Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Peter Lougheed Medical Research Foundation, die McGill-Programm in Neuroengineering unterstützt, dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und der Canada Foundation for Innovation (CFI ). Sébastien D. Langlois wurde von einem Master-Training Award aus dem Fonds unterstützten de la recherche en santé du Québec (FRSQ) und durch einen Frederick Banting und Charles Best Canada Graduate Stipendien Master Award der Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Wir sind dankbar, dass Jessica MT Pham für die Unterstützung bei Zahlen.

1. Dissection der embryonalen Ratte Rückenmark Allgemeine Empfehlungen Keep L-15-Medium auf Eis und ändern sich häufig das Medium, in dem Sezieren Gericht zu halten Embryonen cool. Dies schont Gewebe Integrität. Alle Schritte werden mit zwei Paaren von Dumont Nr. 5 Pinzette durchgeführt sofern nicht anders angegeben. Um Verunreinigungen zu vermeiden, sprühen alle Werkzeuge und Arbeitsflächen mit 70% Ethanol und halten Dissektion Medium Flasche geschlossen. Zur Übertragung von Embryonen zwischen Gerichten, verwenden Sie einen Ausschnitt aus Kunststoff Pipette oder einem perforierten Löffel. Es ist wichtig, nicht auf das Rückenmark (nicking, Stretching) Schäden an den erfolgreichen Abschluss der Präparation. Vorbereitung <ul><li> Kalte L-15-Medium </li><li> 50 ml L-15 + 10% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum (HiHS). Keep on ice. </li></ul> Rückenmark Dissektion <ol><li> Euthanize ein E13 Schwangerschaft inszeniert Ratte (E0 = ersten Tag nach Decktag) mit einem CO 2-Kammer nach den Richtlinien des Instituts. </li><li> Spray 70% Ethanol auf dem Bauch. Pinch und ziehen Sie die Haut der unteren Bauchgegend mit einer Pinzette und schneiden mit chirurgischer Schere. Wiederholen, um durch die Muskel-und Peritonealdialyse Schichten geschnitten, um die Bauchhöhle gelangen. Erstellen Sie eine V-Form Schnitt durch Schneiden von Gewebe an den Seiten des Bauches, bis zum Brustkorb. Anheben und wieder das Gewebe der Bauchhöhle aussetzen. </li><li> Die Gebärmutter ist an drei Standorten angebracht: an der unteren Mitte Bauch und an den beiden oberen seitlichen Ecken. Heben Sie die Gebärmutter durch Greifen auf Gewebe zwischen embryonalen Säcken. Schneiden Sie das Bindegewebe in die Gebärmutter und in eine Petrischale mit L-15 auf Eis gefüllt zu entfernen. </li><li> Die nächsten Schritte sind im Rahmen eines Dissektionsmikroskop getan. Zur Trennung eines Embryos aus extraembryonalen Geweben und embryonalen Membranen, greifen das Gewebe zwischen Gebärmutter Säckchen mit einer Pinzette,. Mit dem anderen Paar, eine Prise mehr transparent Seite des sac, um durch die oberflächlichen Membranen (die dunklere Seite der Plazenta) geschnitten. Squeeze out der Embryo durch sanftes Drücken der Plazenta Seite des sac. Entfernen Sie alle Embryonen und in eine Petrischale mit L-15 auf Eis gefüllt. </li><li> Setzen Sie einen Embryo in eine 10 cm Petrischale mit eiskaltem L-15 gefüllt. Mit Mikroschere, schneiden Sie den Kopf und hinteren Teile mit Winkeln in Abbildung 1a gezeigt. Schneiden bei diesen Winkeln wird dazu beitragen, Position der Embryo, wenn gesetzt &quot;ventral face down&quot;. </li><li> Position des Embryos &quot;ventral face down&quot; (anterior weg zeigt, posterior zeigt auf der Experimentator) (Abb. 1b). </li><li> Halten Sie das Embryo aus einer Seite, mit der Pinzette &quot;festzunageln&quot; des Embryos (Abb. 1c). Bewegen Sie die Zange, da sie das Gewebe zerreißt. Mit der anderen Pinzette, ziehen Sie die Haut über den Rücken des Embryo ab der Region zwischen den &quot;Betrieb&quot; Pinzette (Abb. 1d-e). Dies legt das Rückenmark, die an dieser Stelle, durch Membranen (der Hirnhäute) gewickelt ist. Besorgen Sie sich die Haut von den Seiten und nicht von oben auf das Rückenmark zu vermeiden nicking des Rückenmarks. </li><li> Teilweise lösen das Gewebe auf der rechten Seite des Rückenmarks (Abb. 1f). Beginnend auf der Ebene der Haltezange, poke das Gewebe mit geschlossenen Pinzette so nah wie möglich an das Rückenmark. Dann öffnen Sie langsam die Zange, um das Gewebe zu reißen. Dies sollte zu lösen die Spinalganglien (DRGs) aus dem Rückenmark, und sollte auch stören ventralen Organe. Lassen Sie einige Gewebe an der vorderen und hinteren Enden. Verlassen Gewebe angebracht fügt Gewicht des Embryos verbunden, somit verhindern, dass es aufwärts im nächsten Schritt gezogen. Darüber hinaus ist das Gewebe verwendet zu halten, um den Embryo in späteren Schritten. </li><li> Ausgehend von der vorderen Ende, verwenden Sie die hakenförmigen Wolframnadel auf die Hirnhäute geschnitten und öffnen das Rückenmark entlang der roofplate (Abb. 1g). </li><li> Drehen Sie den Embryo 180 Grad (hinten weg zeigt, anterior zeigt auf der Experimentator) (Abb. 1 Std.). Dies ermöglicht es dem Forscher, der gleichen Hand benutzen, um das Gewebe von der anderen Seite des Embryos zu lösen. </li><li> Halten Sie den Embryo durch Greifen auf die zuvor freistehende Seite, und stören das Gewebe von den übrigen Seiten mit der gleichen Methode (siehe 1.8.). Wenn Sie fertig sind, vollständig lösen das Gewebe auf beiden Seiten des Rückenmarks. Alternative: Vollständig lösen das Gewebe, das auf der linken Seite, aber lassen Sie einige Gewebe an der vorderen und hinteren Ende auf der rechten Seite angebracht. Dies kann manchmal helfen, die Wirbelsäule in ihrer Position in Schritt 1.12. </li><li> Legen Sie das Rückenmark auf die Seite und entfernen Sie die meisten der übrigen mesenchymalen Gewebe und DRGs (Abb. 1i). </li><li> In diesem Schritt werden die Hirnhäute und das Rückenmark zwei &quot;Blätter&quot; des Gewebes aufeinander apposed. Pin nach unten die größeren, anterior-meisten Teil des Rückenmarks, und ziehen Sie ein kurzes Segment der Hirnhäute aus dem Rückenmark cord (Abb. 1j, links). Jetzt halten die beiden getrennten Segmente durch Greifen über mit einer Pinzette, und ziehen Sie die Hirnhäute mit einer glatten, ständig in Bewegung (Abb. 1j). Ungleiche &quot;Peeling&quot; führt zum Bruch des Rückenmarks und / oder der Hirnhäute Schicht. Es ist normalerweise nicht möglich, den Anteil des Rückenmarks noch Meningen befestigt erholen. </li><li> Mit einem Kunststoff-Pipette das isolierte Rückenmark eine Petrischale mit L-15 + 10% HiHS und verlassen auf dem Eis. Typischerweise sind Rückenmark aller Embryonen, die vor Sezieren der dorsalen Teile gesammelt. </li></ol> Rückenmark Dissektion <ol start="15"><li> Legen Sie ein Rückenmark in eine Petrischale mit L-15 +10% HiHS, liegen in einem &quot;open-book&quot;-Konfiguration flach. Schneiden Sie den breiteren, vorderen Teil (die auch Teil der Hinterhirn) (Abb. 1K). </li><li> Die dorsale Gewebe wird in den seitlichen-weiten Teilen des Rückenmarks (Abb. 1l, links). Während Pinning das Kabel mit einem geraden Wolframnadel, verwenden Sie die L-förmige Wolframnadel zum Ausschneiden eines Streifens, der 1:5 die Breite der Hälfte des Rückenmarks. (Abb. 1l, rechts). Legen Sie die dorsalen Streifen in einem 15 ml Kunststoffröhrchen mit L-15 + 10% HiHS auf Eis. Dorsal Neuralrohr Abschnitte ~ 12 E13 Embryonen ~ 3,5 bis 4.000.000 Zellen für die Beschichtung nach der Dissoziation ergeben. Weitere Zellen können durch eine grobe Zerlegung der dorsalen Rückenmarks (Schneiden breiteren dorsalen Streifen) erhalten werden, aber kommissuralen Neuron Reinheit reduziert werden. </li></ol> 2. Kommissuralen Neuron Kultur Allgemeine Empfehlungen Alle Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube sofern nicht anders angegeben durchgeführt werden. Verwenden Sie frisches Medium und frisch aufgetaut Ergänzungen und Reagenzien. Die Dissoziation und Verreiben Schritte sind in Ca 2 + / Mg 2 +-freiem HBSS zu minimieren Ca 2 + / Mg 2 +-abhängige Adhäsion durchgeführt. Vorbereitung <ul><li> beschichteten Deckgläsern (Einsatz deutscher Desag Glas) oder Zellkulturplatten (siehe Beschichtungsverfahren unten). </li><li> warme Neurobasal Plating Medien (siehe unten), in Gewebekultur-Schalen und CO 2 äquilibriert in der Gewebekultur-Inkubator für mindestens 1,5 h vor dem Ausplattieren. </li><li> 2,5% Trypsin in der 37 ° C im Wasserbad </li><li> 2 Flaschen HBSS Ca 2 + / Mg 2 +-freien, einer bei 4 ° C, einer bei 37 ° C. </li><li> zwei Feuer-poliertem Glas Pasteurpipetten eins mit einem Durchmesser der Hälfte der üblichen Größe, und eine mit einem Durchmesser, der geringfügig kleiner als die Hälfte. Gebrauch sterilisiert Pasteur Pipetten. Um Feuer-polish der Pipetten, mit einem Bunsenbrenner (oben in der hellblauen Flamme) an der Spitze schmilzt ein leichter Rückgang zu dem Durchmesser. Da dieser Schritt außerhalb der Gewebekultur Haube durchgeführt wird, sprühen die Pipetten mit 70% Ethanol, bevor unter der Gewebekultur Kapuze. Für eine effizientere Wiederherstellung von Neuronen, Mantel des Pasteur-Pipetten mit serumhaltigen vor Beginn der Dissoziation oder kurz vor der Verreibung Schritt (fill Pipetten mit Medien und halten für 30 Sekunden). Dies wird das Anhaften von Zellen der Innenseite der Pasteurpipette während der Verreibung zu verhindern. </li><li> sterile milliQ Wasser zum Waschen PLL-beschichteten Schalen oder Deckgläser </li><li> 12,5% MgSO 4-Lösung in HBSS </li></ul> Poly-L-Lysin-Beschichtung Bei Verwendung von Deckgläsern, Acid-Wash für 24 Stunden und sterilisieren vor dem Beschichten (siehe Kaech und Banker, 2006). Verwenden deutschen Desag Deckgläschen. Zur Beschichtung mit Poly-L-Lysin auf Deckgläschen oder Kunststoff Gewebekulturschalen: <ul><li> unter einer Gewebekultur Kapuze, Oberflächen mit einer kleinen Kuppel des 100 ug / ml PLL-Lösung für 1,75-2 Stunden. </li><li> waschen zweimal mit milliQ Wasser, mindestens 5 Minuten pro Waschgang (kann während der Zelle Dissoziationsstufe unten durchgeführt werden). </li><li> Geschäft in Wasser bis zur Verwendung. Lassen Sie sich nicht die PLL-beschichtete Oberfläche trocken. Zur Verringerung der PLL Verschwendung für Deckgläser Beschichtung, legen Sie die Deckgläser in sterile bakteriellen Petrischalen. Coat und waschen Sie die Deckgläschen, indem eine Kuppel von Flüssigkeit auf dem Deckgläschen. Die bakterielle Petrischalen sind hydrophob, so sollte die Flüssigkeit auf die Deckgläser bleiben. Übertragen Sie die Deckgläser zu Gewebekulturschalen kurz vor dem Ausplattieren der Zellen. Für Neuronen auf Kunststoff-Gewebe Kulturschalen plattiert, Haftung in der Regel höher ist, könnte somit Neuriten Dehnung vermindert werden. </li></ul> Dissoziation und Plattieren <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die dorsale Streifen haben bis auf den Boden der Röhre nieder. Entfernen Sie die meisten der L-15 +10% HiHS mit einer Pasteurpipette. Schnell Waschen der dorsalen Neuralrohr Streifen einmal durch Zugabe von 3 ml kaltem (4 ° C) HBSS. </li><li> Lassen Sie die dorsalen Neuralrohr Streifen für 2 Minuten absitzen, dann entfernen Sie die HBSS mit einer Pasteurpipette. </li><li> Fügen Sie warmes (37 ° C) HBSS auf ein Volumen von 4,7 ml. THenne add 0,3 ml 2,5% Trypsin, um eine endgültige Konzentration von 0,15% Trypsin geben. </li><li> Bei 37 ° C im Wasserbad für 7 min. Mix einmal sanft auf halbem Wege durch die Inkubation. </li><li> Zugabe von 30 ul DNAse (25 000 U / mL) für eine Endkonzentration von 150 U / mL. Add 60 ul MgSO 4 und kurz mischen, für eine endgültige Konzentration von 0,15%. Für Gewebe aus groben Dissektionen, gegen 1 Minute bei 37 ° C im Wasserbad. Zu diesem Zeitpunkt sollte der dorsalen Neuralrohr Abschnitte fragmentiert. Wenn der dorsalen Neuralrohr Abschnitte nicht zu fragmentieren begonnen haben, bedeutet das normalerweise, dass die 2,5% Trypsin Lager alt ist, und neue Lager sollte aufgetaut werden, oder das Waschen mit kaltem HBSS nicht effektiv entfernen HiHS aus der Probe. </li><li> Zentrifugieren Sie die Gewebestücke bei 200 g für 4 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette verlassen ~ 50-100 ul der Flüssigkeit am Boden des Röhrchens. </li><li> Flick das Rohr vorsichtig, um das Pellet zu lösen, dann waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 5 ml warmem HBSS. Lassen Sie regeln bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Zentrifugation bei 200 g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette verlassen ~ 50-100 ul der Flüssigkeit am Boden des Röhrchens. </li><li> Flick das Rohr vorsichtig, um das Pellet zu lösen und teilweise resuspendieren. Dann fügen Sie 2 ml warmem HBSS. </li><li> Mit dem kleinen (Halb-Durchmesser) feuerpolierten Glas Pasteur Pipette auf die Zellen durch Pipettieren langsam up-and-down 4-6 mal distanzieren. Vermeiden Sie Blasen und Pipette die Flüssigkeit gegen die Seite des Rohres. Nicht zu verreiben. </li><li> Verwenden Sie den kleinsten Feuer-poliertem Glas Pasteurpipette weiter distanzieren die Zellen durch Pipettieren langsam up-and-down 3-4 mal. Vermeiden Sie Blasen und Pipette die Flüssigkeit gegen die Seite des Rohres. Nicht zu verreiben. Für Gewebe aus groben Dissektionen, fügen Sie ein extra 1 ml warmem HBSS auf das Rohr am Ende der Dissoziation. Wenn Dissoziation der Zellen, ist es nicht notwendig, alle Zellklumpen und Aggregate zu distanzieren. Stoppen Pipettieren up-and-down oder wechseln Sie zu einer Pasteurpipette mit einem kleineren Durchmesser, wenn Sie keine weitere Abnahme in der Größe der Zellaggregate mit weiteren Pipettieren zu sehen. </li><li> Lassen Sie alle verbleibenden Gewebestücke in die Röhre niederzulassen für 1 min. Es ist nicht nötig, die Zellen in ein neues Röhrchen übertragen. </li><li> Nehmen Sie 20 ul Zellsuspension und mit 5 ul der Trypanblau. Zählen von Zellen auf einem Hämocytometer. Neuronen sollte ≥ 95% lebensfähig durch Trypanblau-Ausschluss. </li><li> Platte der Neuronen in Neurobasal Plating Medien (siehe Rezepte unten). <ul><li> Empfohlene plating Dichten für den Erhalt von isolierten Neuronen (Low-Density-Kulturen von Neuronen Verklumpen oder einander überlappend zu vermeiden): </li><li> 120 000 - 180 000 Zellen / Well für eine 6-Well-Platte </li><li> 60 000 - 75 000 Zellen / Well für eine 12-Well-Platte </li></ul></li><li> 16-18 Stunden später, ändern Sie die Medien Neurobasal Growth Media (siehe Rezepte unten) Verwenden Sie nicht eine Vakuumpumpe, die Medien von der Kulturschale absaugen beim Wechseln der Medien; vorsichtig mit einer Pipette. Dadurch wird vermieden, verdrängen die Neuronen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Vier Stunden nach dem Ausplattieren sollte Neuronen, die Poly-L-Lysin (PLL)-beschichteten Fläche geklebt haben. Unter Phasenkontrast-Beleuchtung, eingehalten werden Zellkörper in der Regel relativ flach und oval (Abb. 2a). Zellen, die nicht gut sind eingehalten erscheinen als Kugeln, die etwas bewegen, wenn die Schale sehr schonend ist auf der Seite erschlossen. Viele Faktoren können möglicherweise behindern die Adhäsion von Zellen (siehe Diskussion). Nach 30 Stunden in vitro, haben die meisten Neuronen ein Axon mit einem sichtbaren Wachstum Kegel (Abb. 2c, d) verlängert. Wenn arme axonale Wachstum beobachtet wird, ob die Neurobasal Nährmedien mit frischem Medium und Ergänzungen vorgenommen wurde. Neuronen bleiben für mindestens 6 Tage in diesen Bedingungen gesund. Dieses Verfahren hat sich als zuverlässig liefern Präparate stark in kommissuralen Neuronen angereichert mit ~ 90% der Neuronen, DCC (Yam et al. 2009). Die Breite des dorsalen Rückenmarks Streifen, der für die Vorbereitung der Zellsuspension verwendet wird, wird Einfluss auf die Reinheit der Kultur, mit größerer Reinheit als dünner Streifen verwendet werden. Ein Anwendungsbeispiel ist in Abbildung 3 (Immunfluoreszenz) gezeigt. Siehe den Artikel von Yam et al. (2009) für weitere Beispiele. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig1tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematics des Rückenmarks Dissektion Schritte. D = Dorsal, V = Ventrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1773/1773fig1.jpg">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung zu sehen.</a> <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Repräsentatives Ergebnis von isolierten kommissuralenNeuronen auf einer PLL-beschichteten Deckglas beschichtet. a, b) 4 Stunden nach dem Ausplattieren wurden Neuronen an der Oberfläche festhält. Bar = 20 um. c, d) 30 Stunden nach dem Ausplattieren wurden die meisten Neuronen ein Axon mit einem sichtbaren Wachstum Kegel verlängert. Bar = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. A kommissuralen Neuron immungefärbt für Gamma-Tubulin (grün), mit F-Aktin durch Phalloidin (F-Aktin, rot) und die im Kern mit DAPI (blau) markiert. Rezepte und Kommentare Neurobasal Plating Medien <ul><li> Neurobasal </li><li> 10% Hitzeinaktivierte FBS (HiFBS) </li><li> 2 mM L-Glutamin (200 mM Stammlösung) Optional: Penicillin / Streptomycin Antibiotika (Einsatz die Hälfte der normalen Konzentration) </li></ul> Neurobasal Growth Medien <ul><li> Neurobasal </li><li> B27 (1 / 50 Verdünnung ab Lager lieferbar) </li><li> 2 mM L-Glutamin (200 mM Stammlösung) </li><li> Optional: Penicillin / Streptomycin Antibiotika (Einsatz die Hälfte der normalen Konzentration) Nachdem die Medien gemacht wird, kann es bei 4 ° C für zwei Wochen aufbewahrt werden. Um die Temperatur und den pH-Wert der Medien vor dem Ausplattieren der Zellen, setzen Medien in Gewebekultur Petrischalen und in einer Gewebekultur-Inkubator für mindestens 1,5 Stunden ruhen. </li></ul> Neurobasal Nach einer Flasche Neurobasalmedium geöffnet worden ist, kann es für einen Monat bei 4 ° C aufbewahrt werden in der Dunkelheit. Entsorgen Neurobasal die seit mehr als einem Monat eröffnet wurde sonst das Überleben der Zelle niedriger sein wird. Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum (HiFBS) oder Pferdeserum (HiHS) Um Wärme-Inaktivierung FBS oder HS-, Wärme bei 56 ° C im Wasserbad für 30 Minuten. Schwenken Sie die Flasche ca. alle 10 Minuten oder so. (Für Richtigkeit Verwendung einer Flasche von ähnlicher Größe mit Wasser gefüllt. Setzen Sie ein Thermometer in die Wasserflasche, um zu sehen, wenn 56 ° C erreicht ist. Begin Zeitpunkt an dieser Stelle.) Hitzeinaktivierte FBS müssen gegebenenfalls zentrifugiert, um klar ausfällt, und kann aliquotiert und wieder gefroren bei -20 ° C. L-Glutamin Immer Tauwetter ein frisches Aliquot von L-Glutamin für jeden Versuch. B27 Aliquots der B27 kann bei 20 ° C gehalten werden für die langfristige Lagerung oder bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.

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	<li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li><li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc.">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li><li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression.">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons.">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li><li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical,+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway.">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li></ol>

Wir haben eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus embryonalen Ratte Rückenmark beschrieben. Dieses Verfahren wurde routinemäßig in unserem Labor verwendet werden, um zuverlässig vorzubereiten Neuronen, die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon Anleitung zu studieren. Für Zellbiologie und Immunchemie Experimenten Dissektion einen Wurf erzeugt genügend Neuronen. Wenn mehr Zellen benötigt werden, können wie in vielen biochemischen Experimenten Dissektion der zwei Würfe erforderlic...

Dissection der embryonalen Ratte Rückenmark (siehe auch Tabelle I) <ul><li> E13 Schwangerschaft inszeniert Ratte </li><li> Ethanol 70% </li><li> Chirurgische Schere, Fine Science Tools </li><li> Pinzetten, Dumont Nr. 5, Fine Science Tools </li><li> Petrischalen </li><li> L-15-Medium </li><li> Dissection Mikroskop Leica </li><li> Plastic Transferpipetten </li><li> Mikroschere, Fine Science Tools </li><li> Tungsten Nadeln und Pin-Halter (eine hakenförmige Nadel, einem L-Formen Nadel, eine gerade Nadel), Fine Science Tools </li><li> Hitzeinaktivierte Pferdeserum (HiHS) </li><li> 15 ml Plastikröhrchen </li></ul> Kommissuralen Neuron Kultur (siehe auch Tabelle I) <ul><li> Gewebekultur Inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2, Feuchte gesteuert) </li><li> Deutsch Desag Deckgläser und / oder Kunststoff Gewebekulturschalen </li><li> Poly-L-Lysin, Sigma </li><li> Sterile milliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum (HiFBS) </li><li> L-Glutamin </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Penicillin / Streptomycin Antibiotika </li><li> 37 ° C im Wasserbad </li><li> Sterile Pasteur Pipetten </li><li> Bunsen-Gasbrenner </li><li> HBSS, Ca 2 + / Mg 2 +-freien, Invitrogen </li><li> DNAse, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Zentrifuge </li><li> Hämazytometer </li><li> Trypanblau-Lösung </li></ul>

dissection and culture of commissural neurons from embryonic spinal cord

Kommissuralen Neuronen wurden häufig verwendet, um die zugrunde liegenden Mechanismen Axon Führung während der embryonalen Entwicklung des Rückenmarks zu untersuchen. Die Zellkörper dieser Neurone sind in der dorsalen Rückenmark und ihre Axone folgen stereotype Trajektorien während der embryonalen Entwicklung. Kommissuralen Axone zunächst ventral Projekt auf die Bodenplatte. Nach dem Überqueren der Mittellinie, diese Axone anterior und Projekt in Richtung des Gehirns. Jeder dieser Schritte wird durch die Wirkung von mehreren Führung Cues geregelt. Kulturen stark in kommissuralen Neuronen angereichert sind ideal für viele Experimente Bewältigung der Mechanismen der Axon Wegfindung, einschließlich Drehen Assays, Immunchemie und Biochemie geeignet. Hier beschreiben wir eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Zuerst wird das Rückenmark isoliert und dorsalen Streifen sind herauspräpariert. Die dorsale Gewebe wird dann in eine Zellsuspension durch Trypsinierung und mechanische Störungen dissoziiert. Neuronen sind auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläschen oder Gewebe-Kulturschalen plattiert. Nach 30 Stunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Haben die meisten Neuronen ein Axon verlängert. Die Reinheit der Kultur (Yam<em&gt; Et al.</em&gt; 2009), in der Regel über 90%, kann durch Immunomarkierung mit dem kommissuralen Neuron Marker DCC, LH2 und TAG1 (Helms und Johnson, 1998) beurteilt werden. Diese neuronale Vorbereitung ist ein nützliches Werkzeug für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Untersuchungen der zellulären und molekularen Mechanismen der kommissuralen Axon Wachstum und Führung während des Rückenmarks Entwicklung.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dieses Video zeigt eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Dissoziiert kommissuralen Neuronen sind nützlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon-Wachstum und Anleitung zu studieren.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K Aufrufe.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal. Dieses Video zeigt eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Dissoziiert kommissuralen Neuronen sind nützlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon-Wachstum und Anleitung zu studieren.

Serie: Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...