Die DNA-Faseranalyse ermöglicht es uns zu verstehen, wie sich Nanomaterialien auf die DNA auf einzelmolekularer Ebene auswirken. Und diese Informationen werden es ermöglichen, Strategien zu entwickeln, die die Nanotoxizität reduzieren. Diese Technik ermöglicht es uns, die DNA-Dynamik zu verstehen und zu verstehen, wie sie beeinflusst wird, wenn Zellen oder Gewebe DNA-schädigenden Stoffen ausgesetzt sind, entweder exogen oder endogen, und wir können die DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Chromatindynamik untersuchen Die Untersuchung der DNA-Replikationsdynamik und des Reparaturmechanismus wird bei der Entwicklung von Strategien helfen, die die Wirksamkeit von therapeutischem Material verbessern oder den Off-Target-Effekt der Nanomedizin verringern.
Was wir wirklich wollen, dass die Leute über diese Technik wissen, sind die verschiedenen Dinge, die wir oder eine Person tun können. Zum einen muss man verstehen, wie sich neuartige Chemotherapeutika auf die Gesundheit einer Zelle auswirken können, um zu sehen, ob man sie schneller oder effizienter abtöten kann. Das nächste, was Sie tun müssen, ist, darüber nachzudenken, wenn Sie einen Wirkstoff hinzufügen, sagen wir, es ist ein neues therapeutisches oder pharmazeutisches Mittel, Sie möchten wissen, ob es einer Person schaden wird, bevor Sie es ihm geben.
Sie können den Wirkstoff also einfach Zellen oder Modellsystemen geben und sehen, ob er den Zellen oder dem Modellsystem schadet, und wenn ja, wie sehr? Als nächstes müssen wir uns ansehen, dass wir all diese neuen Nanomedikamente entwickeln und sicherstellen wollen, dass diese Nanomedikamente einer Person oder dem Ort, an dem wir das Nanomedikament injizieren, nicht schaden. Das letzte ist, dass man manchmal wissen möchte, wie sich ein Protein auf die DNA-Replikation, die DNA-Reparatur oder die Chromatindynamik auswirkt, und wir können diese Technik verwenden, um das zu tun.
Shirali Patel, eine Forschungsstudentin im Master in medizinischer Biotechnologie in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Faserassays, indem Sie das Medium von 75 % bis 80 % konfluierenden RAW 264,5 Makrophagenzellen entfernen und in zwei Hälften teilen. Reservieren Sie eine Hälfte für den Chlor-Ioddesoxyuridin-Puls oder die Chlor-Ioddesoxyuridin-Reserve und fügen Sie der anderen Hälfte fünf Mikroliter Ioddesoxyuridin hinzu, was 50 Mikromol als Endkonzentration ergibt.
Nach dem Mischen wird das Ioddesoxyuridin-haltige Medium wieder auf die Platten gegeben und die Zellen für 20 Minuten in den Inkubator gelegt. Wärmen Sie das Chlor-Ioddesoxyuridin-Reservemedium auf 37 Grad Celsius vor und fügen Sie diesem Medium vor dem Chlor-Ioddesoxyuridin-Impuls Chlor-Ioddesoxyuridin hinzu. Nach 20 Minuten wird das Iododesoxyuridin-Mediumgemisch aus dem RAW 264.5 Makrophagenzellkolben abgesaugt.
Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 500 Mikrolitern PBS mit einem pH-Wert von 7,4 und drehen Sie die Platte, bevor Sie das PBS entsorgen. Behandeln Sie die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Graphenoxid-Nanopartikeln in 500 Mikrolitern des Mediums und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Nach der Inkubation wird die Mischung aus Behandlungsmedium angesaugt und die Zellen vorsichtig mit 500 Mikrolitern PBS gewaschen, indem die Platte vorsichtig gedreht wird, bevor das PBS verworfen wird.
Als nächstes fügen Sie dem Chlor-Ioddesoxyuridin-Reservemedium fünf Mikroliter Chlor-Ioddesoxyuridin-Reservemedium hinzu und bedecken die Zellen mit dem Chlor-Ioddesoxyuridin-Reservemedium. Für den Chlor-Joddesoxyuridin-Impuls werden die Zellen für 20 Minuten in den Inkubator gelegt. Kratzen Sie die Zellen nach einer PBS-Wäsche drei bis vier Minuten lang ab, geben Sie dann fünf Milliliter Medium auf die Platte und sammeln Sie die Zellen.
Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen vier Minuten lang bei 264 G. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen wieder in einem Milliliter eiskaltem PBS. Um die DNA-Fasern herzustellen, beschriften Sie die Objektträger mit einem Bleistift mit dem Versuchszustand und dem Datum.
Aspirieren Sie zwei Mikroliter Zellen in einer Pipette und halten Sie die Pipette in einem Winkel von etwa 45 Grad. Platzieren Sie dann die Pipette etwa einen Zentimeter unter dem Objektträgeretikett und bewegen Sie die Pipette mit einer langsamen Freisetzung der Zelllösung horizontal in Richtung des Objektträgeretiketts. Sobald die Lösung verdunstet ist und klebrig und klebrig aussieht, überlagern Sie jede Zelllinie mit 15 Mikrolitern Lysepuffer, ohne dass die Pipettenspitze den Objektträger berührt.
Kippen Sie dann den Objektträger in einem Winkel von 25 Grad und lassen Sie die DNA-Aufstriche mindestens vier Stunden lang an der Luft trocknen. Fixieren Sie am ersten Tag die DNA-Fasern, indem Sie die Objektträger zwei Minuten lang in Methanolessigsäure tauchen. Legen Sie die Objektträger am zweiten Tag in einen Objektträgerträger aus Glas und inkubieren Sie sie mindestens 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius.
Um die DNA zu denaturieren, bereiten Sie eine befeuchtete Kammer vor und legen Sie die Objektträger vorsichtig in ein Coplin-Gefäß mit deionisiertem Wasser oder DI-Wasser, wobei darauf zu achten ist, dass die beschichteten Oberflächen die Wände des Gefäßes nicht berühren. Gießen Sie nach 20 Sekunden Inkubationszeit das Wasser aus. Geben Sie 2,5 molare Salzsäure in das Coplin-Glas und decken Sie alle Objektträger ab.
Nach 80 Minuten Inkubationszeit eine Wäsche mit PBS plus 0,1 % Tween geben, gefolgt von zwei Wäschen mit PBS für jeweils drei Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie die Objektträger zur Immunfärbung in die befeuchtete Kammer und blockieren Sie sie mit 5%igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Decken Sie dann die Objektträger mit einer transparenten Plastikfolie ab.
Entfernen Sie nach dem Blockieren das Deckglas und fügen Sie 100 Mikroliter der primären Antikörperlösung entlang der Objektträgerlänge hinzu. Fügen Sie ein neues Plastikdeckglas hinzu und warten Sie zwei Stunden. Klopfen Sie nach zwei Stunden die Antikörperlösung ab und spülen Sie die Objektträger in einem mit PBS gefüllten Coplin-Glas zweimal aus.
Blockieren Sie die Objektträger wieder, indem Sie 200 Mikroliter 5%BSA entlang der Folie hinzufügen. Fügen Sie ein Plastikdeckglas hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang. Nachdem Sie das Deckglas abgenommen und überschüssiges BSA mit einem Papiertuch entfernt haben, fügen Sie 100 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung entlang der Objektträgerlänge hinzu und legen Sie ein neues Kunststoffdeckglas ein.
Entfernen Sie nach einer Stunde das Deckglas, klopfen Sie das überschüssige BSA auf einem Papiertuch ab und waschen Sie die Objektträger zweimal in PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter der tertiären Antikörperlösung entlang der Objektträgerlänge hinzu und platzieren Sie ein neues Kunststoff-Deckglas. Fügen Sie erneut 200 Mikroliter 5% BSA entlang jedes Objektträgers hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang.
Entfernen Sie nach dreimaligem Waschen mit PBS das überschüssige PBS und lassen Sie es vollständig trocknen. Nach dem Trocknen das Eindeckmedium auf den Objektträger geben und Glasabdeckgläser auflegen, damit sich keine Blasen bilden. Visualisieren Sie die immungefärbten DNA-Fasern mit einem Immunfluoreszenzmikroskop, das mit einer Kamera, einem 60x-Objektiv und geeigneten Filtersätzen ausgestattet ist, um Alexa Fluor 488- und 594-Farbstoffe zu erkennen.
Die Variation der Replikationsmuster nach langfristiger Exposition gegenüber den Nanomaterialien wurde durch den Vergleich der Replikationsmuster der Zellen vor und nach der Exposition von Iododesoxyuridin- und Chlor-Ioddesoxyuridin-Nanopartikeln bestimmt. DNA-Faseranalyse- und Interpretationsbilder zeigten ein Muster für Kontrollmakrophagenzellen und mit Graphenoxid-Nanopartikeln behandelte Makrophagen-DNA. Die Variation wurde im Muster der Replikationsintermediate beobachtet, was eine Zunahme neuer Ursprünge in einer anderen Region der gleichen Erkrankung zeigt.
Die aussagekräftigen Faserdaten wurden erhalten, indem die Gesamtfläche des Objektträgers in fünf bis sechs Bereiche unterteilt und mehrere Bilder aus jeder Region aufgenommen wurden. Die Auswahl von etwa 500 Zwischenprodukten aus mehreren Objektträgern oder Bedingungen war ideal, um die Variation der DNA-Replikationsdynamik zu untersuchen. Die Analyse zeigte auch eine Zunahme der rein roten Spuren, was auf Bestimmungen und eine Abnahme der neu gebrannten Ursprünge in den mit Graphenoxid behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle hinweist.
Die Qualität der DNA-Faserausbreitung hängt davon ab, wie gut sich die Fasern voneinander ausbreiten und dass sie sich nicht überlappen. Sobald die Fasern ausgebreitet und IdU und CldU gefärbt sind, ist es äußerst wichtig, die DNA-Fasern zu finden. Eines der Dinge, die Sie tun können, nachdem Sie die DNA-Fasern hergestellt haben, ist, dass Sie untersuchen können, wie sich die Replikationsdynamik auswirkt.
Zweitens können Sie sich ansehen, wo sich DNA-Schäden im Verhältnis zu den DNA-Replikationsspuren befinden. Und zu guter Letzt können Sie, wenn Sie die FISH-Sonden verwenden, tatsächlich bestimmte Regionen untersuchen und wie sie von diesem DNA-Schaden betroffen sind. Diese Technik ebnet den Weg für die Entwicklung von Chemotherapeutika, das Design von Medikamenten und das Verständnis, wie die DNA-Replikation durch verschiedene Arten von Proteinen beeinflusst wird.
