Die Autoren bedanken sich bei Verlene Henry und Lindsay Holmes um Hilfe danke in der Entwicklung dieses Modells. Diese Arbeit wurde teilweise durch die James S. McDonnell Foundation (# 220020173) finanziert.

1. Zell-Linien <ol><li> U87MG Gliom-Zellen sind in großen Zellkulturflaschen mit DMEM-F12 mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) kultiviert. </li><li> Die Zellen werden durch Waschflaschen zweimal mit warmem Phosphate geerntet Buffered Saline (PBS) und Inkubation bei 37 ° C für 5 Minuten mit 10 ml PBS mit 0,25% Trypsin und 0,05% EDTA. Sobald Zellen sind aufgehoben, sie in eine 50 ml Tube mit 10 ml von Kulturmedien und zentrifugiert (300 X g für 4 min) platziert werden. </li><li> Nach dem Waschen werden die Zellen bei einer Konzentration von 10 resuspendiert x 10 6 / ml in Kulturmedien, die für eine Impfung von 50.000 Zellen / 5 ul erlaubt. </li><li> Die Zellen werden auf Eis, bis intrakranieller Injektion gehalten. </li></ol> 2. Führungsschraube intrakraniellen Verschraubung Dieses Verfahren kann durchgeführt werden einige Tage vor der Injektion von Zellen. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt. <ol><li> Mäuse (BALB / c nu / nu weiblich, 5-6 Wochen, ca. 18g) sind zum Zwecke der Identifizierung nummeriert, gewogen und anästhesiert mit einer intraperitonealen (ip) Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg). </li><li> Die Haut ist nach unten mit einer Jodlösung abgewischt und einen kleinen Schnitt (2-3 mm) ist auf der rechten Seite der Mittellinie und vor dem interauralen Linie gemacht. Dies macht die koronaren und sagittalen Naht des Schädels. Die Bregma liegt an der Kreuzung der beiden Nähte positioniert. </li><li> Die Führungsschraube Einstiegspunkt wird dann an einem Punkt, 2,5 mm lateral und 1 mm anterior der Bregma markiert. Dieser Punkt befindet sich direkt oberhalb des Nucleus caudatus 1 befindet. </li><li> Ein 1 x 1 mm tiefes Loch wird mit einer sterilen Hand Spiralbohrer durch den Schädel an die Dura gebohrt. </li><li> Ein sterilisiert Führungsschraube, dass 1,6 mm unter der Oberfläche Schädel in die dura verlängern wird dann in das Loch mit einem Schraubendreher verschraubt, bis sie bündig mit dem Schädel (Abbildung 1A). </li><li> Eine sterile Stilett oder Schraube Dummy wird dann in die zentrale Bohrung der Führungsschraube platziert, um die Öffnung (Abbildung 1B) zu schließen. </li><li> Die Wunde wird mit Vetbond Gewebekleber (n-Butyl-Cyanoacrylat) und die Mäuse sind geschlossen eine intraperitoneale Injektion von Reversin (kleine Tiere) (0,1 ml / kg) und Carprofen (5 mg/kg/100 ul) zur Analgesie gegeben. Mäuse sind dann erlaubt, auf eine Erwärmung Matte (36 ° C), welche bis zu 20 Minuten zu erholen. Mäuse sind häufig kontrolliert und beobachtet während dieser Erholungszeit, bis sie bei vollem Bewusstsein sind. </li></ol> 3. Intrakranielle zellulären Transplantation <ol><li> Eine sterile gefesselt Hamilton-Spritze wird durch Anlegen eines kleinen Kunststoffring an der Nadelspitze so dass nur 2 mm von der Nadel unter die Führungsschraube Steckdose (Abbildung 1B) erweitern vorbereitet. Die letzte Impfung Punkt ist also 3,5 mm unterhalb der Kopfoberfläche. </li><li> Vier Tage nach der Führungsschraube Chirurgie, werden die Mäuse wieder betäubt wie oben (2,1) und einen kleinen Schnitt wird über die Führungsschraube gemacht, um das Stilett zu entfernen. </li><li> Die Handschellen Hamilton Spritze wird dann mit 5 ul gut gemischt Zellen unter vorsichtshalber nicht zu erstellen oder erstellen Luftblasen gefüllt. </li><li> Die Spritze wird die Perfusionspumpe gesichert und die Nadel in die Führungsschraube (Abbildung 1C) eingesetzt. Die Zellen werden dann mit einer Rate von 30 ul pro Stunde infundiert. </li><li> Die automatisierte Vorrichtung (Abbildung 1D) erlaubt es uns, spritzen bis zu 10 Tieren in einer Zeit auf einem konstanten Durchfluss. Zellen können auch manuell mit dem gefesselten Hamilton-Spritze injiziert werden oder alternativ die Spritze kann Handschellen durch einen 200 ul Pipettenspitze, die von 3 mm wurde beschnitten, damit die Nadelspitze, über die Führungsschraube von 2 mm zu erweitern. Die Injektion muss dann mit einer konstanten gleichmäßigen Tempo durchgeführt werden. </li><li> Wenn Infusion abgeschlossen ist, wird die Spritze vorsichtig entfernt und das Stilett in die Führungsschraube ersetzt. Die Wunde wird verklebt geschlossen und die Mäuse sind Erholung Medikamente wie zuvor (2,7) gegeben und man ließ sie auf einer Erwärmung Matte zu erholen. </li></ol> 4. Therapeutische Herausforderung <ol><li> Vier Tage nach dem U87MG Zellinokulation sind Mäuse gewogen und nach dem Zufallsprinzip in Kontroll-und Behandlungsgruppen aufgeteilt. </li><li> Die Kontrollgruppe ist eine intraperitoneale (ip) Injektion von PBS (100 ul) gegeben, während der Behandlungsgruppe eine IP-Injektion von AMG102 (100 ug in 100 ul PBS) gegeben ist. </li><li> Die Injektionen werden wiederholt jeden zweiten Tag für 14 Tage, insgesamt 6 Injektionen (Abbildung 2). </li><li> Nach der letzten Injektion werden die Mäuse täglich überwacht und wog jeden zweiten Tag. </li><li> Wenn Mäuse zu erheblichen neurologischen Störungen (Saldo Störungen, Lähmungen), Dehydrierung, oder mehr als 10% Gewichtsverlust oder sterbender Display begann, waren sie human eingeschläfert. Diese humane Endpunkt Tage waren dann auf der Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve aufgezeichnet. </li></ol> 5. Evaluation der therapeutischen Effizienz </p&gt; <ol><li> Die Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve wurde unter Verwendung GraphPad Prism 4.03 für Windows; GraphPad Software, San Diego Kalifornien USA, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Todesfälle oder euthanizations wurden als Endpunkt Ereignissen geprägt und erzielte als 1. Tiere, die lebend am Ende des Experiments blieben als Nicht-Ereignisse aufgezeichnet und erzielte als 0 ist. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Kontrolltiere begann Anzeichen von neurologischen Störungen und Gewichtsverlust 23 Tage nach der ersten Impfung von Zellen zeigen. Dies wurde deutlich in der AMG102 behandelten Gruppe um 35 Tage verzögert. In der Tat für Tag 35, 77% (n = 9.7) in der Kontrollgruppe waren eingeschläfert. Die Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve zeigt deutlich den signifikanten Anstieg im Überleben in Reaktion auf AMG102 Behandlung (Abbildung 3). Am Tag 70, hatten 88% der Kontroll-Mäusen eingeschläfert (n = 9.8) im Vergleich zu 37% (n = 8.3) von AMG102 behandelten Gruppe. Histologische Analyse der Gehirne bestätigt, dass alle 9 Tiere in der Kontrollgruppe entwickelten Tumoren nur 3 der 8 AMG102 behandelten Mäusen (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" /> Abbildung 1: Bild (A) zeigt intrakraniellen Führungsschraube in einem Bereich unmittelbar oberhalb des Nucleus caudatus liegt positioniert. Die Handschellen Hamilton-Spritze (mit Zellen vorinstalliert) wird dann in der Führungsschraube platziert, so dass 2 mm der Nadel erstreckt sich über die Führung und die Zellen sind 3,5 mm innerhalb des Nucleus caudatus injiziert. Die Spritze wird später entfernt und durch ein Stilett (B) ersetzt. Die automatische Infusionsvorrichtung (C) injizieren können bis zu 10 Tiere auf einmal. Dargestellt sind fünf gleichzeitige Injektionen (D). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Studienprotokolls. Die Zellen wurden am Tag 0 mit der Behandlung beginnen am Tag 4 injiziert. Kontrolltiere erhielten eine Injektion von PBS (100 ul) IP während der Behandlung erhielten eine Injektion von AMG102 (100 g/100 ul) IP. Diese Injektionen wurden jeden zweiten Tag für 10 Tage. Es wurden insgesamt 6 Injektionen gegeben wurden. Die Tiere wurden dann für 70 Tage auf Anzeichen von neurologischen und körperlichen Störungen überwacht. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" /> Abbildung 3: Kaplan-Meier Überlebenskurven verglichen Steuerung und AMG102 behandelten Mäuse. Signifikanten Überlebensvorteil war nach der Behandlung mit AMG102 (p = 0,005) erzielt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" /> Abbildung 4: Mikrophotographien von koronalen Hirnschnitten demonstrieren Tumorentwicklung in den Kontroll-Tieren (A) und kein Gehirntumor Entwicklung in den AMG102 behandelten Tieren (B). Maßstabsbalken ist 1 mm.

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	<li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals.">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li><li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMG+102,+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+neutralizing+antibody,+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts.">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li><li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+oncogene+addiction:+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases.">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li><li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102.">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li><li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+(rilotumumab)+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li><li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model.">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li><li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+brainstem+tumor+model:+functional+and+histopathological+characterization.">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li><li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels,+activation+status,+and+heterodimerization.">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li><li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors.">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li><li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma.">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li></ol>

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von Amgen Inc. unterstützt

Die intrakranielle Führungsschraube hier vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Etablierung von intrakraniellen Xenotransplantate und in die Hände eines ausgebildeten Tier-Techniker, dieses Verfahren ist sehr einfach und ohne die Notwendigkeit eines stereotaktischen Gerät durchgeführt. Unsere Methode kombiniert die Verwendung einer Führungsschraube, um genau zu lokalisieren die Region des Gehirns am besten geeignet für in vivo Tumor-Entwicklung und eine automatisierte Infusionspumpe, die für die gleichzeitige Impfung von bis zu 10 Tiere auf einmal erlaubt. Die Führungsschraube Augmentation dauert weniger als 5 Minuten in Anspruch. Die automatisierte Infusion von Zellen bei 30 ul / h dauert nur 10 Minuten für eine 5 ul Volumen. Dies gewährleistet eine genaue Dosierung mit einer konstanten Rate und reduziert das Risiko der Zell-Ausstoß in die extrakraniellen Bereich aufgrund der erhöhten Hirndruck. Wir haben auch dieses Verfahren mit 10 ul durchgeführt und haben keine extra-kraniale Tumorwachstum durch zelluläre Rückfluss beobachtet. Da die automatisierten Infusionspumpe ermöglicht auch mehrere Tiere gleichzeitig geimpft werden wir spritzen bis zu 60 Tiere pro Stunde im Vergleich zu einem stereotaktischen Verfahren, das zu etwa 15 Tieren pro Stunde begrenzt ist. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die Lage des Führungsschraube in den Schädel als seine Position bestimmt der ultimative Ort der Tumormasse. Wenn die Führungsschraube ist zu zentral, die Zellen in einem Bereich zwischen den beiden Hirnhälften während, wenn die Führung zu weit nach vorne gebracht wird injiziert werden, werden die Zellen nicht in das Gehirn überhaupt injiziert werden. Es ist daher wichtig, so genau wie möglich bei der Suche nach der Führung 2,5 mm lateral und 1 mm anterior der Bregma 1. In dieser Studie verwendeten wir einen Stahl Führungsschraube, obwohl aus Kunststoff Führungsschrauben auch für diejenigen Studien, die Bildgebung des Gehirns, wie MRT oder PET 6 erfordern. Auch wenn die automatisierte Infusionspumpe ist unerschwinglich für einige Gruppen, können die Zellen noch manuell schneller als stereotaktische Ansätze injiziert werden. Insgesamt kann diese schnelle, genaue und reproduzierbare Methode zur Gliom, Medulloblastom und Hirnstamm Tumoren 7 zu studieren. Dieses Verfahren hat bereits über 500 Mäusen zwischen unseren beiden Labors mit Todesfällen aufgrund von unerwarteten Narkose Reaktionen (&lt;1%) durchgeführt. Mäuse, die mit der Führung Schraube verschraubt wurden und anschließend infundiert mit Zellen nicht starben oder leiden alle neurologischen Komplikationen als Folge des Verfahrens. Tiere haben seit 100 Tagen ohne Komplikationen überstanden. Obwohl wir zu einer haarlosen Maus, einem immungeschwächten Maus mit Haaren wie die SCID verwenden bevorzugt wäre ebenso angemessen, sofern die Schädel Haar vor war es, die operativ entfernt, damit die Stelle sauber und die Haare stören Führungsschraube verhindern. Es gibt mehrere neuartige Therapeutika derzeit für die Behandlung von Gliomen 8-10 entwickelt. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die subkutane U87MG Gliom Xenotransplantate durch Behandlung mit AMG102 3 kann verhindert werden, ein humanisierter Antikörper, der zur HGF derzeit in der klinischen Evaluierung in Gliom 5. Wir verwendeten die Methode hier beschreiben, intrakranielle U87MG Tumoren im Gehirn von Nacktmäusen zu etablieren. Unsere Studie zeigt deutlich den Nutzen der Methode und zeigt, dass AMG102 deutlich hemmt das Wachstum von orthotopen U87MG Xenotransplantate. Wir werden auch weiterhin dieses Modell verwenden, um festzustellen, was andere Therapeutika in Kombination mit AMG102 verwendet werden, um effektivere Hemmung des Tumorwachstums zu erhalten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFBS </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c nu / nu-Mäusen </td><td> ARC Perth </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schraubenhalter </td><td> Plastics One </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Bohrerhalter </td><td> Plastics One </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Bohrer </td><td> Plastics One </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Screw Guide (Metall) </td><td> Plastics One </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Screw Dummy (Stift) </td><td> Plastics One </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze (10 ul 26g fester Nadel) </td><td> Grace Division Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000 Infusionspumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2003 </td><td> Fakultativ </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo-Pad </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice

Die Transplantation von menschlichen Tumorzellen in das Gehirn von immunsupprimierten Mäusen ist eine etablierte Methode für die Untersuchung von Hirntumoren einschließlich Glioblastom (Gliom) und Medulloblastom. Die weit verbreitete stereotaktische Ansatz erlaubt nur für die Injektion von einem einzigen Tier zu einem Zeitpunkt, ist arbeitsintensiv und erfordert hochspezialisierte Geräte. Die Führungsschraube Methode, die ursprünglich von Lal et al., 1 entwickelt wurde entwickelt, um lästige stereotaktische Verfahren zu beseitigen. Wir beschreiben nun eine modifizierte Führungsschraube Ansatz, der eine schnelle und besonders sicher ist, welche beide kritische ethische Überlegungen. Bemerkenswert ist, unser Verfahren beinhaltet nun eine Infusionspumpe mit bis zu 10 Tiere gleichzeitig mit Tumorzellen injiziert werden. Zur Demonstration der Nützlichkeit dieses Verfahrens haben wir Menschen U87MG Gliomzellen als intrakranielle Xenotransplantate in Mäusen, die dann mit AMG102 behandelt wurden, ein vollständig humaner Antikörper, der zur HGF / Scatter-Faktor derzeit in der klinischen Evaluation 2-5. Systemische Injektion von AMG102 signifikant das Überleben von allen Mäusen mit intrakraniellen U87MG Xenotransplantate verlängert und führte zu einer Reihe von kompletten Heilung. Diese Studie zeigt, dass die Führungsschraube Methode ein kostengünstiges, hoch reproduzierbare Konzept für die Erarbeitung intrakraniellen Xenotransplantate ist. Darüber hinaus bietet es eine relevante physiologische Modell zur Validierung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Hirntumoren.

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Um neue therapeutische Paradigmen für die Behandlung von Gliomen zu bewerten, sind physiologisch relevanten Modelle unerlässlich. Wir nutzen einen implantierbaren Führungsschraube Verfahren für die Einrichtung von intrakraniellen Xenograft-Modelle, schneller und sicherer als stereotaktische Ansätze ist.

Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

a-simple-guide-screw-method-for-intracranial-xenograft-studies-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

23.0K Aufrufe.  Monash Institute of Medical Research. Um neue therapeutische Paradigmen für die Behandlung von Gliomen zu bewerten, sind physiologisch relevanten Modelle unerlässlich. Wir nutzen einen implantierbaren Führungsschraube Verfahren für die Einrichtung von intrakraniellen Xenograft-Modelle, schneller und sicherer als stereotaktische Ansätze ist.

Serie: A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

Führungsdraht Assisted Katheterisierung und Farbstoff Injection for Vascular Mapping von Monochoriale Twin Plazenten

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Forschung

Medizin

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

Epidurale Intrakranielle Druckmessung in Ratten mit einem LWL-Druckaufnehmer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Eine einfache Methode der Maus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Die<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Eine einfache Kritische große Femoral Defect Modell an der Maus

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is required. In most cases, the preferred route of administration is via oral delivery. At the present time, oral delivery is mostly accomplished using an oral gavage procedure, in part, because it can achieve consistent and precise dosing in the animal model. Although this method is well established it does have complications that can result in a high rate of animal attrition. To this end, the procedure introduced here describes an alternative to the oral gavage method in which the desired drug is incorporated into a tastant, orally dissolving strip (ODS) that can simply be presented to the test animal where it is then rapidly taken up with minimal manipulation of the test subject. Herein, we demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

The following protocol describes a novel method for chronic oral drug administration using an orally dissolving strip (ODS) in lieu of the more commonly used oral gavage method. We demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

Unter Verwendung eines Mündlich Dissolving-Streifen für pharmakologische und toxikologische Studien: Eine einfache und Humane Alternative zu Schlundsonde für Tiere

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Ein verbessertes Verfahren zur schnellen Intubation der Luftröhre in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Ein Verfahren zur Quantifizierung der oberen Extremität Leistung im täglichen Leben Accelerometer Verwendung

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...