Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie wurden freundlicherweise von Prof. Dr. PCW Hogendoorn und Prof. Dr. J. Bovée der Universität Leiden, Niederlande vorgesehen. Wir danken J. und G. Mestach Wagemans für hervorragende technische Unterstützung, und G. De Bruyne für die professionelle Darstellung der Überblick über unsere Protokoll.

Siehe Abbildung 1 für eine Übersicht Tumor Material 1. Beziehen und Vorbereiten Tumorproben Für die Nutzung von Patientendaten Material, ist mit Zustimmung des Ethikkommission notwendig, und informierte Zustimmung muss vom Patienten erhalten werden. <ol><li> Ernte repräsentatives Material (mindestens 1 cm 3) zum Zeitpunkt der Intervention, entweder eine Biopsie oder eine Resektion eines Sarkom. Der richtige Ort der Biopsie wird mithilfe dynamischer Kontrast MRT. </li><li> Sie das Material sofort in einem sterilen Fläschchen mit DMEM mit 1000 U Penicillin und 1 mg / ml Streptomycin. </li><li> Transportieren Sie das Fläschchen sofort (30-90 min) zum Labor. </li></ol> Alle folgenden Verfahren werden unter Laminar-Flow durchgeführt. <ol start="4"><li> Den Inhalt des Fläschchens in eine sterile Petrischale. </li><li> Setzen Sie den Tumorprobe in kleine Teile von maximal 1 mm 3 mit einem sterilen Skalpell. Alle entfernen verkalkte Teile, wie sie der weiteren Verarbeitung des Gewebes beeinträchtigen neigen. </li><li> Zufällig nehmen 10 Tumortransplantate für die Anwendung auf der CAM. </li></ol> 2. Herstellung von Tumor-derived Einzelzellsuspensionen Dauer: ca. 3 Stunden <ol><li> Wiegen Sie das verbleibende Gewebe der Probe. </li><li> Setzen Sie 2-4 g Gewebe in einem Dissoziator Rohr, mehr als ein Rohr erforderlich sein, um alle verbleibenden Tumorgewebe zu verdauen. </li><li> Für die Verdauung von 2 - 4 g des Gewebes, fügen Sie 2,5 ml Kollagenase 2-Lösung (500 U / ml RPMI 1640) und 2,5 ml DNase-Lösung (22 KU / ml RPMI 1640). </li><li> Verarbeiten Sie das Gewebe nach dem Dissoziator h_tumor Protokoll. Dabei werden 2 Zyklen von Inkubation bei 37 ° C in CO 2-Inkubator, während das Röhrchen wird vorsichtig für 30 min geschüttelt. </li><li> Filtern Sie die verbleibende Suspension durch ein 150 um Zellsieb. </li><li> Zentrifuge das Lysat bei 1000 rpm für 5 kmn. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Das Pellet in 10 ml Erythrozytenlysepuffer (ELB), so dass 10 Minuten Inkubation mit regelmäßigen Suspension. </li></ol> Hinweis: Erythrozyten-Lyse-Puffer wird wie folgt hergestellt: In 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g NH 4 Cl zu 1.000 ml aqua, verwenden 10 N NaOH auf den pH-Wert auf 7,3 einstellen, Filter unter Druck durch ein 0,22 um filtern. Lagern bei 4 ° C. <ol start="9"><li> 25 ml Kulturmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin), um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.000 rpm für 5 min. Die Farbe der Tablette sollte weiß jetzt. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. </li><li> 5 ml Medium zu dem Pellet. Filtern Sie die Suspension durch eine 70 um Zellsieb. </li><li> Zähle die Anzahl der lebenden Zellen / ml mittels eines automatischen Zellzähler. </li></ol> 3. Cancer Zelllinien Saos2 Osteosarkom-Zellen (ATCC Nummer: HTB-85) Expression verstärkt grün fluoreszierende Protein wurden von pEGFP-C1-Vektor unter Verwendung der Zellinie Nucleofector Kit V gemäß dem Protokoll des Herstellers elektroporiert. Um stabile Zelllinien zu etablieren, wurden transfizierte Zellen in G418 (1 mg / ml) für 4 Wochen im Einklang mit früheren festgelegten Protokoll 20 ausgewählt. Zusätzlich Sortierung durch Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie (ATCC-Nummer: HTB-94) oder frisch zubereitete Tumor Einzelzellsuspensionen sind beschriftet mit einem rot fluoreszierenden lipophilen Membran Fleck. <ol><li> Entfernen der Zellen aus der Kulturflasche in einer klassischen Art und Weise unter Verwendung von Trypsin (0,5% w / v) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,2% w / v) Lösung. </li><li> Zentrifuge die Zellsuspension 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Entfernen Sie die Supernatant. </li><li> 1 ml Serum-freiem Medium und 5 ul Dil (Vybrant Red) / 10 6 Zellen. </li><li> Wickeln Sie das Fläschchen in Alufolie und steckte es in die CO 2-Inkubator für 10 min bei 37 ° C </li><li> Zentrifuge erneut für 5 min bei 1.000 rpm und Überstand. </li></ol> Chorioallantoismembran Assay 1. Egg Incubation <ol><li> Befruchtete Eier von einem lokalen kommerziellen Brüterei garantiert 95% der Befruchtung der Eier erforderlich sind. </li><li> Befruchtete Eier können bei RT gelagert werden bis zu 10 Tagen. </li></ol> Hinweis: bevor Inkubation, Schmutz, Federn und Kot werden sorgfältig von den Eierschalen mechanisch durch trockenes Abwischen mit Papiertüchern, die eine raue statt einer weichen Oberflächenstruktur entfernt. Wischen Sie die Eier mit 70% Ethanol denaturiert oder einer anderen Reinigung Reagenz reduziert signifikant die Überlebensrate der Hühnerembryonen. <ol start="3"><li> Setzen Sie die Eier in den incubator auf der einen Seite, die Kennzeichnung der Oberseite. Der Tag, an dem die Eier in den Inkubator gelegt werden, wird Tag 0 der embryonalen Entwicklung bezeichnet. </li><li> Stellen Sie die Inkubationstemperatur bei 37,8 ° C und die Luftfeuchtigkeit bei 47%. Stellen Sie sicher, dass die automatische Rotation Option ausgeschaltet ist. </li></ol> 2. Eröffnung der Eier Dauer: ± 60 min für 25 Eier Am Tag 3 Entwicklung werden die Eier unter laminaren Luftstrom geöffnet. Öffnen der Eier an weiteren Entwicklungsstadium führt zu einer Schädigung des CAM, da die Membran dazu neigt, an der Schale halten. Ein Infrarot-Lampe verwendet wird, halten die Eier warm während des Verfahrens. Um die Sterilität zu verbessern, empfehlen wir die Verwendung von Handschuhen. <ol><li> Legen Sie das Ei in den Eierbecher, mit der markierten Seite nach oben zeigt. </li><li> Senken Sie den Pegel des CAM durch Entfernen von zwei ml Eiweiss durch eine 18 G Nadel an der Spitze des Eies eingefügt. Wenn die Nadel nach Perforieren mehrere stumpfeEierschalen, ersetzen Sie die Nadel. Wenn nicht, ist zu viel Kraft ausgeübt wird, was zu Schäden an dem Eigelb oder Bruch der Schale. Manchmal wird die Nadel durch die Hagelschnüre, eines von 2 Spiralbänder Aussetzung der Dotter in Eiweiß blockiert. Dies kann durch leichtes Drücken Sie den Kolben nach unten, bis der Block gelöst gelöst werden. Wenn Eigelb in die Spritze gesaugt wird, ersetzen Sie die Nadel sowie die Spritze. Manchmal stirbt der Embryo nach diesem Ereignis. Wenn eine unzureichende Menge an Eiweiß entfernt wird, wird der CAM beschädigt werden, wenn die Hülle entfernt werden. </li><li> Anwenden einer semipermeablen Folie an der markierten oberen Seite der Schale, um Verschütten von Shell-Partikel auf die CAM verhindern beim Schneiden das Fenster. </li><li> Stellen Sie eine Einführung Loch mit einer kleinen Ahle an der Oberfläche des Eies. </li><li> Schneiden Sie ein Fenster von 1 cm 2 in der Schale, mit einem Paar sterile spitzen chirurgische Schere. </li><li> Der Embryo pulsierenden Herzen und den angrenzenden Gefäßen bei th beobachtet werdene Oberfläche des Eigelb. Entfernen Sie die nicht befruchteten Eier oder tote Embryonen. Eine unterbrochene Aspekt der Blutgefäße charakterisiert toten Embryonen. </li><li> Verschließen Sie die Fenster mit einer semipermeablen Folie. Es ist nicht notwendig, um die Einstichstelle decken, wenn die Hülle während des Einführens der Nadel gebrochen hat. </li></ol> 3. Inokulationsverfahren Dauer: ± 1 Std. pro Zelllinie Auf chick Embryonalentwicklung Tag 9 werden die Eier unter laminaren Luftstroms geimpft. Bewertung der Krebszelle sich über das CAM erfordert Rückhaltung der Zellen begrenzt Oberfläche bei der Inokulation. Matrigel ist eine extrazelluläre Matrix (ECM)-Gel aus der Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkoms häufig in experimentellen Bedingungen der Zellkultur eingesetzt. Es ist eine Flüssigkeit, beim Abkühlen, sondern thermisch aktivierten Polymerisation unterliegen, wenn auf 20 gebracht - 40 ° C, wodurch ein stabiles Gel. Währenddie Experimente wird Matrigel in eine Kiste mit schmelzendem Eis gehalten. Hinweis: Wir bestehen nicht auf perforierten Deckgläser verwenden. Wir beobachteten, Anhaftung und das Wachstum von Krebszellen gepfropft auf der Kunststoffscheibe so vorspannt Wachstum Potential der Zellen auf der Membran selbst. <ol><li> Resuspendieren eines Zellpellets in gekühlten ECM Gel in einer Konzentration von 10 6 Zellen/100 ul ECM Gel. Diese Lösung wird auf schmelzendem Eis. </li><li> Excise Teil der semipermeablen Membran mit einem Paar von sterilen chirurgischen unter laminaren Luftstrom. Wenn die Klebefolie vollständig entfernt wird, wird diese in einem größeren Anteil von embryonalen Tod durch Kontamination. </li><li> Berühren Sie die CAM direkt unter dem Shell-Fenster vorsichtig mit einem sterilen Glasstab, um die Epithelzellschicht entfernen. Das Berühren der CAM mit einem sterilen Glasstab erweist sich als weniger traumatisch als mit einem Skalpell n ° 11, die mehr Handlichkeit und Erfahrung erfordert. Kleine Blutungen auftreten. </li><li> Adding Tumor Material. </li><li> Für Tumortransplantate: sanft untere Stück des Gewebes auf die CAM mit einem Paar von sterilen Pinzette, ohne sie zu quetschen. </li><li> Für die ECM Gel-Verfahren: In 4x 25 ul der Zell-ECM-Suspension auf die CAM, auf der jeweils anderen, so dass die ECM-Gel zur Polymerisation in zwischen den Anwendungen. Auf diese Weise eine haftende Plaque, die die Krebszellen wird erstellt. </li><li> Verschließen Sie die Shell-Fenster wieder mit einer semipermeablen Folie. </li></ol> 4. Imaging und Ernten der CAM Dauer: 2 Stunden für 25 Eier Auf chick Embryonalentwicklung Tag 16 werden die CAMs geerntet. Arbeiten unter laminaren Luftstrom ist nicht erforderlich. <ol><li> Vergrößern Sie das Fenster mit einem Paar chirurgische Schere. Achten Sie darauf, nicht zu tief schneiden, da sonst die CAM beschädigt werden, was zu Blutungen der verletzten Gefäße. </li><li> In 300 - 500 ul PBS D mit einer Pipette auf die CAM-SekteIonen mit der beimpften Materials. Wenn keine fluoreszierende Sonden verwendet werden, können gepuffert Formaldehyd verwendet, da hierdurch die Membran steifer werden, wodurch das Schneiden der Membran. </li><li> Machen Sie ein Foto des CAM in das Ei durch ein Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet, sowohl mit dem GFP oder die DSR-Filter, und keine Filter. Für die Tumortransplantate, werden alle Fotos ohne Filter. Beleuchtung von oben LED-Leuchten ist stark während des Fotografierens (Abbildung 2) empfohlen. </li><li> Nimm Tumorzellmigration für die markierten Zellen. Die Grenzen der Tumoren kann unregelmäßig und ausgefranst. Aufgelockert Zellen vorhanden sein können in der Nähe des Tumors Grenzen. In einigen Proben kann Reihen von Tumorzellen beobachtet (Abbildung 3). </li><li> Schneiden Sie die Membran mit einem Paar sterile Schere an der Grenze liegend gegen die Schale. </li><li> Legen Sie die geernteten CAM in einer sterilen Petrischale mit PBS D gefüllt oder gepuffert fürFormaldehyd. </li><li> Machen Sie ein Foto von den beiden oberen und der unteren Seite des CAM, sowohl mit als auch ohne Filter. </li><li> Legen Sie die Membran in einer beschrifteten Behälter mit gepufferter Formaldehyd für mindestens 72 Stunden. </li><li> Integrieren Sie die CAMs in Paraffin und bereiten sie für die histologische Untersuchung. Achten Sie darauf, die Tumortransplantate in der Mitte des Knotens geschnitten, so dass die Schnittfläche ist parallel zum Boden der Kassette. Wenn nicht, wird die Wechselwirkung zwischen dem Nocken und dem Tumor-Transplantat nicht sichtbar. Die gleiche Strategie gilt für die ECM Gel Plaques: die Oberfläche, die der Schneidklinge sollte senkrecht zu der Plakette. </li></ol> 5. Histologische Auswertung Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Ki-67 Immunhistochemie wurden zur weiteren Klärung durchgeführt wird, wenn nötig. Immunhistochemie auf Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von 3,5 um Dicke durchgeführt, unter Verwendung eines Färbeautomat nachden Anweisungen des Herstellers. Eine primäre Maus-monoklonalen Antikörper Ki-67 (Klon MIB-1, Verdünnung 1/100) verwendet. Hitzeinduzierte Epitopdemaskierungslösung wurde mit Handy Conditioning 1 und Visualisierung wurde mit dem Universal-DAB Detection Kit erreicht, nach den Anweisungen des Herstellers. Dehydratation der Gewebeschnitte erfolgte mit Hilfe eines automatisierten Deckglasvorrichtung durchgeführt. Für die Saos2 und SW1353 Zelllinien, die Zahl der Ki67-positiven und-negativen Zellen Ki67 nuclei/100 um 2 in drei Zonen wurden gezählt: ein in der Nähe der Grenze des CAM, schließen ein die Oberfläche und eine in der Mitte des das ECM Gel Plaque. Dieses Verfahren wurde wiederholt 6x für jede Ki-67 gefärbten Objektträger. Der Index der Proliferation wurde für jede Folie, indem die Anzahl von Ki67-positive Zellen durch die Gesamtzahl der gezählten Zellen bestimmt. Nekrose ist durch einen Verlust von feinen Dispersion von Chromatin im Zellkern, durch fadi begleitet definiertng von verschiedenen Zell-Margen. Für Xenograften wird Nekrose vollständige, teilweise (oft an der Oberfläche), oder nicht vorhanden erzielt. Infiltration von Tumorzellen in das CAM wird durch die Beobachtung von Tumorzellen in dem Mesoderm der CAM definiert und als vorhanden oder abwesend erzielt. Drei Titel sind für Host-Verhalten erzielt. Fibroblasten-Infiltration als langgestreckte Zellen Verlassen des CAM und Invasion der Tumor Transplantat / Plaque definiert und wird als anwesend oder abwesend erzielt. Gefäßeinsprossung als Einwachsen von proliferierenden Küken Schiffe, durch die Anwesenheit von kernhaltigen Erythrozyten dadurch Küken beobachtet werden.

<ol>
	<li>Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+data+for+648+patients+with+osteosarcoma+treated+at+one+institution.">Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).</li><li>Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+drug+sensitivity+and+expression+of+multidrug+resistance+markers+in+early+passage+human+sarcomas.">Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).</li><li>Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2001.">Cancer statistics, 2001.</a> CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).</li><li>Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterisation+of+a+continuous+human+chondrosarcoma+cell+line,+ch-2879:+Comparative+histologic+and+genetic+studies+with+its+tumor+of+origin.">Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin.</a> Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).</li><li>Taylor, B. S., Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+sarcoma+genomics+and+new+therpeutic+targets.">Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).</li><li>Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoma.">Sarcoma.</a> Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).</li><li>Nielsen, T. O., West, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+gene+expression+into+clinical+cara:+sarcomas+as+a+paradigm.">Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm.</a> Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).</li><li>Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).</li><li>DeRose, Y. S., Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).</li><li>Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).</li><li>Bertotti, A., Migliardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecularly+annotated+platform+of+patient-derived+xenografts+("xenopatients")+identifies+HER2+as+an+effective+therapeutic+target+in+cetuximab-resistant+colorectal+cancer.">A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer.</a> Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).</li><li>Decaudin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+tumor+xenografted+models+('tumorgrafts')+for+good+management+of+patients+with+cancer.">Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer.</a> Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Sys, G., Van Bockstal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+sarcoma+patients+tumor+morphology,+viability,+and+invasion+potential+and+indicate+disease+outcomes+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+model.">Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model.</a> Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).</li><li>Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+invasion+and+intramesenchymal+infiltration+of+the+chick+embryo+chorioallantois+by+tumor+cell+lines.">Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines.</a> Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).</li><li>Deryugina, E., Quigly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis.">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).</li><li>Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avascular+and+vascular+phases+of+tumor+growth+in+the+chick+embryo.">Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo.</a> British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., D&#252;nker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+how+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).</li><li>Balke, M., Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane.">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Research Notes. 3, 58 (2010).</li><li>Hendrix, A., Maynard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+secretory+small+GTPase+Rab27B+on+breast+cancer+growth,+invasion,+and+metastasis.">Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).</li><li>Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+normal+and+neoplastic+tissues+grafted+to+the+chick+chorioallantois:+role+of+host+and+preexisting+graft+vessels.">Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels.</a> American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).</li><li>Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Chorioallantoic+membrane+(CAM)+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis.">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li><li>Vargas, A., Zeisser-Labou&#232;be, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+(CAM)+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems.">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model.">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li><li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices.">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li><li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemoinvasion+assay:+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation.">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zeit der Impfung und Ernte Timing der Tag der Impfung durchgeführt wurde mit Saos2 in ECM-Gel (36 CAMs) und variiert zwischen Embryonalentwicklung Tag 5 und 10. Vor der Inkubation Tag 9 war das CAM nicht konsequent groß genug, um die ECM-Gel aufgetragen wir unterstützen. Bei der Ernte, Tumorzellen manchmal musste aus dem tieferen CAM abgerufen werden, und einige ECM Gel Proben wurden lose liegend im Eiweiss oder auf der CAM. An den Tagen, 5 und 6, war es schwer z...

Sarkom ist ein seltener Tumor des Bindegewebes mit einer hohen Sterblichkeit aufgrund von Therapieresistenz 1,2. Fortschritte in der das Überleben der Patienten ist durch ihre geringe jährliche Inzidenz, ihrer breiten Vielfalt und der Tatsache, dass Sarkomzellen gemeldet sind schwer zu Kultur in vitro 3,4 behindert. Die Verwendung von kultivierten Zellen für die präklinische Therapie Auswertung hat ergeben, dass neue, scheinbar aktive Moleküle in vitro nicht immer die Ergebnisse im klinischen Umfeld. Darüber hinaus sind Genom Aberrationen Genexpressionsarrays zeigte nicht immer korreliert Tumorverhalten Merkmale in den einzelnen Patienten 5-7. Um zu versuchen und diese Probleme zu lösen, hat die personalisierte Medizin an Bedeutung, die in der zunehmenden Suche nach Xenotransplantatmodellen 8-12 reflektiert wird gewonnen. Ein in vivo Test hat den Vorteil, was die komplexe Zusammenspiel zwischen cancer Zellen und das Wirtsgewebe Umwelt in soliden Tumoren, die für Krebs Proliferation und Invasion 13. Derzeit untersuchen wir die Verwendung des Chorioallantoismembran Assay (CAM-Assay) als reproduzierbare Xenograftmodell für Sarkom 14,15. Dieser Test wird weithin für die Untersuchung von Tumor-Angiogenese 16,17 verwendet. In der Literatur sind jedoch haben wir verschiedene Protokolle für diesen Test gefunden, während andere Studien beobachtet einen deutlichen Unterschied im Wachstum oder die Angiogenese nach unterschiedlichen Protokollen 18,19. In diesem Artikel untersuchen wir die Wirkung der unterschiedlichen Bedingungen des CAM-Assay auf das Verhalten der Zelle mit Tumortransplantate, tumorderivierten Einzelzellsuspensionen und etablierten Sarkom Zellkulturen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

Sarkom ist eine sehr seltene Krankheit, die heterogen in der Natur ist, die alle negativ auf die Entwicklung neuer Therapien. Sarkom-Patienten sind ideale Kandidaten für die personalisierte Medizin nach einer Schichtung, erklärt die aktuelle Interesse an der Entwicklung eines reproduzierbaren und Low-Cost-Xenotransplantationsmodell für diese Krankheit. Die Küken Chorioallantoismembran ist eine natürliche immungeschwächten Wirt fähig ist, ein dauerhaftes gepfropft Geweben und Zellen ohne Spezies-spezifische Einschränkungen. Darüber hinaus ist es leicht zugänglich, manipuliert und abgebildet, die optische und Fluoreszenz-Stereomikroskopie. Histologie weiteren ermöglicht die detaillierte Analyse der zellulären Interaktionen heterotypic. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die in ovo Pfropfen des Chorioallantoismembran mit frischen Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien (Saos-2 und SW1353). Die Küken Überleben Rattees sind bis zu 75%. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren. Bei lokalisierten Pfropfen Einzelzellsuspensionen bietet ECM Gel deutliche Vorteile gegenüber inerten Materialien Containment. Die Ki67 Proliferationsindex auf den Abstand der Zellen von der Oberfläche der Nocke und der Dauer der Anwendung auf dem CAM, wobei letztere Bestimmung eines Zeitrahmens für die Zugabe von therapeutischen Produkten in Zusammenhang stehen.

Auswertung des CAM Tumor Transplantate werden Anhänger der CAM (Abbildung 2A). Einzel-Zell-Suspensionen von Patient Material zeigen häufig eine getrocknete, leicht erhabene Plaque (2D). Nach Exzision des CAM, markiert Faltenbildung der Membran auftritt (2E und 2F). Für den kommerziellen Zelllinien die Plaque wird immer undurchsichtig in der Zeit, was die Zellproliferation. Verschiedene Zelllinien...

Watch this Scientific Journal Video about The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma at JoVE.com

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Die<em&gt; In ovo</em&gt; Chorioallantoismembran (CAM) wird mit frischem Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien gepfropft. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren.

Die<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.2K Aufrufe.  Ghent University Hospital. Die In ovo Chorioallantoismembran (CAM) wird mit frischem Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien gepfropft. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren.