Eintauchen des gesamten Vorbereitung (siehe Abbildung 1). </li></ol> 2. Feine Dissection <ol><li> , Micro-Dissektion Werkzeuge sind für die feinen Sezierung benötigt. Insbesondere sind Pinzette und Schere Frühjahr sowie eine Pin-Halter mit einer Wolfram-Nadel benötigt wird. Eine klare, Sylgard-beschichtet, Petrischale und einige feine Drahtstifte sollten auch bereit gewesen. </li><li> Beginnend auf der untersten Vergrößerung durch Pinning Sie die Klappen in der Nähe der Lippe, die die Mundöffnung verwendet werden beginnen. Ordnen Sie den Rest des Pins, um die Vorbereitung straff und Pin anderen Bereichen notwendig. </li><li> Heben Sie den gefleckten Unterhaut für den unteren Teil der Vorbereitung und schneiden Sie es in ganz verlassen ein Stück Unterhaut mit zwei weißen Punkten. </li><li> Peel die gelbe, wispy, häutigen Gewebe in der Nähe der Unterseite der Vorbereitung. Die mvns schwach an der Unterseite dieses Gewebes angebracht. Sorgfältig trennen die mvns aus dem gelben Gewebe, wie es ist nach oben gezogen. Folgen Sie den gelben Gewebe zerschnitten und zusammen mit dem Gehirn. </li><li> Folgen Sie den dicken Prozesse Verlassen des Gehirns, erweitern laterally. Dies sind die commisural Nerven. Nach dem Ende des kommissuralen Nerven erreicht ist, entfernen Sie die Masse schwammig, off-white Gewebe weggeschnitten ist von der Seite des Gehirns. </li><li> Wo die Ionen und die Söhne der Koggen treffen, schneiden Sie die Muskeln und Gewebe, um die Länge der Ionen und Söhne zu offenbaren. </li><li> Return to the spotted Unterhaut Patch und hau sie ab. Dies sollte zu verlassen eine Öffnung in der Arterie um die STG. Cut durch die Öffnung zu den beiden Muskeln, die Flanke des STG zu trennen. Heben Sie die Enden dieser Muskeln und schneiden direkt unter ihnen ihnen von der Arterie zu trennen und die alns und AGNs aussetzen. Trennen Sie die flankierenden Muskeln so weit als der Knorpel, der über dem stn. </li><li> Schneiden Sie das arterielle Gewebe rund um das STG nach unten, wo die mvns, DGN, und dvn gerecht zu werden. Die Arbeit auf der dvn die lvns und Durchtrennung der weißlichen, zarten Gewebe für den lvns. </li><li> Suchen Sie den psn über die Gehörknöchelchen in der Nähe der Unterseite der Vorbereitung. Die psn kann die lvn und dlvn Kreuzung zu lokalisieren. </li><li> Als nächstes folgen die dlvn bis zum PYN und pdn finden. Die PYN oft Packungen über den Pylorus Ampulle zur Eröffnung. Die pdn zweigt der dlvn und ist zwischen den Pylorus Ampulle und das Herz Pylorus Ventil Muskeln. Lassen Sie einige Muskeln an einer dieser Nerven, weil sie leicht verwechselt werden können, wenn die Vorbereitung auf die klare Sylgard Gericht übertragen wird. </li><li> Wenn alle die Nerven freigelegt, sever verbleibenden Verbindungen zwischen den Tln und das Gewebe und unerwünschte Nerven des Magens. Bringen Sie den Tln vom Rest des Magens, Schneiden jede verpasste Anschlüsse. </li><li> Zustand der klaren Sylgard Gericht mit der übrigen Masse des Magengewebes durch Reiben über die Oberfläche des Sylgard bis Sylgard fühlt sich nicht mehr zu klebrig oder trocken. Sylgard ist hydrophob und die Tln wird stark haften, wenn die Sylgard-beschichtete Spiegel ist nicht in dieser Weise konditioniert. </li><li> Fügen Sie einige kalte Kochsalzlösung in die Schale. Besorgen Sie sich die oberen Enden der kommissuralen Nerven mit einer Pinzette und bringen die Tln die klare Sylgard Gericht. </li><li> Pin der Tln nach unten auf die Sylgard. Sever das Gehirn aus dem kommissuralen Nerven und die minuten Stifte zu den vier Enden der Zähne sich zuerst zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Vorbereitung der rechten Seite wird durch die Überprüfung, dass die ivn nach oben zeigt weg von der Sylgard. Die DGN sollte leicht Ausfahrt unter der STG, wenn die STG ist rechts oben. Pin den Rest der Nervenenden sich mit dem feinen Draht Stifte. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig jede verbleibende Muskeln oder Gewebe aus dem Tln. </li><li> Desheath die STG mit einem Stifthalter und ein leicht süchtig, fein, Wolframnadel. Machen Sie ein kleines Loch in einer Ecke des STG Scheide vom Zellkörper und die Nutzung dieses Loch zwischen den Schichten des Mantels zu bekommen. Schneiden Sie vorsichtig eine Klappe getrennt Mantel der STG Neuropil und Zellkörper aussetzen. </li><li> Pin keine Klappen der Scheide nach unten, um die Zugänglichkeit zu den Zellkörper zu erhöhen und die STG für intrazelluläre Ableitungen zu stabilisieren. Re-pin den Rest der Tln sicherzustellen, dass jeder Nerv angespannt ist und gut für die extrazelluläre Aufnahme (siehe Abbildung 3) angeordnet. </li></ol> 3. Ergebnisse <ol><li> Im Idealfall sollten alle von den Nerven frei von Kerben und Schäden, insbesondere diejenigen, die aus aufgenommen wird. Keiner der Nerven sollten verheddert oder verdreht werden. Die STG sollte intakt sein mit all der Zellen in einen Bart Formation um das Neuropil angeordnet. Die intakte Tln ist bilateral symmetrisch und sieht aus wie ein Homunculus mit der lvns als die Beine, die mvns wie die Arme und das vordere Ende wie der Kopf. </li></ol> Abkürzungen: <table border="1"><tbody><tr><td> Tln </td><td> Stomatogastrischen Nervensystems </td></tr><tr><td> STG </td><td> Stomatogastrischen Ganglion </td></tr><tr><td> CoG </td><td> Kommissuralen Ganglion </td></tr><tr><td> OG </td><td> Ösophagus Ganglion </td></tr><tr><td> mvn </td><td> Median ventrikuläre Nerven </td></tr><tr><td> Ion </td><td> Inferior ösophagealen Nerven </td></tr><tr><td> Sohn </td><td> Überlegene ösophagealen Nerven </td></tr><tr><td> agn </td><td> Magenvorderwand Nerven </td></tr><tr><td> aln </td><td> Vorderen seitlichen Nerven </td></tr><tr><td> dgn </td><td> Dorsal Magen Nerven </td></tr><tr><td> dvn </td><td> Dorsal ventrikuläre Nerven </td></tr><tr><td> lvn </td><td> Lateral ventrikuläre Nerven </td></tr><tr><td> psn </td><td> Posterior Magen Nerven </td></tr><tr><td> PYN </td><td> Pylorusstenose Nerven </td></tr><tr><td> pdn </td><td> Pylorusstenose Dilatator Nerven </td></tr><tr><td> dlvn </td><td> Dorsalen Ast der lateralen Ventrikel Nerven </td></tr><tr><td> ivn </td><td> Inferior ventrikuläre Nerven </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1207/figure_1_90ppi.jpg" alt= &quot;Abbildung 1&quot; /&gt; Abbildung 1: Schematische Darstellung der ungefähren Position des Tln in den Magen vor Dissektion. <img src="/files/ftp_upload/1207/figure_2_90ppi.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung der verschiedenen Muskeln im unteren Teil des Magens und eine Überlagerung der Tln in hellgrün. Jeder Zelltyp in der STG ist mit den Muskeln sie bekannt zu innervieren aufgeführt sind. Diese Karte ist hilfreich bei der Planung zu einem Nerv, der ein Signal von einer Zelle (mit freundlicher Genehmigung des Nadim lab) führt zu sezieren. <img src="/files/ftp_upload/old/1207_2009_1_12_5/figure_3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Schematische Darstellung der Tln mit intrazellulären Elektroden und extrazellulären Brunnen (von Marder und Bucher, 2007).

<ol>
	<li>Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , (1992).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs.">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li><li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus,+Homarus+Americanus+and+Panulirus+argus+(Decapoda+crustacean).">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).</li><li>Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stomatogastric+Nervous+System:+Structure+and+function+of+a+small+neural+network.">The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network.</a> Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).</li></ol>

Die Tln Dissektion ist der erste Schritt in der Durchführung einer elektrophysiologischen oder Immunhistochemie Experiment, oder zur Gewinnung von Zellen für die Zellkultur. Unabhängig von der beabsichtigten Experiment werden die Brutto-Dissektion bleiben unverändert. Allerdings können die feinen Sezierung variieren. Es ist wichtig, vor der Zeit, die Zellen und die Nerven Sie von Datensatz planen. Die meisten Neuronen in der STG haben Prozesse, die mindestens einen Muskel innervieren in den Magen (siehe Abbildung 2...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Black Sylgard 170</td>
<td>Other</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>170</td>
<td>Gross Dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine Scissors</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>14090-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect Pins size 6</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>26000-65</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mayo Scissors</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>14110-17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Spatula</td>
<td>Surgery</td>
<td>Ward Sci.</td>
<td>15 V 4313</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rongeurs</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>16000-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Forceps</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>11021-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter)</td>
<td>Surgery</td>
<td>California Fine Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps #5</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>91150-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minuten Pins</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Moria Spring Scissors (7mm blades)</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>15370-52</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri Dish (100x15mm)</td>
<td>Other</td>
<td>Fischer	</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pin Holder</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>26018-17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Super fine forceps #5SF</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 182</td>
<td>Other</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>182</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten Needles</td>
<td>Surgery</td>
<td>FST</td>
<td>10130-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Wild</td>
<td>MC3</td>
<td>Misc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Jonah Crab (C. borealis)</td>
<td>Animal</td>
<td>Commercial Lobster</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
						
		</div>

cancer borealis stomatogastric nervous system dissection

Die stomatogastrischen Ganglion (STG) ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung zellulärer und Netzwerk-Interaktionen, da es eine relativ kleine Anzahl von Zellen (ca. 25 in C. borealis), die gut charakterisiert sind enthalten. Die Zellen in der STG zeigen eine breite Palette an Ausgängen und sind verantwortlich für die motorische Handlungen des Magens. Der Magen enthält die Magenmühle die bricht Essen mit drei internen Zähnen und dem Pylorus, die das Lebensmittel-Filter, bevor sie den Mitteldarm erreicht. Die STG stellt zwei rhythmische Ausgänge zu den Magenmühle und Pylorus als central pattern generators (CPG) bekannt zu kontrollieren. Jede Zelle in der STG kann in einem oder beiden dieser Rhythmen zu beteiligen. Diese Leitlinien erlauben für das Studium der Neuromodulation, Homöostase, Mobilfunk-und Netzwerk-Variabilität, Netzwerk-Entwicklung sowie Netzwerk Erholung. Die Zerlegung der stomatogastrischen Nervensystems (Tln) aus dem Jonah Krabbe (Cancer borealis) ist in zwei Teile gemacht, die grobe und feine Dissektion. In der Brutto-Dissektion der gesamten Magen ist von der Krabbe seziert. Während der feinen Sezierung der Tln wird aus dem Magen mit einem Dissektionsmikroskop und Mikro-Dissektion-Tools (siehe Abbildung 1) extrahiert. Die Tln umfasst die STG, die ösophageale Ganglion (OG) und die kommissuralen Ganglien (CoG) sowie die Nerven, die die Bauchmuskulatur innervieren. Hier zeigen wir, wie eine komplette Zerlegung der Tln in Vorbereitung für eine elektrophysiologische Experiment, bei dem die Zellen in der STG von intrazellulär und der peripheren Nerven erfasst werden durchführen würde für extrazelluläre Ableitungen verwendet werden. Die richtige Technik für das Finden der gewünschten Nerven sowie unsere Technik der desheathing das Ganglion der Somata und Neuropil offenbaren gezeigt.

Watch this Scientific Journal Video about Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection at JoVE.com

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Die stomatogastrischen Nervensystems (Tln) des Jonah Krabbe (<em&gt; C. borealis</em&gt;) Kann für die Elektrophysiologie, Immunhistochemie und Zellkultur-Studien verwendet werden. Die Tln-Extraktion ist in zwei Teile gemacht: die Brutto-und feinen Sezierung.

Cancer Borealis stomatogastrischen Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

cancer-borealis-stomatogastric-nervous-system-dissection

Research

JoVE Journal

Biology

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

12.4K Aufrufe.  Brandeis. Die stomatogastrischen Nervensystems (Tln) des Jonah Krabbe ( C. borealis) Kann für die Elektrophysiologie, Immunhistochemie und Zellkultur-Studien verwendet werden. Die Tln-Extraktion ist in zwei Teile gemacht: die Brutto-und feinen Sezierung.

Serie: Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection von Drosophila Ovarien

Forschung

Biologie

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the immune response to an infection of the CNS, such as poliomyelitis, Lyme neuroborreliosis, or neurosyphilis, it is often necessary to isolate the CNS-infiltrating immune cells.
In this video-protocol we demonstrate how to isolate mononuclear cells (MNCs) from the CNS of a rat with EAE. The first step of this procedure requires a cardiac perfusion of the rodent with a saline solution to ensure that no blood remains in the blood vessels irrigating the CNS. Any blood contamination will artificially increase the number of apparent CNS-infiltrating MNCs and may alter the apparent composition of the immune infiltrate. We then demonstrate how to remove the brain and spinal cord of the rat for subsequent dilaceration to prepare a single-cell suspension. This suspension is separated on a two-layer Percoll gradient to isolate the MNCs. After washing, these cells are then ready to undergo any required procedure. 
Mononuclear cells isolated using this procedure are viable and can be used for electrophysiology, flow cytometry (FACS), or biochemistry. If the technique is performed under sterile conditions (using sterile instruments in a tissue culture hood) the cells can also be grown in tissue culture medium. A given cell population can be further purified using either magnetic separation procedures or a FACS.

In this video we demonstrate how to isolate mononuclear cells from the central nervous system of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis.

Isolierung von mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit EAE

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

With the goal of understanding how nervous systems produce activity and respond to the environment, neuroscientists turn to model systems that exhibit the activity of interest and are accessible and amenable to experimental methods. The stomatogastric nervous system (STNS) of the American lobster (Homarus americanus; also know was the Atlantic or Maine lobster) has been established as a model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation of networks. The STNS consists of 3 anterior ganglia (2 commissural ganglia and an oesophageal ganglion), containing modulatory neurons that project centrally to the stomatogastric ganglion (STG). The STG contains approximately 30 neurons that comprise two central pattern generating networks, the pyloric and gastric networks that underlie feeding behaviors in crustaceans1,2. While it is possible to study this system in vivo3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. Physical isolation of the STNS in a dish allows for easy access to the somata in the ganglia for intracellular electrophysiological recordings and to the nerves of the STNS for extracellular recordings. Isolating the STNS is a two-part process. The first part, dissecting the stomach from the animal, is described in an accompanying video article4. In this video article, fine dissection techniques are used to isolate the STNS from the stomach. This procedure results in a nervous system preparation that is available for electrophysiological recordings.

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

We describe the fine dissection of the stomatogastric nervous system from the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Homarus americanus stomatogastrischen Nervous System Dissection

With the goal of understanding how nervous systems produce activity and respond to the environment, neuroscientists turn to model systems that exhibit the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other malignancies of the same tissue type, often in a nearby location. Such field defects have been indicated in colon cancer. The molecular abnormalities that are responsible for a field defect in the colon should be detectable at high frequency in the histologically normal tissue surrounding a colonic adenocarcinoma or surrounding an adenoma with advanced neoplasia (well on the way to a colon cancer), but at low frequency in the colonic mucosa from patients without colonic neoplasia.
Using immunohistochemistry, entire crypts within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas or advanced colonic neoplasias were found to be frequently reduced or absent in expression for two DNA repair proteins, Pms2 and/or ERCC1. Pms2 is a dual role protein, active in DNA mismatch repair as well as needed in apoptosis of cells with excess DNA damage. ERCC1 is active in DNA nucleotide excision repair. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 would create cells with both increased ability to survive (apoptosis resistance) and increased level of mutability. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 is likely an early step in progression to colon cancer.
DNA repair gene Ku86 (active in DNA non-homologous end joining) and Cytochrome c Oxidase Subunit I (involved in apoptosis) had each been reported to be decreased in expression in mucosal areas close to colon cancers. However, immunohistochemical evaluation of their levels of expression showed only low to modest frequencies of crypts to be deficient in their expression in a field defect surrounding colon cancer or surrounding advanced colonic neoplasia.
We show, here, our method of evaluation of crypts for expression of ERCC1, Pms2, Ku86 and CcOI. We show that frequency of entire crypts deficient for Pms2 and ERCC1 is often as great as 70% to 95% in 20 cm long areas surrounding a colonic neoplasia, while frequency of crypts deficient in Ku86 has a median value of 2% and frequency of crypts deficient in CcOI has a median value of 16% in these areas. The entire colon is 150 cm long (about 5 feet) and has about 10 million crypts in its mucosal layer. The defect in Pms2 and ERCC1 surrounding a colon cancer thus may include 1 million crypts. It is from a defective crypt that colon cancer arises.

Reduced/absent expression of Pms2 and/or ERCC1 in entire crypts is a frequent event within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas, likely the basis of a field defect with high mutability and progression to cancer. Deficiency in Ku86 or CcOI is much less frequent in these field defects.

Mangelhafte PMS2, ERCC1, Ku86, CCOI in Field Mängel bei der Progression zu Darmkrebs

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native receptor and the ligand are challenging since the ligand of a specific receptor may be unknown and experimental procedures with the native ligand can be technically complicated. To address these obstacles, we describe a reporter system to detect the binding and activation of a specific receptor by a ligand of interest. In this reporter system, the extracellular domain of a specific receptor is conjugated to mouse CD3&#950; and this chimeric protein is then expressed in mouse BW cells. These transfected BW cells can then be incubated with different targets (e.g., cells or antibodies). Activation of a transfected receptor leads to the secretion of mouse interleukin-2 (mIL-2) which can be detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This reporter system has the advantages of being sensitive and specific to a single receptor. In addition, the activation level of a specific receptor can easily be quantified and can be used even in cases where the ligand of the receptor is unknown. This system has been implemented successfully in many of our studies to characterize receptor-ligand interactions. We have recently employed this system to study the activation of human Fc&#947; receptors (Fc&#947;Rs) by different monoclonal anti-CD20 antibodies in clinical use.

This protocol describes how to establish a reporter system that can be used to identify and quantify receptor-ligand interactions.

Ein BW-Reporter-System für das Studium-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...