Dieses Protokoll repliziert ein intraventrikuläres Kathetersystem, das in laufenden klinischen Studien verwendet wird, um die lokale regionale Verabreichung einer CAR-T-Zell-Therapie gegen Tumore des zentralen Nervensystems zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, mehrere wiederholte Dosen der lokalen regionalen CAR-T-Zell-Therapie zu verabreichen, ohne mehrere invasive chirurgische Eingriffe durchführen zu müssen. Dieses System könnte verwendet werden, um verschiedene Therapeutika an verschiedenen Verabreichungsorten zu untersuchen, und könnte so Einblicke in eine Vielzahl von Forschungsbereichen in den Neurowissenschaften geben.
Legen Sie zunächst die betäubte Maus mit rasiertem Kopf auf den Operationstisch und öffnen Sie vorsichtig die Unterseite des stereotaktischen Arms mit einem Spatel. Führen Sie die Kanüle mit einer Pinzette ein und sichern Sie sie, indem Sie die Schraube am Arm festziehen, bis die Hälfte bis zwei Drittel des weißen Kunststoffteils und fünf Millimeter der Kanüle aus dem Boden der Öffnung herausragen. Setzen Sie die oberen Zähne der Maus ein und befestigen Sie sie in der Beißleiste des stereotaktischen Apparates.
Ziehen Sie den Nasenkegel nach vorne und ziehen Sie ihn fest, um sicherzustellen, dass die Maus Isofluran einatmet. Montieren Sie dann die Maus mit Ear Cuffs oder Ear Bars auf dem erwärmten stereotaktischen Gerät, um übermäßigen Druck zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Operationsstelle und machen Sie einen Schnitt parallel zum Schädel, wie im Manuskript beschrieben.
Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Faszien wegzudrücken. Identifizieren Sie die Orientierungspunkte, Bregma und Lambda auf dem Schädel, die den vorderen und hinteren Markierungen entsprechen, wo sich die Schädelplatten treffen. Um eine Oberfläche für die Befestigung des Acryls zu schaffen, machen Sie mit einem Skalpell vorsichtig mehrere Schlitze quer durch den Schädel.
Lokalisieren Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm an der gewünschten Orientierungsstelle. Heben Sie die Kanülenspitze ein bis zwei Millimeter über die Schädeloberfläche und bewegen Sie sie zu den gewünschten Koordinaten. Bohren Sie mit einer 18-Gauge-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer zwei Schraubenlöcher in den freiliegenden Schädel, weg von der Stelle, an der die Kanüle eintritt, und sorgen Sie für genügend Platz für die Kanüle.
Drehen Sie den Bohrer durch das Schraubenloch, bis er am Schädel befestigt ist. Setzen Sie mit einem Schlitzschraubendreher zwei Schrauben in die Löcher ein und befestigen Sie sie. Ziehen Sie dann die Schraube vorsichtig nach oben, um sicherzustellen, dass sie gesichert ist.
Um eine Kanüle einzuführen, erzeugen Sie an den angegebenen Koordinaten mit einer 18-Gauge-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer ein Loch in den Schädel. Senken Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm auf die gewünschte DV-Koordinate ab. Bei ca. 0,3 Gramm Acrylharzpulver und 10 bis 15 Tropfen Flüssigkeit in einer 12-Well-Porzellanplatte wird das vorbereitete viskose, weiß gefärbte Material in eine Ein-Milliliter-Spritze gegeben.
Beschichten Sie den Schädel und füllen Sie die Zwischenräume um die Kanüle und die Schraube aus. Lösen Sie die Schraube am stereotaktischen Arm, während der Zement flexibel ist. Lösen Sie die Kanüle vorsichtig mit einem Spatel aus der Halterung an der unteren Öffnung und ziehen Sie den stereotaktischen Arm von der Maus weg.
Sobald der Zement getrocknet ist, führen Sie die Dummy-Kanüle in die Führungskanüle ein und drehen Sie sie im Uhrzeigersinn, um sie fest zu befestigen. Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, bringen Sie die Maus zur Erholung in ihren beheizten Käfig zurück. Um die Behandlungskanüle vorzubereiten, führen Sie ihren Deckel in den PKG-Schlauch ein.
Füllen Sie dann die Behandlungsspritze mit CAR-T-Zell-Suspension und führen Sie sie durch das andere Ende des PKG-Röhrchens ein, so dass die Oberseite der Behandlungskanüle bedeckt ist. Nachdem Sie die Maus betäubt haben, fixieren Sie die Führungskanüle mit einer Pinzette an der Basis. Schrauben Sie die Dummy-Kanüle ab und entfernen Sie sie, um Zugang zur Führungskanüle zu erhalten.
Infundieren Sie die CAR-T-Zellen für eine Minute und halten Sie die Behandlungskanüle für eine weitere Minute an Ort und Stelle. Schrauben Sie nach dem Entfernen der Behandlungskanüle eine Dummy-Kanüle fest zurück. Verabreichen Sie dann Meloxicam subkutan zur Schmerzkontrolle.
Die GPC2-gerichtete CAR-T-Zell-Therapie induzierte eine signifikante Tumorregression im Medulloblastom und ein signifikant verlängertes Überleben im thalamischen diffusen Mittelliniengliommodell. Beim Einführen der Führungskanüle in eine intratumorale Position ist es wichtig zu verstehen, dass die dorsal-ventralen Koordinaten oberflächlicher sein können als bei der Tumorinjektion, um die Projektionslängen des Dummys und der Behandlungskanüle zu berücksichtigen.
