Wir danken S. Jinks Robertson und E. Heidenreich für die Bereitstellung von Plasmiden und Hefestämme; P. Pham und MF Goodman um Hilfe withthe TLS-Assay. Diese Arbeit wurde unterstützt, zum Teil von der American Federation für Alternsforschung zu gewähren und durch NIH AG20642, AG025135.

Zwei Lebensdauer Modelle eingesetzt, um Studie Altern in S. cerevisiae: RLS und CLS. Die replikativen (angehende) Lebensdauer (RLS) ist die Beobachtung, dass Hefe Mutter-Zellen eine endliche Anzahl von Divisionen 3-6 unterziehen basiert. Wir werden uns auf die chronologische Lebensspanne (CLS), ein Modell, das auf die chronologische Überleben der nicht-teilenden Hefe in der Kultur oder auf Platten 7-11 Basis zu konzentrieren. Wildtyp-Hefe wächst exponentiell für 10-12 Stunden in synthetischer Dextrose komplett (DEZA) Medium . Wenn Blutzuckerspiegel senkt, Hefe-Switches aus der Fermentation, um die Atmung, bezeichnet einen Prozess diauxisches verschieben. Cells weiterhin langsam teilen während der post-diauxisches Phase für rund 48 Stunden vor der Einfahrt G 0 zu verhaften. Die metabolische Rate der Zellen bleibt hoch bis zum Tag 5-6 (Tag 0 ist die Impfung Tag). Die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Zeit kann durch den Prozentsatz der chronologisch alternden Zellen abgetastet alle zwei Tage, die G 0 Verhaftung und bilden Kolonien, die auf reiche YPED Platten Ausfahrt zugegriffen werden kann. 1. Hefe chronologische Lebensspanne (CLS) in flüssiger Kultur <ol><li> Impfen einer einzigen Kolonie in 1 ml synthetischen vollständigen Glucose-Medium (SDC, Tabelle 1) beimpft und über Nacht unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Drei Impfkulturen von unabhängigen Kolonien sollten für jeden Stamm der biologischen Replikate bieten vorbereitet werden. </li><li> Verdünnen Sie die Übernacht-Kultur in frische DEZA Medium (meist 10 ml) bis OD = 0,05-0,1 (~ 1:100 Verdünnung) und inkubieren unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Dieser Zeitpunkt gilt als Tag 0 der chronologischen Alterung. Pflegen Sie ein 1:5-Verhältnis von Kultur / Flasche Volumen (10 ml Kultur in 50 ml, oder auch für längere / große Experimente 25 ml Kultur in 125 ml), um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten. </li><li> Ab Tag 3, zu entfernen 2 Aliquots von 10 ul aus dem Kolben, verdünnen 10.000 Mal in autoklaviert Wasser, 10 ul verdünnt Kultur (dh 10 4 -10) auf YEPD (1% Hefeextrakt, 2% Bacto Pepton, 2% Dextrose , 2% Agar) Platten, und inkubieren Sie bei 30 ° C für 48-72 Stunden vor dem Kolonie-bildenden vereinen (CFU) gezählt wird. </li><li> Tag 3 CFU gilt als 100% ige Überlebensrate. Verdünnungsfaktoren des Alterns Kultur in den folgenden Tagen sollte entsprechend angepasst werden, um ~ 20-100 Kolonien in der CFU-Assay (zB 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, etc.) zu gewährleisten. Für Wildtyp-Zellen in der DBY746 Hintergrund erreicht der CLS 1% Überlebensrate um Tag 11. </li></ol> Variationen in situ Lebensfähigkeit Assay sind: <ul><li> Kalorienreduktion (CR) von Glukose Einschränkung. Verdünnung der Übernacht-Kultur in Glukose begrenzt SC Medium (z. B. 0,5 oder 0,05% statt der üblichen 2% Glucose) in der Regel zu niedrigeren Bevölkerung Sättigungsdichte am Tag 3 führen, aber viel längeren mittleren und maximalen (10% Überlebensrate) Lebensdauer 12. </li><li> Für extreme CR / Hunger, waschen Tag 3 stationäre Phase Kultur (in der Regel 10 ml, wie in Schritt 3 oben) mit autoklaviertem Wasser (die Zellen in dem gleichen Volumen Wasser und Spin-Down bei 2500 rpm für 5 min, 3 Mal wiederholen). Incubationof Zellen in Wasser ahmt die Hungersnot der Bedingung, dass Hefe kann in freier Wildbahn zu begegnen. Alle zwei Tage später sollte alternden Kultur mit autoklaviertem Wasser gewaschen und erneut in dem gleichen Volumen Wasser, um alle Nährstoffe aus lysierten toten Zellen freigesetzt zu entfernen. Führen Sie die Lebensfähigkeit Assay durch Abtasten des alternden Kultur wie oben beschrieben. Dieser Hunger Bedingung wird auf fast eine Verdopplung der mittleren CLS im Wildtyp DBY746 Stamm 12 geführt. </li></ul> 2. In situ Lebensfähigkeit Test In den flüssigen Kultur, ein kleiner Bruchteil der überlebenden Zellen kann erneut eingegeben werden den Zellzyklus und wachsen Nutzung verbleibenden Nährstoffe oder Freigelassenen Form lysiert toten Zellen in das Medium, ein Phänotyp Nachwachsen bezeichnet / keuchend 13. Wir entwickelten eine Lebensfähigkeit-on-a-Plate-System, dass die Auxotrophie des DBY746 Stamm (trp1) nutzt, um das Nachwachsen / keuchend Problem zu umgehen und erlauben auch die Prüfung der Wirkung von konstanten Exposition oder der Entzug der verschiedenen externen Nährstoffen oder Reize auf Hefe CLS 11. Diese in situ Lebensfähigkeit Assay auch imitiert die replikativen Lebensspanne Modell, so dass Zellen werden ständig reichlich Nährstoffe für die Dauer der Lebensspanne Analyse ausgesetzt. <ol><li> Impfen einer einzigen Kolonie in 1 ml synthetischen vollständigen Glucose-Medium (DEZA) beimpft und über Nacht unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Mindestens drei Impfkulturen von unabhängigen Kolonien sollten für jeden Stamm der biologischen Replikate bieten vorbereitet werden. </li><li> Lassen Sie die Kultur auf ~ 10 8 Zellen / ml (OD 600 = ~ 10) wachsen, verdünnen culturewith autoklaviertem Wasser auf 100-200 cell/10 ul (meist 10 4-fach verdünnt) und 1.000 Zellen/10 ul (10 3 -fachen Verdünnung). </li><li> Platte zwei Aliquots von 10-30 ul der verdünnten Kultur auf einen Tryptophan-Dropout DEZA Platte. Fürr jeden Stamm, bereiten eine Reihe von 8 bis 20 Platten und beschriftet nach Plattierungsdichte (z. B. 10 4-fach verdünnt, Platte 10 ul oder 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , etc.), die sicherstellen, 10-100 Kolonien in Erwartung einer verringerten Lebensfähigkeit kann während des Alterns gezählt werden. </li><li> Die Platte bei 30 ° C für die Dauer der Lebensspanne Analyse. </li><li> Am Tag der Beschichtung und alle 2 Tage später, entfernen Sie eine Platte und tropfenweise mit 0,5 ml Tryptophan (2 mg / ml), damit lebensfähige Zellen zu wachsen. Die Platte bei 30 ° C für weitere 48-72 Stunden. Zählen Sie die KBE Lebensfähigkeit am Tag der Tryptophan hinaus. Die CFU am Tag der Beschichtung wird als 100% ige Überlebensrate. </li></ol> Variationen in situ Lebensfähigkeit Assay sind: <ul><li> Age-Zellen auf Agarplatten (extreme Hunger-Bedingung). 1 ml 2x YPED statt Tryptophan an den nachfolgenden Tagen zu Wachstum und CFU zählen 14 zu ermöglichen. </li><li> Age-Zellen auf Platten mit dem Tryptophan-Dropout synthetischen Vollmedium mit verschiedenen Kohlenstoff-Quellen, zB verschiedenen Konzentrationen von Glukose (Kalorienreduktion durch Glukose Begrenzung), verschiedene Kohlenstoffquellen wie Ethanol, Glycerin, Essigsäure 14. 1 ml Glucose / Tryptophan-Lösung (20% Glucose und 1mg/ml Tryptophan), um Wachstum und CFU zählen können. </li><li> Andere Nährstoffe Manipulation, wie zum Beispiel Stickstoff. </li></ul> 3. DNA-Schäden und Mutationen Frequenz bei chronologischer Alterung Canavanin Widerstand (Can r) und can1 Sequenzierung Spontanmutationshäufigkeit kann durch Messung der Frequenz von Canavanin Widerstand (Can r) in chronologischer Alterung Kulturen ausgewertet werden. Mutationen in den CAN1 (YEL063) Gen, das die Plasma-Arginin-Permease kodiert, render Zellen resistent gegenüber der Arginin-Analogon L-canavanine.Can r Kolonien zu verschiedenen Zeitpunkten erhoben werden, auch kann für die Extraktion von genomischer DNA und anschließende Sequenzierung des CAN1 gespeichert werden Gen, das Mutationsspektrum Daten (mit Mutation Surveyor, SoftGenetics) bieten kann. Basensubstitutionen (Trp + Rückfälle) Stämme mit trp1-289 enthalten eine Amber-Mutation (C403T) im TRP1-codierende Sequenz. Messung der Frequenz von TRP1-289 zu Trp +-Reversion-15 ermöglicht die Abschätzung der Basenaustausch Rate während Hefe chronologischer Alterung. Frame-shift-Mutationen Die Lys - Stamm EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) birgt ein lys2ΔBgl II Mutation, die durch Einsetzen 4 Nukleotide eine Bgl II Restriktionsenzymstelle in der LYS2 Gen erstellen gebaut wurde . Die daraus resultierenden vier Verschiebung in den offenen Leserahmen Ergebnisse in Auxotrophie für Lysin, die durch kleine Einfügen / Löschen Mutationen 16-17 rückgängig gemacht werden kann. Gross chromosomale Umlagerungen (GCRs) Zur Erkennung grober chromosomale Umlagerungen (GCRs) erzielten wir einen mutierten Stamm, in dem HXT13 (YEL069), kodierend für eine hoch redundante Hexose-Transporter wurde von einem URA3 Kassette 18 unterbrochen. HXT13 liegt 7,5 kb Telomer zu CAN1 auf Chromosom V. Mutationen in beiden CAN1 und URA3-Gene machen Zellen Resistenz gegen L-Canavanin und 5-Fluororotsäure (5FOA) bzw.. Angesichts der niedrigen Frequenz von Punktmutationen, die in beide Gene, die Analyse der Can r 5FOA r Frequenz auftreten liefert eine Schätzung der GCRs dazu führen, dass der Verlust der beiden Gene. Homologe Rekombination und homeologous Zur Überwachung der Ebene der homologen (100%) und homeologous Rekombination (91%) bei chronologischer Alterung erzielten wir Mutanten, in denen linearisierten Plasmide (HIS3: Intron-IR-URA3), der entweder zu 100% homologen inverted repeats (IRs) (pSR406 ) oder 91% homeologous IRs (pSR407) am HIS3-Locus 19. Rekombination zwischen der IRS ermöglicht die Expression von funktionellen His3 Protein. <ol><li> Parallel zur normalen Lebensfähigkeit Assay (wie oben beschrieben), zu entfernen eine entsprechende Menge an Zellen aus der Alterung der Kultur, <ol><li> Can r Mutation, die mit ~ 2x10 7 Zellen (200 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für Trp +-Reversion, mit ~ 10 8 Zellen (500-1000 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für Lys + frame-shift Mutation, die mit ~ 10 8 Zellen (500-1000 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für GCRs, mit 2-3x10 8 Zellen (2-3 ml Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für die homologe Rekombination und homeologous, mit &amp; Tilde beginnen; 5x10 7 Zellen (200-500 ul von Tag 3 Kultur); </li></ol> Einstellung der Beschichtung Betrag entsprechend der Abnahme des Gesamt-Rentabilität und die Erhöhung der Mutationsrate bei chronologischer Alterung (Tabelle 2). Im Falle von Stämmen mit hypermutator Phänotyp (wie jene, mit Defiziten in der DNA-Reparatur), reduzieren Sie die Sampling-Betrag entsprechend. </li><li> Pellet die Zellen mit Tischzentrifuge Maschine (6000 rpm für 5 min). </li><li> Die Zellen in 1 ml autoklaviertem Wasser und Pellet die Zellen wieder. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 100 l Wasser. Platte Zellen, <ol><li> Can r Mutation, auf Arginin-Dropout-synthetischen Vollmedium-Platten (SDC-Arg, ergänzt mit 60 ug / ml L-Canavanin Sulfat); </li><li> für Trp + Reversion auf Tryptophan-Dropout-Platten (SDC-Trp); </li><li> für Lys + frame-shift Mutation, auf Lysin-Dropout-Platten (SDC-Lys); </li><li> für GCRs, auf Arginin-Dropout-Platten (SDC-Arg) mit 5FOA (1 mg / ml) und L-Canavanin Sulfat (60 pg / ml) ergänzt; </li><li> für die homologe Rekombination und homeologous auf Histidin-Dropout-Platten mit Galaktose (2%) ergänzt. </li></ol></li><li> Graf KBE nach 3-4 Tagen Inkubation bei 30 ° C. Die Mutationsrate ist es, die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert. </li></ol> Ergänzend zu den in situ Lebensfähigkeit Assay, altersabhängige Trp +-Reversion, Lys + frame-shift Mutation, Rekombination, oder r können auch in den Zellen auf der Platte im Alter untersucht werden. <ol><li> Platte Zellen (~ 10 8 Zellen / Platte) auf Trp-, Lys-, His-Dropout-oder L-Canavanin synthetischen Vollmedium-Platten (wie oben beschrieben). </li><li> Alle zwei Tage (oder zum Zeitpunkt Point of Interest), erzielt das neu entstehende Kolonien. </li><li> Mutation Frequenz wird durch die Normalisierung der neu entstehenden Kolonien an der Gesamtzahl der lebenden Zellen des spezifischen Tag geschätzt. </li></ol> 4. Translesion Synthese (TLS) Die altersabhängige Mutationsfrequenz erhöhen können zu einem erhöhten Makromolekül Schäden, verminderte zelluläre Schutz / Reparatur und erhöhte fehlerhafte DNA-Reparatur (wie Polζ-abhängige translesion Synthese, TLS) während des Alterns. Zum Beispiel zeigen die langlebigen sch9 Δ Mutanten erhöhte Expression von SOD2 und verminderte Expression der fehlerhaften DNA-Reparatur-Enzym Rev1 20. Hier beschreiben wir einen Assay kombiniert geschädigte DNA-Template und ganze Kernextrakt die TLS in vitro zu evaluieren. <ol><li> Bereiten Kernextrakt wie von Wang et al 21;. Quantifizierung der Protein-Konzentration von BCA-Assay (Pierce). </li><li> Fügen Sie 0, 5, 10 oder 20 ug Kernextrakten zu 50 ul (Endvolumen) Reaktionen, die TLS-Puffer (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 μMdNTPs und 100 nM 5&#39;-32 P-markierten 12-mer-Primer (5&#39;-TGG CGA TAC GGA-3 &#39;) geglüht, um eine 48-mer Vorlage mit DNA-Schäden von Interesse (5&#39;-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 &#39;, in denen X die beschädigte Stelle, zB Basenlücke, 8-oxo-G, etc.). </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 30 min, kündigen die Reaktion mit der Zugabe von 2,5 ul EDTA (20 mM) und 2 ul Proteinase K (10 mg / mL). </li><li> Purify DNA mit Phenol-Extraktion und Ethanolfällung. </li><li> Resuspendieren DNA in 50 ul Gelladepuffer (98% Formamid, 20 mM EDTA und Farbstoff). </li><li> Beheben Sie den translesion Syntheseprodukte auf 19% Polyacrylamidgelen. </li><li> Quantifizierung der TLS mit Phosphorimaging (Abbildung 1). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wir in der Regel verwendet die KBE-Zählungen am Tag 3 zu 100 Prozent das Überleben in der Standard-Flüssigkeit CLS-Analyse. Der Anteil Überleben in den folgenden Tagen kann angebaut werden, die mittlere (50% Überleben) zu berechnen und die maximale (10% Überlebensrate) Lebensdauer 12. Lebensdauer ergibt sich aus der in situ Lebensfähigkeit Assay erhaltenen sind in der Regel im Einklang mit den mit der flüssigen CLS-Test, aber mit reduzierten die mittlere Lebensdauer, die zum Teil auf die Tatsache, dass die Zellen ständig, um Nährstoffe ausgesetzt ist. Anwesenheit von Glukose hemmt die Aktivität der zellulären Schutz zeigte durch die verringerte Transaktivierung von Stress-Reaktion Transkriptionsfaktor wie MSN2 / 4 und Gis1 12. Altersabhängige Mutationsfrequenz variiert stark je nach Stamm Hintergrund, Genmanipulationen, Kulturbedingungen und Alter. Tabelle 2 zeigt die typische Ergebnisse in den Wildtyp-Stamm (DBY746) erhalten. <table border="1"><tbody><tr><th> Komponente </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Ammoniumsulfat </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Nitrogen Base (-AS/-AA) </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Asparaginsäure </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Glutaminsäure </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Isoleucin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-Lysin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serin </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-Tryptophan </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Synthetic komplette Glucose-Medium, SDC (auf pH 6,0 mit NaOH). 4-facher Überschuss an Histidin, sind Leucin, Tryptophan und Uracil enthalten, um die Auxotrophie des DBY746 Belastung zu kompensieren. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Tag 3 (Mittelwert ± SEM) </th><th> Bis zu (während des Alterns) </th></tr><tr><td> Kann r </td><td> 1,76 ± 0,12 x10 -6 </td><td> 6-8 x10 -6 </td></tr><tr><td> Trp +-Reversion </td><td> 6,60 ± 1,70 x10 -8 </td><td> 1,60 x10 -6 </td></tr><tr><td> Lys + frame-shift Mutation </td><td> 3,00 ± 0,78 x10 -8 </td><td> 0,70 x10 -6 </td></tr><tr><td> GCRs </td><td> 0,62 ± 0,10 x10 -8 </td><td> 0,30 x10 -6 </td></tr><tr><td> Homologe Rekombination </td><td> 5,55 ± 2,74 x10 -6 </td><td> 27,00 x10 -6 </td></tr><tr><td> Homeologous Rekombination </td><td> 0,12 ± 0,04 x10 -6 </td><td> 0,48 x10 -6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Typische Mutation Frequenzen von Wildtyp-Zellen (DBY746) bei chronologischer Alterung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ergebnis translesion Synthese (TLS) 20. Nuclear Auszüge aus 3 Tage alten stationären Phase Wildtyp (DBY746) und sch9 Δ mutierten Zellen wurden mit unbeschädigten oder Basenlücke-haltigen DNA-Templates für 30 min bei 30 ° C inkubiert TLS Produkte zeichnen sich durch solide (mit unbeschädigten Vorlage) oder gepunktete (mit beschädigten Vorlage) angedeutet. Es gab keine translesion Synthese in nuklearen Auszug aus sch9 Δ Mutanten beobachtet. Kostenlose Primer sind durch die offene Pfeil gekennzeichnet.

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D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2/Msn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li><li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures.">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner/Bloom+model+system.">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Flüssige alternden Kulturen irgendwann weisen Nachwachsen / keuchend Phänotyp 13, die die CLS-Analyse erschwert. Nachwachsen der Regel tritt ein, wenn mehr als 90-99% der Bevölkerung Lebensfähigkeit verloren hat. Dieser Phänotyp ist häufig mit einem erhöhten oxidativen Stress und / oder verminderter Schutz in der Zelle verbunden sind. Zum Beispiel, die Frequenz dieser Phänotyp mehr als verdoppelt in Zellen ohne cytosolische Superoxiddismutase und reduziert in langlebigen Mutanten (zB sch9 Δ oder Ras2 Δ) oder Mutanten überexprimiert Superoxiddismutasen 22. In der Praxis definieren wir Nachwachsen wie eine Erhöhung der Rentabilität oder der Stabilisierung der Rentabilität für 3 aufeinander folgende Proben in der hohen Mortalität Phase bei chronologischer Alterung. Altersabhängige Häufigkeit der verschiedenen DNA-Mutationen variieren stark je nach Stamm Hintergrund, Genmanipulationen, Kulturbedingungen, sowie das Nachwachsen / keuchend und äußerst geringe Überlebenschancen. Pre-Experimente sollten zu den Zeitpunkten, wie die mittleren und maximalen Überleben mit verschiedenen Beschichtungs-Dichte für Mutationsassays Mutation Frequenzbereich vor performingthe Endwert Lebensdauer Analyse zu bestimmen sein. Die Wildtyp-Stamm sollte immer in einer Lebensdauer oder Mutationsfrequenz Studie aufgenommen werden parallel zu einer Behandlung oder genetische Mutanten, so dass inter-Experiment-Variationen für gerechtfertigt werden kann. Mehrere biologische Replikate sollten in die Studie aufgenommen werden, und sowohl flüssiger als auch in situ Lebensfähigkeit / Mutationsassays sollte durchgeführt werden, zu bestätigen die Ergebnisse. Statt sich auf eine bestimmte Art von DNA-Mutation, Profilierung der altersabhängigen genomische Instabilität mit mehreren Tests in Kombination, kann Licht auf spezifische DNA-Schäden und DNA-Schäden zu reparieren System (s), die altersabhängige genomische Instabilität beitragen zu vergießen. Zum Beispiel ist eine deutliche Steigerung des Brutto-chromosomale Umlagerungen (GCRs), im Vergleich zu denen anderer DNA-Mutationen, in Wildtyp-Hefe beobachtet, die auf eine elevationof Doppelstrangbruch und / oder eine Beeinträchtigung in nicht-homologen Ende (NHEJ) während der Hefe chronologischer Alterung (Tabelle 2). Die can1 Mutationsspektrum (Sequenzierung des CAN1-Gen) in den Wildtyp-Aging-Hefe gewonnen schlug eine Erhöhung der oxidativen Schäden bei chronologischer Alterung und fehleranfällige DNA-Reparatur; in der Erwägung, langlebige sch9 Δ Mutanten weniger oxidative DNA-Schäden und stark reduziert fehleranfällige translesion Synthese wurden 20 beobachtet. Hier beschriebenen Methoden können weitere aufgewendet werden, um altersabhängige genomische Instabilität zu studieren. Zum Beispiel kann ruhig und nicht-ruhenden Zellen von Hefe stationären Phase Kulturen mit der Dichtegradienten-Methode von Allen et al isoliert werden. 23. Zusammen mit der Mutation beschriebenen Tests hier haben wir berichtet, dass ein großer Teil der altersabhängigen Mutationen von ruhenden Zellen, anstatt die Grenze, beschädigt oder apoptotischen Zellen 20,24 entsteht.

studying age-dependent genomic instability using the s. cerevisiae chronological lifespan model

Studien mit dem Saccharomyces cerevisiae Alterung Modell haben Lebensspanne Regulationswege, teilweise in höheren Eukaryonten 1-2 sind konserviert aufgedeckt. Die Einfachheit und Leistungsfähigkeit der Hefe Alterung Modell kann auch untersucht werden, um DNA-Schäden und Genom-Wartung sowie ihre Beiträge zu Krankheiten während der Alterung zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein System zur Alters-abhängigen DNA-Mutationen, einschließlich Basensubstitutionen, frame-shift-Mutationen, grobe chromosomale Umlagerungen und homologen / homeologous Rekombination, sowie nukleare DNA-Reparatur-Aktivität durch die Kombination der Hefe chronologische Lebensspanne mit einfachen DNA-Studie Schäden und Mutationsassays. Die hier beschriebenen Methoden sollte die Identifizierung von Genen / Wege, die genomische Instabilität und die Mechanismen, die alters-abhängigen DNA-Mutationen und Krebs in Säugern zugrunde liegen, zu regulieren.

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Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Hier beschreiben wir eine Reihe von DNA Mutationsassays, dass mit der Hefe chronologische Lebensspanne Modell, um die Gene / Wege, oder regeln dazu beitragen, genomische DNA Instabilität während des Alterns Studie kombiniert werden können.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

15.5K Aufrufe.  University of Southern California, Los Angeles. Hier beschreiben wir eine Reihe von DNA Mutationsassays, dass mit der Hefe chronologische Lebensspanne Modell, um die Gene / Wege, oder regeln dazu beitragen, genomische DNA Instabilität während des Alterns Studie kombiniert werden können.

Serie: Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding the pathological processes and evaluating new drugs. Here, we introduced a surgically induced lumbar spine instability (LSI) mouse model that develops IDD starting from 1 week post operation. In detail, the mouse under anesthesia was operated by low back skin incision, L3&#8211;L5 spinous processes exposure, detachment of paraspinous muscles, resection of processes and ligaments, and skin closure. L4&#8211;L5 IVDs were chosen for the observation. The LSI model develops lumbar IDD by porosity and hypertrophy in endplates at an early stage, decrease in intervertebral disc volume, shrinkage in nucleus pulposus at an intermediate stage, and bone loss in lumbar vertebrae (L5) at a later stage. The LSI mouse model has the advantages of strong operability, no requirement of special equipment, reproducibility, inexpensive, and relatively short period of IDD development. However, LSI operation is still a trauma that causes inflammation within the first week post operation. Thus, this animal model is suitable for study of lumbar IDD.

We developed a lumbar intervertebral disc degeneration mouse model by resection of L3&#8211;L5 spinous processes along with supra- and inter-spinous ligaments and detachment of paraspinous muscles.

Ein Mausmodell der Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...