Der Comet-Assay wird häufig zur Beurteilung der Genotoxizität verwendet. Unser Protokoll bietet eine Reihe von methodischen Vorteilen gegenüber dem Standard-Kometentest. Unsere Technologie konzentriert sich darauf, die Standard-Kometenschlitten vertikal zu halten und in Chargen von 25 in einem speziell angefertigten Rack zu verarbeiten.
Dazu gehört auch die Elektrophorese, so dass der Tank kleiner ist, weniger Puffer verbraucht und über eine integrierte Kühlung verfügt. In einem Rack gehalten, sind die empfindlichen Gele auf den Objektträgern besser geschützt und bewegen sich in 25 Sekunden von Lösung zu Lösung. Mit unserem Blutkometenprotokoll können Forscher einen Nadelstich Blut verwenden, um DNA-Schäden bei Menschen, anderen Arten und einer Vielzahl potenziell genotoxischer Umweltexpositionen zu untersuchen.
Alle verschiedenen Formate für den Kometentest, die Objektträger als festen Träger für die Kometengele verwenden, sind unserem Ansatz zugänglich. Der entscheidende Teil dieser Technik ist das Laden von Proben nach dem Mischen mit LMP-Agarose. Die Proben sollten schnell und blasenfrei geladen und vor dem Erstarren sofort mit einem Deckschlupf abgedeckt werden.
Um zu beginnen, bereiten Sie 0,6% niedrige Schmelzpunktagarose in PBS vor und legen Sie es in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Beschriften Sie das mattierte Ende der vorbeschichteten Objektträger mit Namen, Datum und Behandlungsinformationen mit einem Permanentmarker oder Bleistift. Stellen Sie eine Kühlplatte auf eine flache Bank und legen Sie zwei gefrorene Kühlpakete in die Schiebeschublade unter der Metalloberfläche.
Dann legen Sie die Objektträger auf die Kühlplatte, um sie für ein bis zwei Minuten vorzukühlen. Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand aus den Probenröhrchen und legen Sie sie sofort wieder auf Eis. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 200 Mikrolitern 0,6% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und mischen Sie es durch Pipettieren.
Als nächstes fügen Sie 80 Mikroliter agarosehaltige Zellen auf einen gekühlten Objektträger und legen Sie schnell einen Deckstreifen auf das Gel. Lassen Sie das Gel ein bis zwei Minuten auf der Kühlplatte aushärten. In der Zwischenzeit 500 Milliliter Arbeitslösung des Lysepuffers vorbereiten und in die Lyseschale gießen.
Nachdem die Gele ausgehärtet sind, entfernen Sie die Deckgläser schnell, indem Sie den Objektträger vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger halten und den Deckstreifen vom Gel schieben. Legen Sie dann die Dias in einen Objektträger, wobei alle schwarzen Punktmarkierungen auf den Objektträgern in die gleiche Richtung zeigen. Legen Sie den Objektträger in die Lyseschale.
Schließen Sie den Deckel der Lyseschale und legen Sie ihn zur Inkubation. Entfernen Sie vorsichtig den Objektträgerträger aus der Lyseschale, ohne die Gele zu stören. Legen Sie den Objektträgerträger vorsichtig in eine mit eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser vorgeladene Waschschale.
Stellen Sie sicher, dass die Dias vollständig untergetaucht sind und verlassen Sie das Setup für 30 Minuten. Legen Sie eine gefrorene Kühlpackung unter den Elektrophoresetank, um die optimale Puffertemperatur aufrechtzuerhalten. Dann geben Sie eiskalte Elektrophorese-Arbeitslösung in den Tank und geben Sie den Objektträger hinein.
Richten Sie die Objektträger so aus, dass die zellhaltigen Gele auf die Kathode zeigen. Inkubieren Sie die Objektträger im Elektrophoresetank für 20 Minuten, damit sich die DNA entspannen kann. Schalten Sie dann das Netzteil ein, um eine Elektrophorese für 20 Minuten bei 1,19 Volt pro Zentimeter durchzuführen.
Schalten Sie nach Abschluss der Elektrophorese die Stromversorgung aus und entfernen Sie den Objektträgerträger aus dem Elektrophoresetank. Lassen Sie den Objektträger 30 Sekunden lang auf Seidenpapier abtropfen. Als nächstes legen Sie den Objektträger in eine Schale mit Neutralisationspuffer und lassen Sie ihn 20 Minuten stehen.
Danach legen Sie es in eine Waschschale, die eiskaltes doppelt destilliertes Wasser enthält, und lassen Sie es 20 Minuten einwirken. Nach dem Waschen den Objektträgerträger aus dem Wasser nehmen und die Objektträger in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius eine Stunde trocknen lassen. Um die Objektträger zu rehydrieren, geben Sie den Objektträger in eine Waschschale, die eiskaltes doppelt destilliertes Wasser enthält, und lassen Sie ihn 30 Minuten stehen.
Dann legen Sie den Objektträger in eine Färbeschale mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodidlösung. Schließen Sie den Deckel der Beibeschale und brüten Sie ihn 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur aus. Nach der Inkubation den Objektträger in eine separate Schale geben und 20 Minuten mit eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser waschen.
Nehmen Sie den Objektträger aus der Schale und trocknen Sie ihn vollständig im Dunkeln, entweder in einem 37-Grad-Inkubator oder bei Raumtemperatur. Nachdem die Dias vollständig getrocknet sind, bewahren Sie sie in einer Diabox im Dunkeln auf, bis sie für die Bildanalyse bereit sind. Menschliche Keratinozyten wurden mit unterschiedlichen Dosen von UVA und UVB bestrahlt oder mit 50-Mikromolar-Wasserstoffperoxid behandelt, um DNA-Schäden zu induzieren.
Die optimale Spannung betrug 1,19 Volt Zentimeter, da sie die empfindlichste Reaktion und den größten Prozentsatz der Schwanz-DNA induziert. Menschliches Vollblut wurde mit unterschiedlichen UVA-Dosen bestrahlt und mit unterschiedlichen FPG-Konzentrationen behandelt. Hochdurchsatz-alkalischer Kometentest zeigte, dass die optimalen DNA-Schäden mit vier Einheiten pro Milliliter Fpg induziert wurden.
Die Eierstockkrebs-Zelllinie SK-OV-3 wurde mit einer Kombination aus Cisplatin und Wasserstoffperoxid behandelt. Die nicht exponierten Zellen zeigten keine Schäden. Die Exposition bei Wasserstoffperoxid allein erzeugte ein signifikantes mittleres Olivenschwanzmoment im Vergleich zu den Zellen, in denen DNA-Intrastrang-Vernetzungen induziert wurden.
Nach der Behandlung mit 100-Mikromolar Cisplatin nahmen die DNA-Intrastrang-Vernetzungen mit einem Peak nach 12 Stunden zu, wonach die Werte nach 30 Stunden auf Null sanken Es ist wichtig, den Eisbeutel in den Elektrophoresetank zu legen und Objektträger für 20 Minuten zu inkubieren, um die DNA vor der Elektrophorese abzuwickeln. Dieser Schritt wird der beschädigten DNA helfen, sich durch Strom zu bewegen. Die Durchführung des Assays mit vertikal platzierten Objektträgern ermöglichte es uns, den Kometentest zu automatisieren.
Darüber hinaus hat unsere Technik den Kometen-Assay für die Forschung vereinfacht.
