Diese Arbeit wurde von der BBSRC und dem Wellcome Trust finanziert. Wir möchten Simon Walker für die Unterstützung danken, mit bildgebenden und Felix Krueger für die Hilfe bei bioinformatische Analyse.

1. Generieren Direkt markierter DNA-Sonden durch Nick Translation Hinweis: Direkt markierten Sonden von BACs gemacht (100-250 kb) konsequent zu produzieren helle Signale. Wenn kleinere Sonden erforderlich sind, verwenden Fosmide (40-50 kb) oder auch Plasmide, die 5-10 kb Einsätze. Identifizieren BAC-Klone oder Fosmid entsprechend spezifischer Gene mit Ensemble oder UCSC Genom Browsern. Bereiten Sie hochwertige BAC DNA durch wiederholte Fällung oder verwenden Sie handelsübliche Kits. Je weniger die Zubereitung mit bakterieller genomischer DNA verunreinigt ist, wird die Sonde weniger pro Folie erforderlich. Führen Sie die Kennzeichnung in zwei Schritten: Nicktranslation Einführung aminoallyl-dUTP und chemische Kopplung eines aminreaktiven Farbstoff. 1.1. Nick Translation Während Nick-Translation wird DNase I verwendet werden, um Single-Strang-Brüche zu erstellen. DNA Polymerase I verlängert die 3&#39;-Enden dieser &quot;nicks&quot; Ersatz bestehender Nukleotide durch neue, t<html> hiermit &#39;übersetzen&#39; die nick und somit die Möglichkeit bietet, markierte Nukleotide zu integrieren. Aminoallyl-dUTP wird wegen der effizienten Einbau von DNA Polymerase I gewählt und ihr Potenzial für die spätere chemische Kopplung zu Amin-reaktive Farbstoffe oder Haptene. Es ist wichtig, die richtige Balance zwischen DNase I nicking und DNA-Polymerase I Übersetzung zu erreichen, zu viel DNase I wird in übermäßiger DNA Verdauung geben geringe Ausbeute und kurzes Fragment Größen resultieren, zu wenig produziert nicht genug Kerben für die Polymerase Übersetzung initiieren, geben große Fragment Größe und schlechte Einarbeitung aminoallyl-dUTP. Das folgende Protokoll funktioniert gut, aber es kann notwendig sein, die DNAse I aus unterschiedlichen Chargen oder verschiedener Hersteller zu titrieren. <ol><li> Einrichten Kennzeichnung Reaktion auf Eis und Inkubation für 2 Stunden bei 16 ° C. Dabei sollte 0,5-1 ug nick-translatierten DNA und kann skaliert werden. Verdünnen DNase I 1:30 DNase I-Puffer (dh 0,3 U / ul). </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Bauteile </td><td> Konzentration auf Lager </td><td> Volumen oder Menge </td></tr><tr><td> BAC DNA </td><td></td><td> 5-10 ug </td></tr><tr><td> NTB-Puffer </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0,1 M </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> dNTP-Mix </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0,5 mM </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> DNA Polymerase I </td><td> 10 U / ul </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 10 U / ul </td><td> 1 ul (von 01.30 Verdünnung) </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td></td><td> bis 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Lauf 1 ul auf einem 2% Agarosegel, um die Größe der markierten Fragmente zu überprüfen. Während Sie das Gel laufen, halten Sie die Reaktion auf Eis. Erfolgreiche nick translation wird in einem Abstrich mit dem Großteil der Fragmente, die zwischen 150 bp und 700 bp mit einigen größeren Fragmente bei ~ 1 kb (: siehe Repräsentative Ergebnisse kritischer Schritt) führen. Falls erforderlich, fügen Sie eine weitere 1 ul einer frisch 01.30 DNase I Verdünnung und Inkubation bei 16 ° C für 15-30 min. Inkubationszeit wird nach der Menge und Qualität der BAC DNA variieren. </li><li> Inaktivieren DNase I durch Erhitzen auf 75 ° C für 10 min. </li><li> Clean-up aminmodifizierten DNA unter Verwendung eines PCR-Purification-Kit. Eluiere in 100 ul H 2 O. </li><li> Ethanol Niederschlag DNA durch Zugabe von 10 ul 3 M NaOAc (pH 5,2) und 275 ul Ethanol. Lassen Sie bei -20 ° C für mindestens 1 Stunde oder über Nacht. Spin bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Minuten bei 4 ° C. Waschen Pellet mit 500 ul 70% Ethanol und an der Luft trocknen. Dieser Schritt entfernt Trace Amine, die mit der Etikettierung Reaktion stören. Pellet in 6 ul H 2 O pro 1x erste Reaktion. </li><li> Verwenden 1 ul, um die Konzentration der Amin-modifizierte DNA bestimmen,von Mikrovolumen UV-Spektroskopie. </li></ol> 1.2. Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes Fluoreszierende Markierung der Sonde wird durch chemisches Kuppeln des Farbstoffes erreicht. Alexa Fluor Succinimidylester Farbstoffe reagieren mit den Aminen der Amino-allyldUTP modifizierten DNA, um eine kovalente Bindung zu bilden, wodurch direkt markierten Sonden. Alexa Fluor 488, 555, 647 und Farbstoffe wurden für diesen Prozess erfolgreich. <ol><li> Adjust 4 ug Amino-Allyl modifizierte DNA auf ein Volumen von 5 ul, Hitze bis 95 ° C für 5 min auf Eis kühl rasten, und fügen Sie 3 ul von 0,2 M NaHCO 3. </li><li> Man löst ein Aliquot von Amin reaktiven Farbstoff in 2 ul wasserfreiem DMSO bei Raumtemperatur. In 8 ul modifizierte DNA mit NaHCO 3, Vortex-, Impuls-Spin und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Stunde. </li></ol> Hinweis: Die Amin-reaktive Farbstoffe können verwendet werden, um mehr als eine Sonde auf folgendem Schema zu markieren. Da only 10-20 ng Sonde pro Folie Kennzeichnung verwendet wird, gibt 1 ug genug Sonde für 50-100 Dias. Es ist auch möglich, Amin-modifizierte DNA für zukünftige Markierungsreaktionen Lagerung bei -20 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> DNA-Menge </td><td> DNA Volumen </td><td> 0,2 M NaHCO 3 </td><td> Volumen der Farbstoff </td><td> Insgesamt </td><td> Genug für </td></tr><tr><td> 4 x 1 ug </td><td> 1,25 ul jeder </td><td> 0,75 ul jeder </td><td> 0,5 ul jeder </td><td> 2,5 ul (1/4) </td><td> 50-100 Folien jeweils </td></tr><tr><td> 3 x 1,35 ug </td><td> 1.67 ul jeder </td><td> 1 ul jeder </td><td> 0,67 ul jeder </td><td> 3,34 ul (1/3) </td><td> 65-130 slide jeder </td></tr><tr><td> 2 x 2 ug </td><td> 2,5 ul jeder </td><td> 1,5 ul jeder </td><td> 1 ul jeder </td><td> 5 ul (1/2) </td><td> 100-200gleitet jedes </td></tr><tr><td> 1 x 4 ug </td><td> 5 ul </td><td> 3 ul </td><td> 2 ul </td><td> 10 ul (voll) </td><td> 200-400 Dias </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> In 90 ul H 2 O und reinigen markierten Sonde mit Hilfe eines PCR-Purification-Kit. Eluiere in 100 ul 10 mM Tris-Cl (pH 8,5). </li><li> Bestimmen Sonde Konzentration und Kennzeichnung Effizienz durch Mikrovolumen volle Spektrum-Spektroskopie (siehe Abbildung 2) mit Lambert-Beer-Gleichungen (Anleitung sind im Datenblatt angegeben begleiten die Alexa Fluor reaktive Farbstoffe oder können Online gefunden werden). Sonden, die 3-6 Farbstoffe pro 100 bp gut funktionieren. Probes mit niedrigeren Grad der Einarbeitung geben kann schwach FISH-Signale. Alternativ können Sie 5 ul auf einem 2% Agarosegel ohne DNA-Färbung und überprüfen Sie die Einbindung der Fluoreszenzfarbstoff mit einem Phosphoimager. Sende-Fleck das Gel mit Ethidiumbromid oder DNA-Färbung Alternativen und vergleichen markierte DNA zu Gesamt-DNA. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. DNA FISH Via den folgenden Schritten werden die Zellen von Interesse Objektträgern fixiert und permeabilisiert. Cellular DNA und direkt markierten Sonden werden dann auf einer heißen Platte denaturiert und über Nacht in einem lichtdichten feuchten Kammer hybridisiert. 2.1. Tag 1 <ol><li> Probe Niederschlag Hinweis: Precipitate Sonden irgendwann während Tag 1. Dies kann bequem in parallel zu der Behandlung der Zellen durchgeführt werden und muss nicht zu Beginn des Tages erfolgen. <ol><li> Mix 10-20 ng direkt markierten Sonde, 6 ul C 0 t-1 DNA (6 ug), 1 ul einzigen DNA aus Lachshoden (9,7 ug) und die Lautstärke auf 100 ul mit Wasser. </li><li> In 10 ul 3 M NaOAc und 275 ul EtOH und vortexen. Man fällt für mindestens 1 h bei -20 ° C. </li><li> Spin in Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Minuten bei 4 ° C. Waschen Pellet mit 70% EtOH und Spin wieder. Dry Pelletund in 5 ul deionisiertem Formamid resuspendieren. Resuspendieren für 30 min bei 37 ° C unter Schütteln bei 1000 min vor Licht geschützt (Ort Folie über dem Thermomixer). </li><li> In 5 ul Dextransulfat mixen und shaken und für weitere 10 min bei 37 ° C wieder vor Licht geschützt. Pipette nach oben und unten nur vor dem Pipettieren auf Deckglas. Hinweis: Für Chromosom Malerei mit BAC-Sonden ganzes Chromosom Malerei Sonden, die in ready-to-use Hybridisierungsmix geliefert werden, sind eine bequeme Möglichkeit kombiniert. Resuspendieren gefällt BAC-Sonde (mit C 0 t1 DNA und einzelsträngige DNA aus Lachs Hoden) in 10 ul Chromosom paint mix durch Auf-und Abpipettieren. Bei 37 ° C unter Schütteln bei 300-500 rpm für 10 min. Verwenden Sie 10 ul Chromosom Lack / BAC Sonden-Mix pro Spot. </li></ol></li><li> Anbringen Cells Slides Hinweis: Die Zellen Neigung zu den Folien haften stark mit Zelltyp. Für jeden Zelltyp bestimmen dieoptimale Setzzeit und die Zelldichte empirisch. Um gleichbleibende Ergebnisse sollten die Zellen in einem Zell-Suspension ist. Zur Erhöhung der Benutzerfreundlichkeit Kreis der Bereich die Zellen auf mit einem hydrophoben Stift entdeckt werden, obwohl für die Zellen in PBS resuspendiert dies nicht unbedingt erforderlich ist. Eine hydrophobe Barriere verhindert, dass die Suspension Ausbreitung auf der Folie hält bis zu drei Proben pro Folie gut getrennt und ermöglicht die Verwendung von sehr kleinen Mengen an Antikörper-Lösung in Immuno-FISH. Auch kann die Spotting-Bereich auf ein Minimum reduziert werden, wenn Zellzahlen niedrig sind. </li><li> Maus fötalen Leberzellen <ol><li> Sammle jede E13.5 Maus fötalen Leber in ca. 1,5 ml PBS resuspendieren und durch Auf-und Abpipettieren. Spin in Mikrofuge bei 3.000 rpm für 2 min. Wiederholen Sie wäscht dreimal. Bei der letzten Wäsche, Stamm Zellen durch eine 70 um-Sieb. Die Zellen von einer Leber in 160 ul PBS und verwenden 50 μ pro Spot. Lassen Zellen für 2 min bei Raumtemperatur zu regeln. </li></ol></li><li> Mouse ES-Zellen 1. Maus-ES-Zellen nicht leicht kleben an der Folie. Auf einer Rutsche, Kreis der Bereich die Zellen auf mit einem hydrophoben Stift entdeckt werden. Eine Suspension von 20.000-50.000 Zellen pro 80-100 ul in normalen Kulturmedium Pipette in Kreis und lassen Sie für ca. 3 Stunden in einem befeuchteten Inkubator Hinweis anzubringen:. Alternativ können ES-Zellen auf Objektträgern kultiviert werden, sondern bilden dann Kolonien, die Automated Imaging behindern könnte. </li><li> Fixierten Zellen 1. Einige Experimente erfordern die Verwendung von fixierten Zellen, die nicht mit Folien nicht anhängen, indem sich. Leichte Spinnen bei 300 rpm für 3 Minuten unter Verwendung eines Zytozentrifuge bewahrt die dreidimensionale Struktur der Zellen und sorgt dafür, dass Zellen nicht abfallen. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Zelltyp </td><td> Suspension in </td><td> Einschwingzeit </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> MausFötusleber </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Auf der Bank </td></tr><tr><td> Maus ES </td><td> DMEM mit Ergänzungen </td><td> 4 Stunden </td><td> 37 ° C in befeuchteten Inkubator </td></tr><tr><td> Maus-Lymphozyten </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Auf der Bank </td></tr><tr><td> Maus P20 Keimzellen </td><td> Fix in Lösung </td><td> Cytospin </td><td> Auf der Bank </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Für 10 min: Um Zellen, sanft tauchen slide in 4% PFA (führen in Abzug VORSICHT) zu beheben. Fix-Zellen mit dem Schlitten Wohnung in einem Fach für die besten Retention von Zellen (z. B. 50 ml 4% PFA in den Deckel einer Tip-Box). Hinweis: Dieser Schritt gilt nicht für Zellen vor der Befestigung an Objektträgern fixiert gelten. </li></ol> Für alle weiteren Schritte, verwenden 50 ml oder 100 ml Coplin Gläser. Achten Sie darauf, nicht auf Zellen abschaben beim Verschieben gleitet zwischen Gläsern. <ol start="4"><li> Quench in 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 für 10 min bei RT. </li><li> Durchdringbar Zellen in 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 in PBS für 10 min bei RT. </li><li> Zweimal waschen mit PBS für 5 min bei RT. </li><li> Inkubieren für mindestens 20 min in 20% Glycerin / PBS bei RT. Hinweis: An dieser Stelle können Folien in 50% Glycerin / PBS bei -20 ° C für mindestens mehrere Wochen gelagert. Es hat sich gezeigt, daß Speicher für mindestens einen Tag führt zu einem Anstieg in der Signalstärke 9 beobachtet. Kalibrieren in Raumtemperatur 20% Glycerin / PBS, bevor Sie fortfahren. Hinweis: Dies ist eine bequeme Punkt zu beginnen Ausfällen der Sonden (siehe 2.1.1). </li><li> 3x Einfrieren / Auftauen in flüssigem Stickstoff. Tauchen Sie ein Dia zu einem Zeitpunkt, in flüssigem Stickstoff mit einem kleinen Dewar. Ziehen Sie nach einigen Sekunden und einem charakteristischen Knall, und auf Küchenpapier auftauen. Warten Sie, bis opak gefrorenen Glycerin zu verschwinden dann wieder einfrieren. Bis zu 15 Dias bequem in Drehung erfolgen für drei Einfrieren / Auftauen. </li><li> WAsche zweimal in PBS für 5 min bei RT. </li><li> Inkubieren in 0,1 M HCl für 30 min bei RT. </li><li> Waschen in PBS für 5 min bei RT. </li><li> Permeabilisierung in 0,5% saponin/0.5% Triton X-100/PBS 30 min bei RT. </li><li> Zweimal waschen mit PBS für 5 min bei RT. </li><li> Equilibrieren in 50% formamide/2x SSC für mindestens 10 min bei RT. </li><li> Pipette Sonde auf einem Deckglas. Objektträger aus dem Glas und trocknen Sie das überschüssige Flüssigkeit um die Zelle vor Ort (e) mit einem Papiertuch. Da die Formamid trocknet schnell, darauf achten, nicht austrocknen Zellen. Für Objektträger mit zwei oder drei Zellen Flecken, gelten 10 ul Sonde pro Spot auf eine 22 mm x 50 mm Deckglas entsprechende Position auf der Folie zu erkennen. Umkehren Deckglas auf Schlitten über spot (s). Seal mit Gummi-Zement und zulassen, dass dies vollständig trocknen. Ohne Licht bei allen nachfolgenden Phasen. </li><li> Hitze Folien auf 78 ° C für genau 2 min auf eine Heizplatte (zB eine umgekehrte Heizblock kritischer Schritt: siehe Diskussion). Legen Sie einen Deckel (Karton oder sim<html> Ilar) über der heißen Platte vor Licht während Denaturierung zu schützen. </li><li> Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einer lichtdichten feuchten Kammer. Um befeuchten, legen Papierhandtücher in einem lichtdichten Box und mit Wasser angefeuchtet. </li></ol> 2.2 Tag 2 <ol><li> Bereiten Coplin Gläser mit Lösungen auf die richtige Temperatur für die nachfolgende Waschschritte. Schützen Sie Folien aus Licht so viel wie möglich bei allen nachfolgenden Schritte. Ein Kaffee kann macht einen guten lichtdichten Abdeckung für Coplin Gläser. </li><li> Peel off Gummizement und Ort Folie in 2x SSC bis Deckgläser lösen und abrutschen. </li><li> Waschen in 50% formamide/2x SSC für 15 min bei 45 ° C Deckel auf Wasserbad den Inhalt vor Licht zu schützen. </li><li> Waschen in 0,2 x SSC für 15 min bei 63 ° C </li><li> Waschen in 2 × SSC für 5 Minuten bei 45 ° C. </li><li> Waschen in 2 × SSC für 5 Minuten bei RT. </li><li> Waschen in PBS für 5 min bei RT. </li><li> Fleck mit DAPI (5 ug / ml in 2x SSC) für 2 min in einem entsprechenden Gefäß bei RT. </li></ol>Inhalt &quot;&gt; Hinweis: DAPI-Lösung kann bei 4 ° C im Dunkeln für 2 Monate. <ol start="9"><li> Entfärben in PBS für 5 min bei RT. </li><li> Um das Deckglas montieren, Montage Pipette Medium auf einem Deckglas. Verwenden Sie 10 ul pro Zelle vor Ort, mit 22 mm x 22 mm Deckgläser für einen Punkt, und 22 mm x 50 mm Deckgläser für zwei bis drei Flecken. Abtrocknen PBS um die Zelle vor Ort so viel wie möglich, aber darauf achten, nicht zu trocknen die Zellen. Umkehren Deckglas auf Rutsche und Dichtung mit Nagellack. </li></ol>

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Die Produktion dieser Artikel wurde teilweise durch Carl Zeiss und MetaSystems gesponsert.

3D FISH DNA hat sich zu einem weithin anerkannten Instrument zur räumlichen Anordnungen in den Zellkern zu analysieren. Während FISH bietet visuelle und direkte Ergebnisse, wie bei jeder Technik muss man sich bewusst sein, seine Grenzen. DNA FISH steht das inhärente Problem, dass relativ raue Behandlungen notwendig sind, um Chromatin zugänglich für FISH-Sonden, die letztlich stört Kernstruktur-genau das, was analysiert werden soll. Mehrere Strategien wurden verfolgt, um die Zugänglichkeit und Struktur Erhaltung jonglieren. In dem hier beschriebenen Protokoll wird chromosomale DNA zugänglich gemacht Frost-Tau-Permeabilisierung von Zellen und Hitzedenaturierung vor Sondenhybridisierung. Solovei, et al., (2002) analysiert Strukturveränderungen nach ähnlichen Behandlung und festgestellt, dass die durchschnittliche Verschiebung Chromatindomänen 300 nm, die die Auflösung der strukturellen Analyse beschränkt auf rund 1 Mb Regionen im Genom 8 war. Dies ist zwar nicht hohe Auflösung, esist ein angemessener Maßstab für die Analyse von nuklearen Position. Eine praktische Überlegung für FISH-Analyse ist, dass die Bildaufnahme und Messungen Kernabstände sind zeitaufwendig Prozesse, die die Anzahl der Kerne, die analysiert werden können, zu begrenzen. Um zu untersuchen, seltene Ereignisse es unser Ziel, einen hohen Durchsatz Automated Imaging tun. Dann mit geeigneten Kontrollen, eine ausreichende Zahl im Vergleich zu für robuste statistische Analyse der räumlichen Beziehungen zu ermöglichen. Wir analysieren routinemäßig 600 Kerne pro Datenpunkt für das bestimmen wir die 3D-Koordinaten aller FISH-Signale innerhalb des nuklearen Volumen. Diese Daten benötigen sehr wenig Speicherplatz und erlauben für die Analyse von inter-und intra-Allel Entfernungen oder radialen Positionen zu einem späteren Zeitpunkt. Darüber hinaus kann die automatisierte Verarbeitung in einem Forscher blinden Weise das reduziert die Wahrscheinlichkeit von unbewussten Bias durchgeführt werden. Um diese Art von hohen Durchsatz ermöglichen analysist, war es unser Ziel, eine schnelle und effiziente Art und Weise der Durchführung DNA FISH etablieren. Wir fanden das hier beschriebene Protokoll als äußerst robust, konsequent Herstellung helle Signale mit niedrigem Hintergrund. Er arbeitete für alle Zelltypen versuchten wir vorausgesetzt, wir angepasst den Schritt der Befestigung der Zellen auf den Objektträger. Darüber hinaus mit einer Ausnahme konnten alle BACs verwendeten wir in hellen Sonden gedreht werden. Wir haben auch erfolgreich eine Reihe von nuklearen Proteinen durch Antikörper-Färbung nach der DNA-FISH nachgewiesen. Während für einige Proteine ​​dies gut funktioniert, empfehlen wir gegenüber herkömmlichen Immunfluoreszenz (IF), um die Konsistenz der Antikörper-Färbung Muster zwischen IF und FISH DNA Immuno (vgl. 11) zu gewährleisten. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass Proben in verschiedenen Farben markiert die gleichen Ergebnisse erzielt. Allerdings sollten die folgenden Aspekte berücksichtigt werden, wenn die Wahl der Kennzeichnung Farbstoff werden. Zuerst muss die Farbe des Fluorophors zu gut nachweisbar durch das Mikroskop used. Zweitens sollte die Wellenlänge des Lichts durch die Fluorophore emittiert wird ausreichend verschieden, die das Durchscheinen in dem anderen Kanal zu vermeiden. Dies wird auf den Filtern in dem Mikroskop ab. Und drittens, zumindest in unseren Händen, produzieren einige Farben hell Signale konsequenter als andere. Wir haben immer DAPI (blau) als Gegenfärbung die Alexa Fluor 555 (rot), 488 (grün) macht verwendet, und 647 (ganz rot) eine gute Wahl für die Markierung von Sonden. Mit unseren Imaging-System, fanden wir Alexa Fluor 555 (rot) an die hellsten Signale von Alexa Fluor 488 (grün), gefolgt produzieren. Alexa Fluor 647 (bis rot) hat den Nachteil, dass sie nicht vom menschlichen Auge erkannt werden und somit keine Signale zu erkennen, wenn man sich das Mikroskop werden. Wenn also tun zweifarbige FISH, empfehlen wir die Kombination von roten und grünen Farbstoffe. Zwei wesentliche Probleme auftreten: Zellen Abwaschen der Dias und schwache Signale. Wie gut Zellen auf den Objektträger haften ist enorm variable zw.een Zelltypen, und das beste Protokoll / Saatgut die Zellen bestimmt werden muss begleichen. Wir haben erfolgreich entweder positiv geladene oder Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (gekauft gebrauchsfertig), fand aber in der Regel eingehalten Zellen besser auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger. Wir haben auch festgestellt, dass, wenn die Zellen zu dicht ganze Landstriche würden abziehen wie ein Blatt, während Automated Imaging wurde behindert waren, wenn die Zellen zu spärlich waren. Somit, wenn die Probe nicht zu wertvoll, sollten unterschiedliche Zellzahlen geimpft, um die ideale Dichte zu bestimmen. Wenn Zellen besonders anfällig zu waschen sind, kann eine hydrophobe Barriere Stift verwendet werden, und FISH Schritte können durch vorsichtiges Pipettieren Lösungen direkt auf den Objektträger durchgeführt werden. Pipettieren auch drastisch reduziert das Volumen der benötigten Reagenzien, aber erheblich länger dauert, wenn dabei mehrere Folien. Schwache Signale sind in der Regel aufgrund der schlechten Sonden und es lohnt sich zu investieren Zeit in die Herstellung guten. Saubere BAC DNA sollte verwendend als Ausgangsmaterial, das durch wiederholte Fällung oder kommerziell erhältlichen Kits erhalten werden kann. Kontamination mit bakteriellen genomischen DNA Sonde wirkt sich negativ auf Qualität und sorgfältige Behandlung während der Zell-Lyse und Filterung des Zelllysat wird benötigt, um es auf ein Minimum zu halten. Es ist jedoch nicht notwendig, eine Exonuklease-Schritt verwendet, um lineare DNA zu verdauen, da diese stark reduziert Ausbeute. Effiziente Markierung der Sonde ist von entscheidender Bedeutung. Die wichtigste Qualitätskontrolle für diesen Schritt ist die Überprüfung der Fragmentgröße nach Nick-Translation (siehe Repräsentative Ergebnisse). Eine &quot;gute&quot; Abstrich wird fast immer in einem bunten Sonde führen. Allerdings haben wir festgestellt, dass gelegentlich eine gewisse BAC kann nicht in eine gute Sonde verarbeitet werden, und eine andere BAC muss gewählt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist Hitzedenaturierung. Wenn die Temperatur zu niedrig ist, wird die DNA nur teilweise denaturiert und Sondenhybridisierung beeinträchtigt wird. Wenn die Temperatur zu hoch ist, Kernstruktur will gestört werden mehr als nötig. In unseren Händen ist 78 ° C auf einem inversen heißen Block der idealen Kompromiss, sondern je nach der jeweiligen heißen Block verwendet. Wir haben gute Ergebnisse mit Vectashield Eindeckmediums, fand aber, dass weniger SlowFade Gold-Hintergrund hat und bewahrt das Fluoreszenz-Signal für länger. Wir empfehlen nicht den Einsatz von Hard-Set Eindeckmediums wie wir diese 3D-Struktur zu beeinflussen und um Luftblasen im Laufe der Zeit bilden gefunden. Schließlich bieten hell fluoreszierenden direkt markierten Sonden zusammen mit der DNA-FISH hier beschriebene Verfahrensweise eine effiziente Lösung für stabile und schnelle Analyse von nuklearen Architektur, die für eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen ist.

DNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH DNA) erlaubt die dreidimensionale Visualisierung der einzelnen Genorte, subchromosomalen Domains und sogar ganze Chromosomen während allen Phasen des Zellzyklus. 2D-FISH ist für Metaphase Studien verwendet werden, während 3D FISH wurde ausgiebig genutzt worden, um die Beziehung zwischen der räumlichen Organisation des Genoms und seine Funktion während der Interphase (1,2 und Referenzen darin) zu untersuchen. Historisch wurden co-Assoziation Studien untersucht zehn bis Hunderte von einzelnen Stellen durch FISH durchgeführt. In jüngerer Zeit mächtig hohen Durchsatz 3C-basierte Techniken wie 4C und Hallo-C wurden 3 entwickelt, das die Untersuchung von molekularen Übersprechen zwischen vielen tausend verschiedenen loci. Während 3C-basierte Techniken und DNA FISH komplementäre Methoden sein kann, aber nicht zwangsläufig die gleichen Fragen beantworten. 3C basierte Methoden ein Ensemble Auslesen von gemischten Zellpopulationen, was eine Wahrscheinlichkeittung für Co-Verbände. Im Gegensatz dazu, während niedrige Durchsatz bieten FISH Techniken die Möglichkeit, räumliche Anordnungen von Loci oder Chromosomen in einzelnen Zellen entsprechend ihrer Entwicklungs-oder Zellzyklus-Stadien zu analysieren. Daher wird FISH weiterhin ein wichtiges Instrument für die Sondierung nuklearen Struktur-Funktions-Beziehungen. Es gibt zwei wichtige Überlegungen bei der Durchführung von erfolgreichen 3D-FISH Experimente. Diese sind: 1. Erhalten optimal markierten Sonden und 2. Wahl der zellulären Behandlungen, einschließlich Fixierung, Pre-und Post-Hybridisierung Schritte, um Kernmorphologie so viel wie möglich zu erhalten und gleichzeitig ausreichend DNA zugänglich für Sondenhybridisierung. Effiziente Sondenmarkierung ist von entscheidender Bedeutung für die Fische. Traditionell wurde Nick-Translation verwendet worden, um entweder Hapten oder fluorophorkonjugierten Nukleotide 4 einzuführen. Ebenso sind kommerzielle Nick-Translation-Kits für den direkten Einbau Hapten oder Fluorophor, bu verfügbart auch für zwei-Schritt-Kennzeichnung mit aminoallyl Nukleotide und aminreaktiven Farbstoffe. Letzteres macht Farbstoff Einbau effizienter, indem DNA-Polymerase eine weniger sperrige Molekül, mit zu arbeiten. In jüngerer Zeit sind Kits zur nicht-enzymatischen Markierung von DNA entwickelt worden, die zu nutzen koordinative Bindung von Platin zu Nukleinsäuren. FISH-Sonden können sogar bereits gekauft beschriftet 5 werden. Während Kits und kommerziell hergestellten Sonden keinen Zweifel geben, Benutzerfreundlichkeit, sind sie deutlich teurer als der Kauf der einzelnen Komponenten und Herstellung von Sonden in-house. Wir optimierten eine kostengünstige Nicktranslation Protokoll, um direkt beschriften vielen verschiedenen BAC Sonden in mehreren Farben. Wir entdeckten, dass Gewinnung von hochreinem BAC DNA ist kritisch und führt zu einer Anforderung für nur 10-20 ng Sonde pro FISH Folie im Vergleich zu 10 - 20-fach stärker als unrein template DNA verwendet wird, was erhebliche Kosten-und Zeit- Einsparungen. Die Verwendung von Amino-allyldUTP ermöglicht flexible KennzeichnungSonden mit den verfügbaren aminreaktiven Farbstoffe (zB Alexa Fluor oder Cy-Farbstoffe) oder Haptene (zB Biotin, Digoxigenin). Hapten-markierten Sonden werden von Fluorophor-konjugierte Antikörper oder Streptavidin zu verstärken und zu visualisieren das Signal. Helle direkt markierten Sonden zeigen in der Regel weniger Hintergrundfärbung und vermeiden Sie über-Verstärkung von Signalen, also was eine genauere Darstellung der nuklearen Lokalisation und Morphologie Locus. Es gibt verschiedene Techniken, die FISH verschiedene Fixative, Vorbehandlungen und Posthybridisierung Wäschen verwenden, aber diese in der Regel in die folgenden Kategorien fallen: Glutaraldehyd Fixierung mit NaOH Denaturierung, Formaldehyd Fixierung mit HCl Denaturierung und Fixierung mit Formaldehyd Hitzedenaturierung 6-9 . Jeder von ihnen hat Vorteile und Nachteile. Glutaraldehyd Fixierung führt zu einer guten nuklearen strukturelle Konservierung, sondern erfordert die Behandlung mit Reduktionsmitteln zu minimierendie resultierende Autofluoreszenz und NaOH Behandlung muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine ausreichende DNA Denaturierung und mögliche Schäden an der Kernstruktur 6 auszugleichen. Formaldehydfixierung weniger stark ist, so dass eine erhöhte Wahrscheinlichkeit von Störungen der nuklearen Architektur, sondern auch in der Regel geben stärker und zuverlässiger Signale und niedrigere Autofluoreszenz 9. HCl-Behandlung depurinates DNA und Proteine ​​aus Streifen mit einer guten Anbindung an die DNA für die Sonden, kann aber auch zu DNA-Brüchen. Heizung physisch trennt die beiden DNA-Stränge zu einer guten Zielhybridisierung und starke Signale, kann aber einige Störung der Kernstruktur 8 führen. Das Ausmaß, in dem jede dieser Techniken betrifft Proteinepitope variiert stark 6,9, was in der Forderung, experimentell für jedes Protein die optimale Protokoll in Immuno-FISH Experimente verwenden, fest. Zwar gibt es keine &quot;perfekte&quot; DNA FISH technique, können sie nützlich sein, wenn alle gut beherrscht. Unser Ziel war es, ein Protokoll für robuste und reproduzierbare DNA FISH Optimierung der räumlichen Position der einzelnen Loci in einer Vielzahl von Zelltypen 10 zu untersuchen, die sich auf die Verfahren zur Erwärmung zuverlässigsten Signale. Damit und mit der Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystem Unser Ziel war die Erhöhung der Durchsatz für einzelne Zelle Analyse der atomaren Anordnungen.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NTB buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>D-1532</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs</td>
 <td>Bioline</td>
 <td>BIO-39025</td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aminoallyl-dUTP</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM8439</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA Polymerase I</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M02095</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase I recombinant RNase free</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4716728001</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR purification kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104</td>
 <td>Step 1.1.4, 1.2.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOAc</td>
 <td>VWR</td>
 <td>27653</td>
 <td>Step 1.1.5, Step 2.1.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S5761</td>
 <td>Step 1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications</td>
 <td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
 <td>A32750, A32756, A32757</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO (anhydrous) </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>276855</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
 <td>Life Technologies </td>
 <td>S33102</td>
 <td>Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cot-1 DNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18440-016</td>
 <td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single stranded DNA from salmon testes </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>D7656 </td>
 <td>Step 2.1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized formamide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-9037</td>
 <td>Step 2.1.1.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate</td>
 <td>Sigma Life Sciences</td>
 <td>D8906 </td>
 <td>Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XMP painting probes</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td>000000-0528-837</td>
 <td>Step 2.1.1.4 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine coated slides</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P0425</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrophobic pen (ImmEdge)</td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>H-4000</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m sieve (Mouse fetal liver cells only)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352350</td>
 <td>Step 2.1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P6148 </td>
 <td>Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Cl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saponin from Quillaja bark</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T9284 </td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Life Technologies (GIBCO)</td>
 <td>70011-036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>G/0650 </td>
 <td>Step 2.1.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20252</td>
 <td>Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47670</td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SSC</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 22</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022022A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 50</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022050A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rubber cement</td>
 <td>Marabu</td>
 <td>2901 (10 000)</td>
 <td>Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen Molecular Probes</td>
 <td>D3571</td>
 <td>Step 2.2.8 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlowFade Gold</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S36936</td>
 <td>Step 2.2.10 (mounting medium)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear nail polish</td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.2.10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nanodrop 2000</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td>
 <td>GE Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coplin jars</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td>
 <td>Step 2.1.3 onwards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen dewar </td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Base with Black Lid (light-tight chamber)</td>
 <td>Simport</td>
 <td>M920-2</td>
 <td>Step 2.1.17</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer comfort</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5355 000.011</td>
 <td>Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 &deg;C room)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Imaging and Image processing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metafer - Imaging Automation Platform</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axio Imager Z2 upright</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>epifluorescence microscope used with automated imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IX81 confocal microscope (FV1000)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>confocal microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bitplane, version 7.3</td>
 <td>Imaris</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and 3D modeling software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scientific volume Imaging, version 4.1</td>
 <td>Huygens</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and deconvolution software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 FISH buffers and reaction mixes 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Composition</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x NTB buffer</td>
 <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.05 M MgCl2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mg/ml BSA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix</td>
 <td>0.5 mM dGTP</td>
 <td>Store 50 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dATP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dCTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.125 mM dTTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 % PFA</td>
 <td>Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 &deg;C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA.</td>
 <td>Store 50 ml aliquots at -20 &deg;C, do not re-freeze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 % saponin solution</td>
 <td>Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. </td>
 <td>Store 5 ml aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 x SSC</td>
 <td>Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate mix</td>
 <td>20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight.</td>
 <td>Store 500 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>

robust 3d dna fish using directly labeled probes

3D FISH DNA hat sich zu einem wichtigen Instrument für die Analyse dreidimensionale Organisation des Zellkerns, und einige Variationen dieser Technik wurden veröffentlicht. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll, das für Robustheit, Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit optimiert wurde. Hell fluoreszierende direkt markierten Sonden durch Nick-Translation mit Amino-allyldUTP durch chemische Kopplung des Farbstoffes gefolgt erzeugt. 3D DNA FISH unter Verwendung eines Gefrier-Auftau-Schritt für Zellpermeabilisierung und einen Erwärmungsschritt zum gleichzeitigen Denaturierung der Sonde und Kern-DNA. Das Protokoll ist auf einen Bereich von Zelltypen und eine Vielzahl von Sonden (BACs, Plasmide, Fosmide oder ganzes Chromosom Paints) und ermöglicht automatisiertes Hochdurchsatz-Bildgebung. Mit dieser Methode routinemäßig untersucht Kernlokalisation bis zu drei chromosomalen Regionen.

Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1 für Übersicht) hat mit großer Wirkung verwendet worden, um DNA FISH mit hohem Durchsatz Bilderfassung für die Analyse von genomischen Organisation kombinieren. Die Erzeugung von guter Qualität Sonden ist entscheidend für den Erfolg (siehe Diskussion). Abbildung 2 zeigt zwei wichtige Qualitätskontrollen für FISH-Sonden. Nach Nick-Translation, sollte ein Abstrich der DNA sichtbar mit der Masse der Fragmente, die zwischen 150 und 700 bp (Abbildung 2A). Nach der chemischen Kopplung kann Einarbeitung des Fluoreszenzfarbstoffs durch spektroskopische Analyse der Probe (2B) gemessen werden. Bei der Verwendung von guten Sonden, im Anschluss an die DNA FISH Protokoll führt in der Regel hell DNA FISH-Signale mit niedrigem Hintergrund. Wir haben erfolgreich dieses Protokoll auf einer Vielzahl verschiedener Zelltypen verwendet, und entweder mit Auflicht-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopen. Automated Imaging mit einem epi-fluorescence Mikroskop erfordert scharfe, leicht identifizierbar FISH-Signale mit wenig Hintergrund (Abbildung 3), während die konfokale Mikroskopie erfordert intensivere Signale. 4A zeigt repräsentative Bilder verarbeitet. Kernkoordinaten FISH-Signale erhalten werden, und die räumliche Beziehung der genomischen Regionen berechnet (Beispiel siehe 4B) werden. Wir haben auch Bildstapeln durch konfokale Mikroskopie für 3D-Modellierung der FISH-Signale in ihrem Chromosom Gebiete (Movie 1) erhalten wird. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Abbildung 1. Workflow für Sondenmarkierung und DNA FISH. Herstellung der Sonden ist in blau dargestellt. DNA FISH-Verfahren ist in schwarz mit Details in grün gegeben gezeigt. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Abbildung 2. Markierung von Sonden durch Nick-Translation und Qualitätskontrolle von markierten Sonden. A) zeigt Gel ideal Abstrich vor der Erwärmung auf DNase I (Spur 1 zu inaktivieren: DNA-Leiter, Spur 2 und 3: BACs nach Nick-Translation). Fragmente sollten in der 150-700 bp liegen. Ein weiterer Abstrich bei ~ 1 kb wird häufig mit erfolgreichen Nick-Translation Reaktionen beobachtet. B) Microvolume volle Spektrum Analyse der markierten Sonden. Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm DNA-Peak bei 260 nm mit einem zweiten Peak, entsprechend der Absorptionswellenlänge des Fluorophors die Sonde mit markierten beobachtet. Dargestellt sind drei Sonden mit einer guten Einarbeitung: Fluorophor Absorptionsspitzen sind ein ähnlicher Höhe oder höher als die DNA Gipfeln. Alexa Fluor 647 hat in der Regel höhere Absorptionals Alexa Fluor 555, was wiederum eine höhere Absorption als Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorbiert auch etwas Licht bei 260 nm, also die erste Spitze dieser Sonde größer ist als die anderen. Probes mit schlechten Einbau Show Fluorophor Absorption 2-3-fach niedriger als die DNA Absorption. Sonden mit einem mehr als 2-fach höher als Fluorophor peak peak DNA enthalten in der Regel nicht konjugierten Farbstoff, der Hintergrund in der FISH verursachen können. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Abbildung 3. Screenshot aus dem MetaCyte 3D FISH Imaging-Software, die eine typische Drei-Farben-FISH Experiment. Der Bildschirm ist in mehrere Teile gegliedert. A) Raw field-of-view (FOV) Bild von der Metafer / MetaCyte Dia Scan-System erfasst werden. B) Galerie von Bildern der Kerne, die un identifiziert habendergone Bildverarbeitung und Segmentierung für FISH-Signale. Verschiedene Arten von Daten können auf jeder Galerie Bild angezeigt werden. In diesem Beispiel Zellzahl wird oben links mit verschiedenen interallelic und interlocus Entfernungen rechts oben und zu beiden Seiten unter jedem Bild angezeigt. C) Slide Namen mit der Anzahl der Kerne in der Analyse. Identifiziert D) Darstellung des Schlittens mit dem durch das gescannte System. E) Erweiterung des gescannten Bereichs. Weiße Flecken darstellen identifiziert Kerne pro FOV. F) verarbeitet Daten. In diesem Beispiel maximal interallelic Abstände zwischen grünen Signale (oben) und rote Signale (unten) gezeigt. Die gezeigten Daten ist von der Maus P20 Keimzellen. Die Sonden werden auf verschiedenen Chromosomen, für HBB und Hba Gene und eine Histon-Cluster befinden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele von bearbeiteten Bilder und abgeleiteten Positionsdaten. A) verarbeitet Bilder für E13.5 Maus fötalen Leberzellen mit BAC-Sonden auf verschiedenen Chromosomen abdecken Myc und KCNQ1 Gene (sog. myc und KvDMR, grün bzw. rot). B) Tukey-Box-Whisker-Plots, die die interallelic erreichbar gefärbt Verteilung für die gleichen Loci in 600 Kerne. Interallelic Abstand wird als Bruch des Kerns &#39;Radius (Abstand / Radius) zu berücksichtigen Variationen in Kerngröße aufgetragen. ES Zellkerne haben einen Radius von etwa 5 um. Red Sonden wesentlich näher beieinander liegen als grüne Sonden (***: p &lt;0,01, ungepaarten t-Test). Daten aus 10. Film 1. 3D-Modellierung von zwei Loci in ihrem Chromosom territory. Zwei BAC-Sonden in der Nähe von beiden Enden des Maus-Chromosom 7 befindet etikettiert wurden (rot und weit rot, (pseudo-weiß gefärbt)) und zusammen mit einem ganzen Chromosom Farbe (grün) an Maus-ES-Zellen hybridisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> .

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Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

34.5K Aufrufe.  The Babraham Institute. Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Serie: Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

DNA-basierte Fischarten Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Forschung

Biologie

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Fisch Sperma Bewertung mit Software und Kühlgeräte

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...