Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Die DNA-Schadensantwort ist ein zelluläres System, das die Stabilität und Integrität des Genoms aufrechterhält. Funktionsstörungen in diesem Prozess verursachen verschiedene Krankheiten wie Krebs, altersbedingte Krankheiten und chronische Entzündungen. Unser Ziel ist es, Proteine zu identifizieren, die in diesem Prozess zusammenarbeiten, was die Identifizierung alternativer Ziele für die therapeutische Integration ermöglicht.

Um die Beteiligung eines Proteins an der DNA-Schadensantwort zu charakterisieren, werden in der Regel Immunfluoreszenzstudien mit der phosphorylierten Form des H2AX-Histons, einem Marker für DNA-Schäden, durchgeführt. Darüber hinaus können Proteinsammelassays wie die Co-Immunpräzipitation nach DNA-Schäden durchgeführt werden, um die Rolle des Proteins bei der Signalübertragung zu identifizieren. Interaktionsstudien basieren in der Regel auf Immunpräzipitationsassays, diese sind jedoch in vitro und geben keine Auskunft über den Ort der Interaktion.

Immunfluoreszenz kann Aufschluss über die Zelllokalisierung der Proteine geben, aber der Nachweis der Wechselwirkung kann schwierig sein und hängt von der Auflösung des Mikroskops ab. Wir zeigen hier, dass ein einfaches Protokoll, das Proximity-Liganden-Assay mit Gamma-H2AX-Färbung kombiniert, die räumliche und zeitliche Charakterisierung der Interaktion von Proteinen im Zusammenhang mit DNA-Schäden ermöglicht. Darüber hinaus haben wir ein benutzerfreundliches Makro für die Datenanalyse bereitgestellt.