Dieses Protokoll bietet eine eindeutige Methode zur Herstellung hochwertiger transversaler Hippocampusschnitte von Tieren, die mit r-mTBI verabreicht wurden, mit dem ACHI-Modell. Das ACHI-Modell führt zu leichten Verletzungen. Es handelt sich nicht um Schädelfrakturen oder -blutungen, Kraniotomien oder die Verwendung von Anästhetika.
Darüber hinaus ermöglicht es stabile elektrophysiologische Aufzeichnungen. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung der Veränderungen der synaptischen Plastizität nach wiederholter MTBI, deren Ätiologie weitgehend unbekannt ist, mit dem Potenzial, therapeutische Wege zu eröffnen. Das Verfahren wird von Allyson Gross, einer Masterstudentin meines Labors, und Dr. Eric Eyolfson, einem Postdoktoranden, demonstriert.
Beginnen Sie damit, die Ratte in einen Rückhaltekegel zu legen und stellen Sie sicher, dass sich die Schnauze und die Nasenlöcher in der Nähe der kleinen Öffnung der Zapfen befinden, um eine ausreichende Belüftung zu ermöglichen. Verhindern Sie die Rattenbewegung, indem Sie den Kegel am kaudalen Ende mit einer Plastikhaarspange geschlossen halten. Positionieren Sie den Helm manuell über der Mittellinie der gefesselten Ratte mit der Zielscheibe über dem linken Parietallappen.
Legen Sie als Nächstes die Ratte auf das Schaumstoffpolster, bevor Sie den Impaktor manuell in die Ausfahrposition bringen. Senken Sie die Impaktorspitze manuell ab, um die Zielscheibe am Helm zu berühren. Stellen Sie dann den Impaktor in die Einziehposition, damit sich der Impaktor 10 Millimeter über dem Helm zurückzieht.
Senken Sie mit dem Drehknopf am stereotaktischen Arm die Aufprallspitze um 10 Millimeter ab, um die Zielscheibe am Helm erneut zu berühren. Legen Sie dann den Schlagschalter um, so dass der Kopf des Tieres mit sechs Metern pro Sekunde für 10 Millimeter beschleunigt wird. Sobald das Gerät aktiviert ist, entfernen Sie das Tier sofort aus dem Rückhaltekegel, um ein sofortiges neurologisches Untersuchungsprotokoll (NAP) durchzuführen.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, sezieren Sie das Gehirn und legen Sie es auf ein benetztes Filterpapier auf eine umgedrehte Petrischale. Entfernen Sie mit einem scharfen Skalpell das Kleinhirn und den präfrontalen Kortex, um das Gehirn abzutupfen. Trennen Sie die beiden Hemisphären, indem Sie die Mittellinie des Gehirns abschneiden.
Um transversale Hippocampusschnitte zu erstellen, legen Sie eine Hemisphäre auf die mediale Oberfläche, kippen Sie das Skalpell um etwa 30 Grad nach innen und entfernen Sie eine dünne Scheibe von der dorsalen Oberfläche des Gehirns, um eine ebene Oberfläche für die Montage am Kolben zu schaffen. Drehen Sie das Gehirn auf die dorsale Oberfläche und tupfen Sie das Gehirngewebe vorsichtig auf trockenes Filterpapier, um überschüssiges ACSF zu entfernen. Befestigen Sie dann die dorsale Oberfläche des Gehirns mit Cyanacrylatkleber am Kolben und lassen Sie die ventrale Oberfläche aufrecht.
Verlängern Sie das äußere Rohr des Kolbens über das Gehirn und gießen Sie die flüssige Agarose in das Rohr, bis das Gehirn vollständig bedeckt ist. Verfestigen Sie die Agarose schnell, indem Sie einen Kühlblock über das Kolbenrohr klemmen. Positionieren Sie den Kolben in der Kammer der Aufschnittmaschine und sichern Sie die Kammer mit einer Schraube.
Nachdem Sie die Klinge befestigt haben, geben Sie eiskaltes, sauerstoffhaltiges ACSF in die Schneidekammer. Stellen Sie am Slicer die Schnittgeschwindigkeit auf vier, die Oszillation auf sechs ein und schalten Sie den Schalter für kontinuierliches Einzelschneiden auf Kontinuierlich. Drücken Sie dann auf Start, um mit der Durchtrennung des Gehirns bei 400 Mikrometern zu beginnen.
Wenn der Slicer das Gehirn durchtrennt, verwenden Sie eine Pasteurpipette mit großem Durchmesser, um jede Scheibe in das Rückgewinnungsbad mit sauerstoffreichem ACSF zu übertragen. Lassen Sie die Scheiben 30 Minuten bei 32 Grad Celsius erholen und lassen Sie sie dann weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Wiederholen Sie diese Schritte, um Scheiben aus der zweiten Hemisphäre zu erstellen.
Ziehen Sie mit einem handelsüblichen Mikropipettenzieher Ein- bis Zwei-Megaohm-Aufzeichnungselektroden aus 10 Zentimeter großen Borosilikatglaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 Millimetern und einem Innendurchmesser von 1,1 Millimetern. Verwenden Sie eine Pasteurpipette und übertragen Sie eine Hippocampus-Scheibe aus dem Auffangbad in die Kammer, die mit karbogeniertem ACSF perfundiert und bei 30 Grad Celsius gehalten wird. Richten Sie den Hirnschnitt so aus, dass der Gyrus dentatus und die Körnerzellschicht im Sichtfeld sichtbar sind.
Verwenden Sie ein aufrechtes Mikroskop, um den Gyrus dentatus mit schräger Optik zu visualisieren. Positionieren Sie eine konzentrische bipolare Stimulationselektrode, um den medialen perforenten Pfad oder die MPP-Fasern im mittleren Drittel der Molekülschicht zu aktivieren. Positionieren Sie dann eine mit ACSF gefüllte Glasmikropipette im MPP.
Beginnen Sie mit den Elektroden, die weiter voneinander entfernt sind, da das Berühren des Gewebes die Fasern schädigt. Sobald die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden positioniert sind, visualisieren Sie die evozierten Feldantworten mit einem Verstärker, einem Digitizer und einer Aufzeichnungssoftware. Finden Sie ein geeignetes feldexzitatorisches postsynaptisches Potential oder Feld-EPSP, indem Sie das Gewebe mit Stromimpulsen stimulieren und eine minimale Amplitude von 0,7 Millivolt mit einer klaren Fasersalve sicherstellen, die kleiner als das Feld-EPSP ist.
Erhöhen und stellen Sie die Simulationsintensität ein, bis das Feld EPSP bei 70% der maximalen Amplitude liegt. Legen Sie als Nächstes eine stabile Vorkonditionierungs-Baseline für 20 Minuten mit 0,12-Millisekunden-Impulsen fest, die mit 0,067 Hertz abgegeben werden. Für einen stabilen Schnitt sollte die anfängliche Steigung des fEPSP weniger als 10 % Variabilität betragen und die Steigung der Linie der besten Anpassung durch die dargestellten Feld-EPSP-Steigungen sollte kleiner als 0,5 sein.
Bestimmen Sie die Änderungen der grundlegenden synaptischen Eigenschaften mithilfe von gepaarten Pulsstimuli und der Konstruktion von Stimulus-/Antwort-Input-/Output-Kurven. Legen Sie für den Paired-Puls-Test eine Reihe von Paired-Puls-Pulsen mit einem Interpulsintervall von 50 Millisekunden bei 0,033 Hertz an. Wenden Sie für die Eingabe-/Ausgangskurven eine Reihe steigender Stimulusintensitäten von 0,0 bis 0,24 Millisekunden bei 0,033 Hertz an, um die Änderung der EPSP-Antwortgröße im Feld darzustellen.
Um langfristige Depressionen zu untersuchen, die in erster Linie von der Aktivierung des CB1-Rezeptors abhängen, werden 6.000 Impulse bei 10 Hertz verwendet. Für Aufnahmen nach der Konditionierung setzen Sie die Aufnahmen für weitere 60 Minuten mit Einzelimpulsstimulationen von 0,12 Millisekunden bei einer Frequenz von 0,067 Hertz fort. Verabreichen Sie nach der Aufzeichnung nach der Konditionierung die gepaarten Pulsstimuli, gefolgt von einer Eingangs-/Ausgangskurve.
Vergleichen Sie diese mit Baseline-Aufzeichnungen, um beobachtete Veränderungen der präsynaptischen Freisetzungseigenschaften zu beobachten und den Zustand der Scheibe für Langzeitaufzeichnungen zu beurteilen. Halten Sie sich bei der Analyse an die Ausschlusskriterien zur Bestimmung der Datenretention von einzelnen Schichten im Datensatz zur präsynaptischen Plastizität. Schließen Sie Ausschnitte aus, die eine große Neigung in einer Linie mit der besten Anpassung der Feld-EPSP-Neigungen während der Basislinie vor der Konditionierung, Instabilität in der Basislinie für die Vorkonditionierung und Instabilität in der Periode nach der Konditionierung aufweisen.
Zu Beginn der Studie zeigte das neurologische Beurteilungsprotokoll (NAP-Score) keinen Unterschied zwischen Schein- und wiederholten mSHT-Ratten. Nach allen wachen Sitzungen mit geschlossenen Kopfverletzungen zeigten die wiederholten mSHT-Ratten signifikante Beeinträchtigungen innerhalb der NAP-Aufgaben im Vergleich zu Scheinaufgaben, was darauf hindeutet, dass subtile, aber signifikante Verhaltensdefizite hervorgerufen wurden. Es wurde eine Reihe von gepaarten Pulsen verabreicht und das Verhältnis der Größe des zweiten Feldes EPSP relativ zum ersten Feld-EPSP berechnet.
Die Paar-Puls-Verhältnisse unterschieden sich nicht zwischen Schein- und wiederholten mSHT-Ratten, was zeigt, dass wiederholte mSHT-Ratten die grundlegende synaptische Physiologie im MPP-Eingang zum Gyrus dentatus nicht veränderten. Wenn ein 10-Hertz-Protokoll verabreicht wurde, um eine langfristige Depression zu induzieren, kam es zu einer vorübergehenden, aber signifikanten Abnahme der Kapazität des MPP-Eingangs in den Gyrus dentatus, am ersten Tag nach der Verletzung eine langfristige Depression aufrechtzuerhalten. Am siebten Tag nach der Verletzung zeigten Schichten von Scheintieren und Tieren mit wiederholtem mSHT jedoch eine äquivalente Langzeitdepression, obwohl es einen leichten Trend gab, dass Tiere mit wiederholtem mSHT eine Zunahme der Langzeitdepression aufwiesen.
Die Planung des Präparier- und Schneideprozesses im Voraus ist entscheidend für die erfolgreiche Herstellung lebensfähiger Hippocampusschnitte und die Erzielung stabiler elektrophysiologischer Aufzeichnungen. Mit diesem Verfahren wird eine stabile experimentelle Plattform geschaffen, mit der die Pathophysiologie von SHT untersucht und neue Therapieansätze entwickelt werden können. Die Bewegung von der Entnahme des Gehirns bis zur Positionierung zum Einschneiden des komprimierten Films für transversale Hippocampusschnitte ist wichtig, ebenso wie die genaue Platzierung der Elektroden im Gyrus dentatus.
