Diese Methode kann helfen, Fragen im Zusammenhang mit der Effizienz, Erholungsausbeute und Reinheit der bronchoalveolar Lavage Flüssigkeit abgeleitet extrazelluläre Vesikel mit einem Ultrafiltrationzentrifugierungsansatz zu behandeln. Wir haben diese Technik direkt mit einer Ultrazentrifugations- und Dichtegradientenreinigungstechnik verglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es einfach, effizient und geeignet für kleine Volumenproben wie murine Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit ist.
Noch wichtiger ist, dass es eine hohe Reinheit und eine deutlich höhere Skalierbarkeit im Vergleich zu einer Ultrazentrifugationsisolationsmethode bietet. Demonstriert wird das Verfahren von Herrn Norman Garrett III, wissenschaftlicher Mitarbeiter für mein Labor. Um zu beginnen, legen Sie einen 22 Gauge Angiocatheter in die Luftröhre einer eingeschläferten Maus.
Befestigen Sie eine Insulinspritze mit einem Milliliter eiskalter steriler DPBS und bringen Sie einen Milliliter in beide Lungen ein. Ziehen Sie den Spritzenkolben langsam zurück, um Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit oder BAL-Flüssigkeit abzurufen. Und geben Sie die BAL-Flüssigkeit in ein konisches Rohr auf Eis.
Ziehen Sie danach BAL-Flüssigkeit von 25 Mäusen und teilen Sie sie in zwei gleiche Sätze. Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit bei 400 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie es bei 15.000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Dann sammeln Sie den Überstand und gehen Sie sofort zu den EV-Isolationsschritten. Filtern Sie zunächst den Supernatanten durch einen 0,2 Mikrometer sterilen Spritzenfilter. Danach die Zentrifugalfiltereinheit 10 Minuten lang mit sterilem DPBS ausdemieren.
Dann zentrifugieren Sie die Zentrifugaleinheit bei 15.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie den Filter mit 15 Milliliter n. B. BAL-Flüssigkeit. Und zentrifugieren Sie es bei 3.000 G es für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Danach das Retentat mit 14 Millilitern sterilem DPBS durch wiederholtes Pipetieren vorsichtig waschen. Zentrifugieren Sie die Filtereinheit bei 3.000 G bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, um das DPBS zu entfernen und das Retenat zu konzentrieren. Um die konzentrierte BAL-Flüssigkeit von Eves zu erfassen, legen Sie einen Pipetter in den Boden der Filtereinheit ein und ziehen Sie die Probe mit einer seitlichen Kehrbewegung zurück.
Dann aliquot die BAL-Flüssigkeit abgeleitet EVs und speichern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Alternativ können Sie zunächst den zuvor erworbenen Überstand auf ein Ultrazentrifugenrohr übertragen. Und zentrifugieren Sie es bei 10.000 G es für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann sammeln Sie den Überstand und Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das EV-Pellet in 200 Mikroliter DPBS wieder auf. Danach die EV-Suspension mit 300 Mikrolitern 50%iodixanol Arbeitslösung mischen.
Und übertragen Sie es auf ein 15 Milliliter Ultrazentrifugenrohr. Fügen Sie dann pufferlösung nach dem Textprotokoll hinzu, um einen lebhaften Dichtegradienten zu erstellen, und zentrifugieren Sie ihn drei Stunden und 50 Minuten lang bei 100 000 G. Sammeln Sie die 15% und die 25%iodixanol Fraktionen, und verdünnen Sie sie in DPBS, um das Volumen auf 15 Milliliter zu bringen.
Übertragen Sie die Fraktionen 60 Minuten lang auf ein neues Ultrazentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 100 000 G bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die EV-Pellets in 50 Mikroliter sterilen DPBS wieder auf. Um mit der Nanopartikelverfolgungsanalyse zu beginnen, verdünnen Sie die EV-Probe in einem Milliliter DPBS.
Und die Probe in eine Insulinspritze geben. Befestigen Sie die Spritze anschließend an einer Spritzenpumpe und messen Sie die Partikelzahlen und die Größe. Stellen Sie den Kamerapegel auf 14 und den Erkennungsschwellenwert auf 1 fest.
Als Nächstes verwenden Sie einen Plattenleser, um die Menge des Proteins in der EV-Probe durch kolorimetrische Detektion zu quantifizieren. Lösen Sie eine gleiche Menge EV-Protein aus jeder Probe mit einem Blotting-Ladepuffer und DTT. Dann erhitzen Sie die Proben bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten.
Die Proben in ein Bis-Tris Plus Acrylamidgel laden und 35 Minuten lang Elektrophorese betreiben. Übertragen Sie die Proteine dann mit einem Trockentransferverfahren auf eine Nitrocellulosemembran. Danach die Membran mit fünf Prozent Magermilch 60 Minuten lang mit sanftem Schaukeln blockieren.
Inkubieren Sie die Membran mit einem Antikörper gegen einen EV-Oberflächenproteinmarker bei vier Grad Celsius mit sanftem Schaukeln über Nacht. Entwickeln Sie die Membran, indem Sie die Membran mit HRP-Link-Antikörper für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Membran 10 Minuten lang mit DemTBST-Puffer dreimal.
Schließlich entwickeln Sie die Membran mit chemilumineszierendem HRP-Antikörper-Detektionsreagenz, bevor Sie mit der Bildgebung fortfahren. Um mit der Durchflusszytometrie zu beginnen, verdünnte BAL-Flüssigkeit eVs in 49 Mikroliter PEB-Färbepuffer. Fügen Sie dann drei Antikörper zu jeder der Proben hinzu, bevor Sie die Proben bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für 60 Minuten im Dunkeln inkubieren.
Schließlich verdünnen Sie die Proben mit 40 Mikroliter membrangefilterten PEB-Färbungspuffer und führen Sie eine Durchflusszytometrieanalyse durch. In diesem Protokoll wurden Eves mit einer UFC- und UC-DGC-Methode von Maus-BAL-Flüssigkeit isoliert. BAL-Flüssigkeit abgeleitet EVs von normalen Mäusen, die durch die UFC-Methode isoliert wurden, zeigten kleinere Größen und eine gleichmäßigere Größenverteilung als die UC-DGC-EV.
Die UFC-Technik hatte auch eine signifikant höhere Gesamtpartikelzahl im Vergleich zur UC-DGC-Technik. Die gesamte Proteinrückgewinnung, gemessen in Milligramm der UFC-Evs, war ebenfalls höher als die der UC-DGC-EV, was darauf hindeutet, dass die UFC-Technik zeit- und zeitaufwändiger ist. Schließlich wurden die von BAL abgeleiteten EV es auch durch Durchflusszytometrie weiter charakterisiert.
Die sowohl CD63, CD9 als auch CD81 der UFC-EV und der UC-DGC-EV. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Membran der Ultrafiltrationseinheit mit DPBS zu rehydrieren. Sobald die Membran hydratisiert ist, muss das Gerät bis zum Einsatz jederzeit nass gehalten werden.
Das Abrufen von extrazellulärem Vesikelretenat aus der Filtereinheit kann eine Herausforderung sein. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze von Seite zu Seite gefegt wird, um die meisten EVs von der Filtereinheit wiederherzustellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der extrazellulären Vesikelisolierung, um die biologischen Funktionen der bronchoalveolaren Lavage zu erforschen, die extrazelluläre Vesikel sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen bei Kleintieren ableitete.
