Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie wurden freundlicherweise von Prof. Dr. PCW Hogendoorn und Prof. Dr. J. Bovée der Universität Leiden, Niederlande vorgesehen. Wir danken J. und G. Mestach Wagemans für hervorragende technische Unterstützung, und G. De Bruyne für die professionelle Darstellung der Überblick über unsere Protokoll.

Siehe Abbildung 1 für eine Übersicht Tumor Material 1. Beziehen und Vorbereiten Tumorproben Für die Nutzung von Patientendaten Material, ist mit Zustimmung des Ethikkommission notwendig, und informierte Zustimmung muss vom Patienten erhalten werden. <ol><li> Ernte repräsentatives Material (mindestens 1 cm 3) zum Zeitpunkt der Intervention, entweder eine Biopsie oder eine Resektion eines Sarkom. Der richtige Ort der Biopsie wird mithilfe dynamischer Kontrast MRT. </li><li> Sie das Material sofort in einem sterilen Fläschchen mit DMEM mit 1000 U Penicillin und 1 mg / ml Streptomycin. </li><li> Transportieren Sie das Fläschchen sofort (30-90 min) zum Labor. </li></ol> Alle folgenden Verfahren werden unter Laminar-Flow durchgeführt. <ol start="4"><li> Den Inhalt des Fläschchens in eine sterile Petrischale. </li><li> Setzen Sie den Tumorprobe in kleine Teile von maximal 1 mm 3 mit einem sterilen Skalpell. Alle entfernen verkalkte Teile, wie sie der weiteren Verarbeitung des Gewebes beeinträchtigen neigen. </li><li> Zufällig nehmen 10 Tumortransplantate für die Anwendung auf der CAM. </li></ol> 2. Herstellung von Tumor-derived Einzelzellsuspensionen Dauer: ca. 3 Stunden <ol><li> Wiegen Sie das verbleibende Gewebe der Probe. </li><li> Setzen Sie 2-4 g Gewebe in einem Dissoziator Rohr, mehr als ein Rohr erforderlich sein, um alle verbleibenden Tumorgewebe zu verdauen. </li><li> Für die Verdauung von 2 - 4 g des Gewebes, fügen Sie 2,5 ml Kollagenase 2-Lösung (500 U / ml RPMI 1640) und 2,5 ml DNase-Lösung (22 KU / ml RPMI 1640). </li><li> Verarbeiten Sie das Gewebe nach dem Dissoziator h_tumor Protokoll. Dabei werden 2 Zyklen von Inkubation bei 37 ° C in CO 2-Inkubator, während das Röhrchen wird vorsichtig für 30 min geschüttelt. </li><li> Filtern Sie die verbleibende Suspension durch ein 150 um Zellsieb. </li><li> Zentrifuge das Lysat bei 1000 rpm für 5 kmn. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Das Pellet in 10 ml Erythrozytenlysepuffer (ELB), so dass 10 Minuten Inkubation mit regelmäßigen Suspension. </li></ol> Hinweis: Erythrozyten-Lyse-Puffer wird wie folgt hergestellt: In 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g NH 4 Cl zu 1.000 ml aqua, verwenden 10 N NaOH auf den pH-Wert auf 7,3 einstellen, Filter unter Druck durch ein 0,22 um filtern. Lagern bei 4 ° C. <ol start="9"><li> 25 ml Kulturmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin), um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.000 rpm für 5 min. Die Farbe der Tablette sollte weiß jetzt. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. </li><li> 5 ml Medium zu dem Pellet. Filtern Sie die Suspension durch eine 70 um Zellsieb. </li><li> Zähle die Anzahl der lebenden Zellen / ml mittels eines automatischen Zellzähler. </li></ol> 3. Cancer Zelllinien Saos2 Osteosarkom-Zellen (ATCC Nummer: HTB-85) Expression verstärkt grün fluoreszierende Protein wurden von pEGFP-C1-Vektor unter Verwendung der Zellinie Nucleofector Kit V gemäß dem Protokoll des Herstellers elektroporiert. Um stabile Zelllinien zu etablieren, wurden transfizierte Zellen in G418 (1 mg / ml) für 4 Wochen im Einklang mit früheren festgelegten Protokoll 20 ausgewählt. Zusätzlich Sortierung durch Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie (ATCC-Nummer: HTB-94) oder frisch zubereitete Tumor Einzelzellsuspensionen sind beschriftet mit einem rot fluoreszierenden lipophilen Membran Fleck. <ol><li> Entfernen der Zellen aus der Kulturflasche in einer klassischen Art und Weise unter Verwendung von Trypsin (0,5% w / v) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,2% w / v) Lösung. </li><li> Zentrifuge die Zellsuspension 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Entfernen Sie die Supernatant. </li><li> 1 ml Serum-freiem Medium und 5 ul Dil (Vybrant Red) / 10 6 Zellen. </li><li> Wickeln Sie das Fläschchen in Alufolie und steckte es in die CO 2-Inkubator für 10 min bei 37 ° C </li><li> Zentrifuge erneut für 5 min bei 1.000 rpm und Überstand. </li></ol> Chorioallantoismembran Assay 1. Egg Incubation <ol><li> Befruchtete Eier von einem lokalen kommerziellen Brüterei garantiert 95% der Befruchtung der Eier erforderlich sind. </li><li> Befruchtete Eier können bei RT gelagert werden bis zu 10 Tagen. </li></ol> Hinweis: bevor Inkubation, Schmutz, Federn und Kot werden sorgfältig von den Eierschalen mechanisch durch trockenes Abwischen mit Papiertüchern, die eine raue statt einer weichen Oberflächenstruktur entfernt. Wischen Sie die Eier mit 70% Ethanol denaturiert oder einer anderen Reinigung Reagenz reduziert signifikant die Überlebensrate der Hühnerembryonen. <ol start="3"><li> Setzen Sie die Eier in den incubator auf der einen Seite, die Kennzeichnung der Oberseite. Der Tag, an dem die Eier in den Inkubator gelegt werden, wird Tag 0 der embryonalen Entwicklung bezeichnet. </li><li> Stellen Sie die Inkubationstemperatur bei 37,8 ° C und die Luftfeuchtigkeit bei 47%. Stellen Sie sicher, dass die automatische Rotation Option ausgeschaltet ist. </li></ol> 2. Eröffnung der Eier Dauer: ± 60 min für 25 Eier Am Tag 3 Entwicklung werden die Eier unter laminaren Luftstrom geöffnet. Öffnen der Eier an weiteren Entwicklungsstadium führt zu einer Schädigung des CAM, da die Membran dazu neigt, an der Schale halten. Ein Infrarot-Lampe verwendet wird, halten die Eier warm während des Verfahrens. Um die Sterilität zu verbessern, empfehlen wir die Verwendung von Handschuhen. <ol><li> Legen Sie das Ei in den Eierbecher, mit der markierten Seite nach oben zeigt. </li><li> Senken Sie den Pegel des CAM durch Entfernen von zwei ml Eiweiss durch eine 18 G Nadel an der Spitze des Eies eingefügt. Wenn die Nadel nach Perforieren mehrere stumpfeEierschalen, ersetzen Sie die Nadel. Wenn nicht, ist zu viel Kraft ausgeübt wird, was zu Schäden an dem Eigelb oder Bruch der Schale. Manchmal wird die Nadel durch die Hagelschnüre, eines von 2 Spiralbänder Aussetzung der Dotter in Eiweiß blockiert. Dies kann durch leichtes Drücken Sie den Kolben nach unten, bis der Block gelöst gelöst werden. Wenn Eigelb in die Spritze gesaugt wird, ersetzen Sie die Nadel sowie die Spritze. Manchmal stirbt der Embryo nach diesem Ereignis. Wenn eine unzureichende Menge an Eiweiß entfernt wird, wird der CAM beschädigt werden, wenn die Hülle entfernt werden. </li><li> Anwenden einer semipermeablen Folie an der markierten oberen Seite der Schale, um Verschütten von Shell-Partikel auf die CAM verhindern beim Schneiden das Fenster. </li><li> Stellen Sie eine Einführung Loch mit einer kleinen Ahle an der Oberfläche des Eies. </li><li> Schneiden Sie ein Fenster von 1 cm 2 in der Schale, mit einem Paar sterile spitzen chirurgische Schere. </li><li> Der Embryo pulsierenden Herzen und den angrenzenden Gefäßen bei th beobachtet werdene Oberfläche des Eigelb. Entfernen Sie die nicht befruchteten Eier oder tote Embryonen. Eine unterbrochene Aspekt der Blutgefäße charakterisiert toten Embryonen. </li><li> Verschließen Sie die Fenster mit einer semipermeablen Folie. Es ist nicht notwendig, um die Einstichstelle decken, wenn die Hülle während des Einführens der Nadel gebrochen hat. </li></ol> 3. Inokulationsverfahren Dauer: ± 1 Std. pro Zelllinie Auf chick Embryonalentwicklung Tag 9 werden die Eier unter laminaren Luftstroms geimpft. Bewertung der Krebszelle sich über das CAM erfordert Rückhaltung der Zellen begrenzt Oberfläche bei der Inokulation. Matrigel ist eine extrazelluläre Matrix (ECM)-Gel aus der Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkoms häufig in experimentellen Bedingungen der Zellkultur eingesetzt. Es ist eine Flüssigkeit, beim Abkühlen, sondern thermisch aktivierten Polymerisation unterliegen, wenn auf 20 gebracht - 40 ° C, wodurch ein stabiles Gel. Währenddie Experimente wird Matrigel in eine Kiste mit schmelzendem Eis gehalten. Hinweis: Wir bestehen nicht auf perforierten Deckgläser verwenden. Wir beobachteten, Anhaftung und das Wachstum von Krebszellen gepfropft auf der Kunststoffscheibe so vorspannt Wachstum Potential der Zellen auf der Membran selbst. <ol><li> Resuspendieren eines Zellpellets in gekühlten ECM Gel in einer Konzentration von 10 6 Zellen/100 ul ECM Gel. Diese Lösung wird auf schmelzendem Eis. </li><li> Excise Teil der semipermeablen Membran mit einem Paar von sterilen chirurgischen unter laminaren Luftstrom. Wenn die Klebefolie vollständig entfernt wird, wird diese in einem größeren Anteil von embryonalen Tod durch Kontamination. </li><li> Berühren Sie die CAM direkt unter dem Shell-Fenster vorsichtig mit einem sterilen Glasstab, um die Epithelzellschicht entfernen. Das Berühren der CAM mit einem sterilen Glasstab erweist sich als weniger traumatisch als mit einem Skalpell n ° 11, die mehr Handlichkeit und Erfahrung erfordert. Kleine Blutungen auftreten. </li><li> Adding Tumor Material. </li><li> Für Tumortransplantate: sanft untere Stück des Gewebes auf die CAM mit einem Paar von sterilen Pinzette, ohne sie zu quetschen. </li><li> Für die ECM Gel-Verfahren: In 4x 25 ul der Zell-ECM-Suspension auf die CAM, auf der jeweils anderen, so dass die ECM-Gel zur Polymerisation in zwischen den Anwendungen. Auf diese Weise eine haftende Plaque, die die Krebszellen wird erstellt. </li><li> Verschließen Sie die Shell-Fenster wieder mit einer semipermeablen Folie. </li></ol> 4. Imaging und Ernten der CAM Dauer: 2 Stunden für 25 Eier Auf chick Embryonalentwicklung Tag 16 werden die CAMs geerntet. Arbeiten unter laminaren Luftstrom ist nicht erforderlich. <ol><li> Vergrößern Sie das Fenster mit einem Paar chirurgische Schere. Achten Sie darauf, nicht zu tief schneiden, da sonst die CAM beschädigt werden, was zu Blutungen der verletzten Gefäße. </li><li> In 300 - 500 ul PBS D mit einer Pipette auf die CAM-SekteIonen mit der beimpften Materials. Wenn keine fluoreszierende Sonden verwendet werden, können gepuffert Formaldehyd verwendet, da hierdurch die Membran steifer werden, wodurch das Schneiden der Membran. </li><li> Machen Sie ein Foto des CAM in das Ei durch ein Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet, sowohl mit dem GFP oder die DSR-Filter, und keine Filter. Für die Tumortransplantate, werden alle Fotos ohne Filter. Beleuchtung von oben LED-Leuchten ist stark während des Fotografierens (Abbildung 2) empfohlen. </li><li> Nimm Tumorzellmigration für die markierten Zellen. Die Grenzen der Tumoren kann unregelmäßig und ausgefranst. Aufgelockert Zellen vorhanden sein können in der Nähe des Tumors Grenzen. In einigen Proben kann Reihen von Tumorzellen beobachtet (Abbildung 3). </li><li> Schneiden Sie die Membran mit einem Paar sterile Schere an der Grenze liegend gegen die Schale. </li><li> Legen Sie die geernteten CAM in einer sterilen Petrischale mit PBS D gefüllt oder gepuffert fürFormaldehyd. </li><li> Machen Sie ein Foto von den beiden oberen und der unteren Seite des CAM, sowohl mit als auch ohne Filter. </li><li> Legen Sie die Membran in einer beschrifteten Behälter mit gepufferter Formaldehyd für mindestens 72 Stunden. </li><li> Integrieren Sie die CAMs in Paraffin und bereiten sie für die histologische Untersuchung. Achten Sie darauf, die Tumortransplantate in der Mitte des Knotens geschnitten, so dass die Schnittfläche ist parallel zum Boden der Kassette. Wenn nicht, wird die Wechselwirkung zwischen dem Nocken und dem Tumor-Transplantat nicht sichtbar. Die gleiche Strategie gilt für die ECM Gel Plaques: die Oberfläche, die der Schneidklinge sollte senkrecht zu der Plakette. </li></ol> 5. Histologische Auswertung Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Ki-67 Immunhistochemie wurden zur weiteren Klärung durchgeführt wird, wenn nötig. Immunhistochemie auf Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von 3,5 um Dicke durchgeführt, unter Verwendung eines Färbeautomat nachden Anweisungen des Herstellers. Eine primäre Maus-monoklonalen Antikörper Ki-67 (Klon MIB-1, Verdünnung 1/100) verwendet. Hitzeinduzierte Epitopdemaskierungslösung wurde mit Handy Conditioning 1 und Visualisierung wurde mit dem Universal-DAB Detection Kit erreicht, nach den Anweisungen des Herstellers. Dehydratation der Gewebeschnitte erfolgte mit Hilfe eines automatisierten Deckglasvorrichtung durchgeführt. Für die Saos2 und SW1353 Zelllinien, die Zahl der Ki67-positiven und-negativen Zellen Ki67 nuclei/100 um 2 in drei Zonen wurden gezählt: ein in der Nähe der Grenze des CAM, schließen ein die Oberfläche und eine in der Mitte des das ECM Gel Plaque. Dieses Verfahren wurde wiederholt 6x für jede Ki-67 gefärbten Objektträger. Der Index der Proliferation wurde für jede Folie, indem die Anzahl von Ki67-positive Zellen durch die Gesamtzahl der gezählten Zellen bestimmt. Nekrose ist durch einen Verlust von feinen Dispersion von Chromatin im Zellkern, durch fadi begleitet definiertng von verschiedenen Zell-Margen. Für Xenograften wird Nekrose vollständige, teilweise (oft an der Oberfläche), oder nicht vorhanden erzielt. Infiltration von Tumorzellen in das CAM wird durch die Beobachtung von Tumorzellen in dem Mesoderm der CAM definiert und als vorhanden oder abwesend erzielt. Drei Titel sind für Host-Verhalten erzielt. Fibroblasten-Infiltration als langgestreckte Zellen Verlassen des CAM und Invasion der Tumor Transplantat / Plaque definiert und wird als anwesend oder abwesend erzielt. Gefäßeinsprossung als Einwachsen von proliferierenden Küken Schiffe, durch die Anwesenheit von kernhaltigen Erythrozyten dadurch Küken beobachtet werden.

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zeit der Impfung und Ernte Timing der Tag der Impfung durchgeführt wurde mit Saos2 in ECM-Gel (36 CAMs) und variiert zwischen Embryonalentwicklung Tag 5 und 10. Vor der Inkubation Tag 9 war das CAM nicht konsequent groß genug, um die ECM-Gel aufgetragen wir unterstützen. Bei der Ernte, Tumorzellen manchmal musste aus dem tieferen CAM abgerufen werden, und einige ECM Gel Proben wurden lose liegend im Eiweiss oder auf der CAM. An den Tagen, 5 und 6, war es schwer z...

Sarkom ist ein seltener Tumor des Bindegewebes mit einer hohen Sterblichkeit aufgrund von Therapieresistenz 1,2. Fortschritte in der das Überleben der Patienten ist durch ihre geringe jährliche Inzidenz, ihrer breiten Vielfalt und der Tatsache, dass Sarkomzellen gemeldet sind schwer zu Kultur in vitro 3,4 behindert. Die Verwendung von kultivierten Zellen für die präklinische Therapie Auswertung hat ergeben, dass neue, scheinbar aktive Moleküle in vitro nicht immer die Ergebnisse im klinischen Umfeld. Darüber hinaus sind Genom Aberrationen Genexpressionsarrays zeigte nicht immer korreliert Tumorverhalten Merkmale in den einzelnen Patienten 5-7. Um zu versuchen und diese Probleme zu lösen, hat die personalisierte Medizin an Bedeutung, die in der zunehmenden Suche nach Xenotransplantatmodellen 8-12 reflektiert wird gewonnen. Ein in vivo Test hat den Vorteil, was die komplexe Zusammenspiel zwischen cancer Zellen und das Wirtsgewebe Umwelt in soliden Tumoren, die für Krebs Proliferation und Invasion 13. Derzeit untersuchen wir die Verwendung des Chorioallantoismembran Assay (CAM-Assay) als reproduzierbare Xenograftmodell für Sarkom 14,15. Dieser Test wird weithin für die Untersuchung von Tumor-Angiogenese 16,17 verwendet. In der Literatur sind jedoch haben wir verschiedene Protokolle für diesen Test gefunden, während andere Studien beobachtet einen deutlichen Unterschied im Wachstum oder die Angiogenese nach unterschiedlichen Protokollen 18,19. In diesem Artikel untersuchen wir die Wirkung der unterschiedlichen Bedingungen des CAM-Assay auf das Verhalten der Zelle mit Tumortransplantate, tumorderivierten Einzelzellsuspensionen und etablierten Sarkom Zellkulturen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

Sarkom ist eine sehr seltene Krankheit, die heterogen in der Natur ist, die alle negativ auf die Entwicklung neuer Therapien. Sarkom-Patienten sind ideale Kandidaten für die personalisierte Medizin nach einer Schichtung, erklärt die aktuelle Interesse an der Entwicklung eines reproduzierbaren und Low-Cost-Xenotransplantationsmodell für diese Krankheit. Die Küken Chorioallantoismembran ist eine natürliche immungeschwächten Wirt fähig ist, ein dauerhaftes gepfropft Geweben und Zellen ohne Spezies-spezifische Einschränkungen. Darüber hinaus ist es leicht zugänglich, manipuliert und abgebildet, die optische und Fluoreszenz-Stereomikroskopie. Histologie weiteren ermöglicht die detaillierte Analyse der zellulären Interaktionen heterotypic. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die in ovo Pfropfen des Chorioallantoismembran mit frischen Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien (Saos-2 und SW1353). Die Küken Überleben Rattees sind bis zu 75%. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren. Bei lokalisierten Pfropfen Einzelzellsuspensionen bietet ECM Gel deutliche Vorteile gegenüber inerten Materialien Containment. Die Ki67 Proliferationsindex auf den Abstand der Zellen von der Oberfläche der Nocke und der Dauer der Anwendung auf dem CAM, wobei letztere Bestimmung eines Zeitrahmens für die Zugabe von therapeutischen Produkten in Zusammenhang stehen.

Auswertung des CAM Tumor Transplantate werden Anhänger der CAM (Abbildung 2A). Einzel-Zell-Suspensionen von Patient Material zeigen häufig eine getrocknete, leicht erhabene Plaque (2D). Nach Exzision des CAM, markiert Faltenbildung der Membran auftritt (2E und 2F). Für den kommerziellen Zelllinien die Plaque wird immer undurchsichtig in der Zeit, was die Zellproliferation. Verschiedene Zelllinien...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Die<em&gt; In ovo</em&gt; Chorioallantoismembran (CAM) wird mit frischem Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien gepfropft. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren.

Die<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.3K Aufrufe.  Ghent University Hospital. Die In ovo Chorioallantoismembran (CAM) wird mit frischem Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien gepfropft. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren.

Serie: The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Forschung

Medizin

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and diabetic retinopathy. It was the object of this study to introduce a standardized stress model for future preclinical therapeutic testing.
Bovine retinas were prepared and perfused with an oxygen saturated standard solution, and the ERG was recorded. After recording stable b-waves, hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;m glutamate) was exerted for 45 min. To investigate the effects on photoreceptor function alone, 1 mM aspartate was added to obtain a-waves. ERG-recovery was monitored for 75 min.
For hypoxia, a decrease in a-wave amplitude of 87.0% was noted (p &#60;0.01) after an exposition time of 45 min (decrease of 36.5% after the end of the washout p = 0.03). Additionally, an initial decrease in b-wave amplitudes of 87.23% was recorded, that reached statistical significance (p &#60;0.01, decrease of 25.5% at the end of the washout, p = 0.03).
For 250 &#181;m glutamate, an initial 7.8% reduction of a-wave amplitudes (p &#62;0.05) followed by a reduction of 1.9% (p &#62;0.05). A reduction of 83.7% of b-wave amplitudes (p &#60;0.01) was noted; after a washout of 75 min the reduction was 2.3% (p = 0.62). In this study, a standardized stress model is presented that may be useful to identify possible neuroprotective effects in the future.

With this study, we introduce a standardized stress model for the isolated superfused bovine retina for future preclinical therapeutic testing. The effect of either hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;M glutamate) on retinal function represented by a- and b-wave amplitudes was evaluated.

Glutamat und Hypoxie als Stress-Modell für die isolierten perfundierten Wirbel Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Das<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Chorioallantoismembran (CAM) Assay als effiziente Xenograftmodell des hepatozellulären Karzinoms

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Einrichtung eines Menschen Multiple Myeloma Xenograftmodell im Huhn, das Tumorwachstum, Invasion und Angiogenese Studieren

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Ölsäure-Injektion bei Schweinen als Modell für Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant or neo-adjuvant therapies. This occurs when surgical margins are insufficiently tumor-free, resulting in residual cancer cells. From a biological and immunological perspective, surgery is not a null event; the wound healing environment is known to induce both pro- and anti-tumorigenic pathways. As a consequence, preclinical models for drug development aimed at preventing local relapse should incorporate surgical resection when testing new (neo)adjuvant therapies, to model the clinical settings in patients treated with surgery.
Here, we describe a mouse model of incomplete surgical resection of WEHI 164 soft tissue sarcoma that allows testing of (neo)adjuvant therapies in the setting of a wound healing response. In this model, 50% or 75% of the tumor is removed, leaving behind some cancer tissue in situ to model gross residual disease after surgery in the clinical setting. This model allows testing therapies in the context of surgery while also considering the wound healing response, which may affect the efficacy of (neo)adjuvant treatments. The incomplete surgical resection results in reproducible regrowth of the tumor in all mice in the absence of adjuvant therapy. Adjuvant treatment with checkpoint blockade results in reduced tumor regrowth. This model is thus appropriate for testing therapies in the context of debulking surgery and its associated wound healing response and can be extended to other types of solid cancer.

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing Neoadjuvant Therapies

In this protocol, we describe a mouse model of incomplete surgical resection of soft tissue sarcoma for testing (neo)adjuvant therapies.

Ein Mausmodell von unvollständig resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvante Therapien

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant ...