Dieses Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass jedes Labor, das sich mit Elektrofahrzeugen befasst, die Endotoxinkontamination begrenzen kann, indem es ein aseptisches Verfahren durchführt und einfache und weit verbreitete Geräte verwendet. Jeder, der diese Technik zum ersten Mal ausprobiert, sollte mit neuen Medien, Reagenzien und Kunststoffen beginnen, die endotoxinarm, nicht pyrogen markiert sind.
Verwenden Sie für dieses Protokoll endotoxinfreie Reagenzien, Wasser, Nährmedien, gefiltertes PBS, FBS mit extrem niedrigem Endotoxingehalt und Ultrazentrifugenröhrchen. Sammeln Sie zunächst den Überstand von zuvor kultivierten SW480- und SW620-Zelllinien in entsprechend markierten 15-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie den Überstand fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 x g zentrifugieren.
Sammeln Sie den Überstand, ohne den Schmutz zu stören, in einem neuen beschrifteten Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 3.200 x g für 12 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie vorsichtig 45 Milliliter des Überstands in ein senkrecht aufgestelltes steriles 50-Milliliter-Röhrchen, ohne die Ränder des Röhrchens zu benetzen. Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens mit einer sterilen, transparenten Folie ein und lagern Sie sie senkrecht bei minus 80 Grad Celsius, um anschließend extrazelluläre Vesikel zu isolieren.
Beginnen Sie mit der Isolierung, indem Sie 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter, Spritzen und Röhrchen mit etwa 90 Millilitern Überstand vorbereiten. Füllen Sie eine Spritze mit dem Überstand und befestigen Sie den Filter am Nadeladapter. Filtern Sie den Überstand durch den Filter in ein 50-Milliliter-Röhrchen.
Sieben Milliliter des Filtrats werden in ein vorbereitetes Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert und zwei Stunden lang bei 100.000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um den Überstand zu entsorgen. Ziehen Sie die Pellets mit einer langen gefilterten Pipettenspitze in ein Ultrazentrifugenröhrchen.
Spülen Sie die extrazellulären Vesikel durch Zugabe von sieben Millilitern gefiltertem endotoxinfreiem PBS. Nach der Ultrazentrifugation wird der Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette verworfen und das Pellet in 200 Mikrolitern endotoxinfreiem PBS resuspendiert. Übertragen Sie die Suspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Reagenzglas mit geringer Proteinbindung.
Übertragen Sie dann 10 Mikroliter Suspension zur weiteren Analyse in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Verdünnen Sie nun in einem neuen Röhrchen einen Mikroliter Suspension mit gefiltertem PBS im Verhältnis 1 zu 1000 für die Nanopartikel-Tracking-Analyse.
Um eine Blotting-Analyse durchzuführen, mischen Sie zunächst 20 Mikrogramm der Proben mit einem Beladungspuffer. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Laden Sie dann 20 Mikrogramm der Probe in jede Vertiefung eines 10 bis 14%igen Polyacrylamidgels mit SDS und führen Sie eine Elektrophorese für 45 Minuten bei 150 Volt mit laufendem Puffer durch.
Als nächstes geben Sie das Gel in eine Transfermaschine mit Towbin-Puffer und führen eine Stunde lang einen halbtrockenen Transfer von Proteinen auf eine Polyvinylidendifluoridmembran bei 25 Volt durch. Blockieren Sie die Membran mit 1% BSA, indem Sie sie eine Stunde lang auf einer Wippe inkubieren. Fügen Sie der Membran BSA-verdünnte Antikörper, Anti-CD9 oder Anti-Alix, hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippe.
Waschen Sie die Membran nach dem Entfernen der Antikörper dreimal 10 Minuten lang mit 10 Millilitern TBST. Fügen Sie nun Ziegen-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie erneut eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Entsorgen Sie den Antikörper und waschen Sie die Membran wie zuvor gezeigt.
Gießen Sie einen Milliliter der Lösung, die Substrat und Luminol enthält, in einem gleichen Verhältnis auf die Membran. Platzieren Sie die Membran sofort in einem Bildgebungssystem und visualisieren Sie die Proteinbanden auf dem Bildschirm. In der vorliegenden Studie bestätigte die Western-Blot-Analyse das Vorhandensein von zwei extrazellulären Vesikelmarkern, CD9 und Alix.
Die mittlere Größe und die Konzentrationen der Vesikel, die sowohl aus SW480 als auch aus SW620 isoliert wurden, waren ähnlich. Die Stimulation von Monozyten mit verschiedenen Dosen von Lipopolysaccharid (LPS) zeigte die niedrigste Dosis von LPS, die die Sekretion von Interleukin 10 ermöglichte, und der Tumornekrosefaktor in Monozyten betrug 50 Pikogramm pro Milliliter. Der chromogene LAL-Test zeigte, dass die LPS-Kontamination der extrazellulären Vesikel für beide Zelllinien etwa 50 Pikogramm pro Milliliter betrug.
Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist die Verwendung von LPS-freien oder abgereicherten Reagenzien und die routinemäßige LPS-Messung bei jedem Schritt des Verfahrens. Es ist einfacher, eine Endotoxinkontamination zu verhindern, als sie zu beseitigen. Das vorgeschlagene Protokoll begrenzt die Möglichkeit falscher Ergebnisse aufgrund der Kontamination von EVs mit Endotoxin und ermöglicht die Bewertung der EV-Aktivität pro Zelle.
Das vorgeschlagene Protokoll ist nützlich für Forscher, die mit Endotoxin-empfindlichen Zellen wie Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen arbeiten.
