Wir demonstrieren die Verwendung eines simulationsüberwachten maschinellen Lernwerkzeugs zur Analyse von Mitochondrien in fluoreszierenden Mikroskopiebildern fixierter Zellen. Aktuelle Methoden zur Segmentierung von Mitochondrien in Mikroskopiebildern umfassen automatische Schwellenwertmethoden wie Ostu oder manuelle Segmentierung. Schwellenwertbasierte Techniken schneiden schlecht ab, wenn das Signal-Hintergrund-Verhältnis niedrig ist.
Typischerweise zeigen Bilder für die morphologische Analyse eine große Anzahl von Mitochondrien, was die manuelle Segmentierung mühsam macht. Überwachte Deep-Learning-Methoden führen eine Segmentierung mit hoher Genauigkeit durch, erfordern jedoch eine große Anzahl von Ground-Truth-Paardaten für das Training. Dieser Ansatz verwendet einen physikbasierten Simulator, um Paare von Mikroskopiebildern und deren 2D-Ground-Truth-Formmaske zu erzeugen, wodurch die Notwendigkeit einer manuellen Annotation entfällt.
Das Modell, das auf simulierten Bildern trainiert wurde, wird dann verwendet, um Mitochondrien in realen Mikroskopbildern zu segmentieren. Wir verwenden ein Deep-Learning-basiertes Segmentierungstool, das die Automatisierung dieser Aufgabe mit hoher Genauigkeit ermöglicht und keinen kommentierten Ground-Truth-Datensatz für das Training erfordert. Die Simulation beginnt mit der Geometriegenerierung mittels parametrischer Kurven zur Formgenerierung.
Emitter werden gleichmäßig verteilt und zufällig auf der Oberfläche der erzeugten Form platziert, so dass die Dichte den experimentellen Werten entspricht. Eine 3D-PSF des Mikroskops wird mit dem Gibson-Lanni-Modell berechnet. Um einen Fotorealismus zwischen den simulierten Bildern und den experimentellen Bildern zu erreichen, emulieren wir sowohl die dunklen als auch die aufgenommenen Geräusche.
Die physikalische Grundwahrheit wird in Form einer binären Abbildung erzeugt. Wir untersuchen die Wirkung der CCCP-Behandlung auf die Mitochondrienmorphologie von fixierten Kardiommyoblasten, die mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet wurden. Zellkultur.
Bereiten Sie sich auf die Aussaat der Zellen vor, indem Sie in einer sterilen Laminar-Flow-Haube arbeiten, indem Sie einen Deckschein für jede Versuchsbedingung in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte legen. Stellen Sie sicher, dass die verdünnte Zellsuspension richtig gemischt ist, indem Sie den Inhalt des Zentrifugenröhrchens mehrmals auf und ab pipettieren, bevor Sie das entsprechende Volumen an jede Vertiefung abgeben. Experimentelles Verfahren.
Saugen Sie Zellkulturmedien aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte ab und tragen Sie dann schnell frische vorgewärmte Medien auf die Kontrollmulden und die vorgewärmten Medien mit 10 Mikromolar CCCP-Lösung auf die Testbedingungsmulden auf. Inkubieren Sie zwei Stunden im 37-Celsius-Zellinkubator. Zellkulturmedien aus den Vertiefungen absaugen und die vorgewärmte Fixierlösung auftragen.
Färbung und Montage von Zellen auf Deckblättern. Fügen Sie 10 Mikroliter Montagemedien zu einem vorbereiteten Glasobjektträger hinzu, um einen Abdeckschein zu montieren. Nehmen Sie den Abdeckschein von der 12-Well-Platte mit einer Pinzette auf und tupfen Sie Feuchtigkeit von den Deckblättern, indem Sie kurz den Rand und die Rückseite des Bezugsschlitzes an das vorbereitete fusselfreie Papiertuch berühren.
Senken Sie den Deckel vorsichtig auf den wartenden Tropfen der Montagemedien. Mikroskop und Bildgebung. Stellen Sie mit dem Okular die Z-Stufe manuell ein, um die Probe im Fokus zu haben.
Wechseln Sie zur Registerkarte "Erworben" in der Software. Verwenden Sie das intelligente Setup, um den Fluoreszenzkanal für die Bildgebung auszuwählen. Array-zentriert auf der Mitte des Cover-Slips mit insgesamt 12 abzubildenden Positionen.
Positionieren Sie RA zentriert in der Mitte des Abdeckbelegs. Es ist möglich, mehrere Standorte automatisiert abzubilden. Generieren simulierter Trainingsdaten.
Laden Sie den Code herunter und entpacken Sie den Inhalt. Folgen Sie den Anweisungen und der Readme-Datei, um die Umgebung einzurichten. Navigieren Sie zum Ordner src"Erstellen Sie eine Kopie oder verwenden Sie den Ordner 2.
Mitochondrien Simulation Airy" und benennen Sie es um. Dieser Ordner enthält alle Dateien, die sich auf die Simulation der Trainingsdaten beziehen. Für die Simulation müssen drei Parametersätze eingestellt werden.
Legen Sie zunächst die Parameter Anzahl der Mitochondrien, Durchmesserbereich, Bereich der Z-Achse und Dichte der Fluorophore für den Simulator in der Batchkonfigurationsdatei fest. Als nächstes legen Sie die optischen Parameter der numerischen Apertur, der Vergrößerung und der minimalen Wellenlänge des Datensatzes in der Datei microscopePSFmode fest. py"Stellen Sie den gewünschten Wert für Pixelgröße und Emissionswellenlänge im Feuer generate_batch_parallel ein.
py"Legen Sie den dritten Satz von Parametern für das Ausgabedataset fest, z. B. die Größe der Ausgabebilder, die Anzahl der Kacheln in jedem Bild und die Anzahl der Gesamtbilder in der generate_batch_parallel Datei. py"Führen Sie die Datei generate_batch_parallel aus. py", um die Simulation zu starten.
Um das Bild in der endgültigen Größe zu erhalten, erstellen Sie eine Kopie des Ordners mit dem Namen 5. Datenaufbereitung und Schulung/Datenaufbereitung" und navigieren Sie hinein. Legen Sie die Parameter der Stapelanzahl und der Anzahl der Bilder pro Stapel fest, der Bereich des Rauschens, der in die Datei Data_generator eingefügt werden soll.
py"Führen Sie die Datei Data_generator aus. py"Erstellen Sie die Montagebilder. Kopieren Sie die Ordner "image" und "segment" in den Ordner "datatrain/train".
Deep-Learning-basierte Segmentierung. Um das Segmentierungsmodell für eine neue Mikroskopbildeinstellung zu trainieren, navigieren Sie zum Ordner "train" und legen Sie die Parameter Bachgröße, Backbone-Modell für die Segmentierung, die Anzahl der Epochen und die Lernrate für das Training in der Datei mit dem Namen train_unet fest. py"Führen Sie die Datei train_unet aus.
py", um das Training zu starten. Der Trainingsprozess zeigt die Metrik zur Bewertung des Segmentierungsmodells auf dem simulierten Validierungssatz an. Nach Abschluss des Trainings wird das Modell als best_model gespeichert.
h5"im Ordner "train"Um das Modell auf den Mikroskopbildern zu testen, müssen die Bilder auf die vom Zugmodell gewünschte Größe aufgeteilt werden. Navigieren Sie dazu zum Ordner 6. "Testdaten vorbereiten" und die PNG-Formatdateien der Daten in den Ordner "PNG" kopieren und die Datei split_1024_256 ausführen.
py"Dadurch werden 256 x 256 Ausschnitte der Bilder im Datenordner erstellt. Um Bildausschnitte zu segmentieren, wechseln Sie zum Ordner 7. Testsegmentierung" und führen Sie die Datei mit dem Namen segment aus.
py"nach dem Festlegen des Namens des zu verwendenden gespeicherten Modells. Die segmentierten Bilder werden im Ausgabeordner gespeichert. Morphologische Analyse.
Platzieren Sie die Datei mit dem Namen make_montage. py" in den Ordner 7. Testsegmentierung" und führen Sie die Datei aus, um die segmentierte Ausgabe wieder auf die ursprüngliche Größe des Bildes zu setzen.
Erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen 9. Morphologische Analyse" in den Quellordner und navigieren Sie hinein. Installieren Sie die Bibliotheken skan und seaborn mit dem Befehl pip install seaborn skan"Die Segmentierungsmasken werden mit der Bibliothek namens skan skan skelettiert, um die Analyse der Topologie des einzelnen Mitochondriums zu ermöglichen.
Legen Sie die Datei im Ordner 9 ab. Morphologische Analyse"Ordnen Sie die Bilder verschiedener Gruppen des Experiments in verschiedenen Ordnern innerhalb des Ordners 7 an. Testsegmentierung"Führen Sie die Datei aus, um Diagramme für die Analyse zu erstellen. Befund.
Die durchzuführende quantitative Analyse hängt von den Forschungsfragen oder der Hypothese ab. In unserem Experiment interessierten wir uns für die drei verschiedenen Morphologien der Mitochondrien, nämlich Punkte "kleine Mitochondrienbits, Stäbchen" faserartige oder kettenartige Mitochondrien und multiverzweigte Netzwerke"Um die Morphologie zu identifizieren, skelettieren wir zunächst die Segmentierungsausgabe und analysieren die Zweigglieder der verschiedenen Klassen. Wir zeigen die Ergebnisse der Analyse für die beiden Gruppen von galactoses angepassten Zellen, die Kontrollgruppe und die CCCP behandelte Gruppe.
Wir sehen einen signifikanten Anstieg der mittleren Astlängen von Punkten, was angesichts der Schwellung der Mitochondrien erwartet wird, wenn sie CCCP ausgesetzt sind. Der Prozentsatz der Mitochondrien in einzelnen Längen sowohl der Stäbchen als auch der Netzwerkklassen ist im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduziert, wenn die Zellen mit CCCP behandelt wurden, was unsere Hypothese bestätigt. Ein herausforderndes Szenario für unsere Methode ist, wenn das Bild dicht gepackte Mitochondrien hat.
Die rosa Farbe zeigt das längste einzelne Mitochondrium an, das im Bild entdeckt wurde, was durch den erhöhten Fehler in den Segmentierungsergebnissen verursacht wird. Diese Versagensfälle können durch eine Kontrolle der Länge der Mitochondrien und mit morphologischen Operatoren erkannt werden. Während unsere Anwendung ein Beispiel dafür ist, wie wir die mitochondriale Morphologie analysiert haben, glauben wir, dass eine solche Analyse und Forschungsfragen für verschiedene Aspekte der Mitophagie und verwandter biologischer Experimente formuliert werden kann.
