Die gefrorenen Bestände von embryonalen Neuronen von Ratten sind gebrauchsfertig, und es sind keine fortgeschrittenen Techniken erforderlich, um die Zellen zu kultivieren. Diese Technik ist sehr einfach und Sie benötigen keine Erlaubnis für Tierversuche, die Organisation von trächtigen Tieren oder das Sezieren von Embryonen. Die Neuronen können in anderen Kulturgefäßen kultiviert und für andere Arten von Experimenten verwendet werden.
Zum Beispiel Mikroelektroden-Array-Platten für elektrophysiologische Experimente. Beginnen Sie mit der Beschichtung einer 96-Well-Mikroplatte mit 100 Mikrolitern Poly-L-Lysin pro Well. Als nächstes inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation die Poly-L-Lysin-Lösung entfernen. Waschen Sie die Platten zweimal mit sterilisiertem Wasser und einmal mit zusatzfreiem, frischem Nährmedium. Stellen Sie die Teller zum Trocknen aus.
Trockene Teller können verpackt und bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um mit der Zellaussaat zu beginnen, geben Sie 50 Mikroliter des Kulturmediums in jede Vertiefung in den beschichteten Platten. Füllen Sie die peripheren Vertiefungen mit 200 Mikrolitern sterilisiertem Wasser und inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Nehmen Sie das Neuronen-Kryo-Fläschchen aus dem Flüssigstickstofftank und legen Sie es in einen 37 Grad Celsius heißen Block, um den Inhalt teilweise aufzutauen. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette mit breiter Bohrungsspitze wird der Inhalt der Fläschchen langsam tropfenweise in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Spülen Sie die leere Kryodurchstechflasche mit einem Milliliter Nährmedium bei Raumtemperatur ab.
Die Spüllösung in das 50-Milliliter-Röhrchen mit der Zellsuspension überführen. Als nächstes geben Sie neun Milliliter des Raumtemperatur-Kulturmediums tropfenweise in das 50-Milliliter-Röhrchen, wodurch das Volumen auf 11 Milliliter erhöht wird. Nach dem Zählen der Zellen mit einem Hämozytometer wird die Zellsuspension in ein Reservoir überführt.
Dosieren Sie nun mit einer Mehrkanalpipette mit breiter Bohrung die Zellsuspension mit einer Endzählung von 1,0 mal 10 bis vier Zellen pro Vertiefung in die beschichtete 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Neuronen für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Anschließend wird das Nährmedium durch 100 Mikroliter vorgewärmtes Nährmedium ersetzt und unter den gleichen Bedingungen erneut inkubiert.
Nach vier Tagen in vitro wird Cytosin beta-D-Arabinofuranosid in der Endkonzentration von 0,2 Mikromolar pro Vertiefung hinzugefügt, um das Wachstum von Gliazellen zu reduzieren. Stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator. Behandeln Sie die Zellen nach 21 Tagen in vitro mit den gewünschten Medikamenten.
Um eine Positivkontrolle aufrechtzuerhalten, behandeln Sie die Zellen vor der Fixierung 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 100 mikromolaren Glutamat pro Well. Bevor Sie immunzytochemische Untersuchungen durchführen, fixieren Sie die Zellen für 20 Minuten, indem Sie die Kulturlösung in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter Paraformaldehyd ersetzen. Nach der Fixierung werden die Vertiefungen zweimal mit 250 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro Vertiefung für jeweils fünf Minuten gewaschen.
In der vorliegenden Studie entwickelten sich die Neuronen normal, ohne dass das Kulturmedium drei Wochen lang ausgetauscht wurde. Die Immunhistochemie ergab Drebrin-positive dendritische Dornen entlang der MAP2-positiven Dendriten. Es wurde eine dosisabhängige Reduktion der Drebrin-Cluster-Dichte gegen Glutamat-Stimulation beobachtet.
Die Transplantation der Zellsuspension, bevor es zu warm wird, ist sehr wichtig. Die tropfenweise Zugabe von Nährmedium ist ebenfalls entscheidend, um eine plötzliche Änderung der Osmolarität zu vermeiden.
