Die Autoren danken Riccardo Urbanet für die technische Unterstützung bei den Liquid-Handling-Geräten und Rodi Odabasi für die Unterstützung bei der Epifluoreszenzmikroskopie. Finanziert wurde diese Arbeit vom Schweizerischen Nationalfonds (Förderkennzeichen 310030E_202429 und 205321_204318) und der Ectica Technologies AG.

3D-Co-Kultur-Assay: Vaskularisierte osteogene Nischen für das Screening von Krebsmedikamenten

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Die Ectica Technologies AG ist der Hersteller der 3DProSeed Hydrogel-Well-Platte und hat kommerzielle Beteiligungen. Benjamin R. Simona und Martin Ehrbar sind Aktionäre der Ectica Technologies AG.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Etablierung eines in vitro Modells von stark vaskularisiertem Knochen und Knochenmarksnischen in einer vollsynthetischen und kontrollierbaren 3D-PEG-basierten Matrix, das eine Vielzahl von Anwendungen in der Knochen- und Knochenmarksbiologie, im Tissue Engineering und in der Krebsforschung hat. Dieses Modell baut auf einem synthetischen Hydrogel auf PEG-Basis auf, das mit RGD-Peptiden und MMP-Spaltstellen funktionalisiert und mit einem tiefen Dichtegradienten auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden gegossen wird30. Es wurde gezeigt, dass diese Plug-and-Play-Plattform den Aufbau hochgradig vernetzter 3D-Mobilfunknetze ermöglicht, ohne dass Zellen in das Hydrogel eingekapselt werden müssen. Ähnlich wie bei dem zuvor beschriebenen Zellverkapselungsprotokoll zeigen wir in dieser Arbeit den Umbau des Substrats durch eine zellinhärente ECM28 , um eine zelltypspezifische Mikroumgebung zu schaffen. So können mit dieser Methode Arzneimittel-Screening-Assays und High-Content-Analysen unter hochreproduzierbaren, organotypischen 3D-Kulturbedingungen einfach durchgeführt werden. Die 96-Well-Platten mit Glasboden und die optisch transparenten Hydrogele machen die Plattform kompatibel mit der Automatisierung des Liquid Handling und der Hochdurchsatzmikroskopie.
Der erste Schritt zur Erzeugung einer osteogenen vaskulären Knochenmarksnische ist die Vorkultur von hBM-MSCs auf dem PEG-Hydrogel für mindestens 3 Tage. Während dieser Zeit lagern sie sich an das Hydrogel an, dringen in es ein und beginnen mit dem Aufbau von Zell-Zell-Kontakten und der ECM-Abscheidung. Vor der Aussaat der hBM-MSCs muss der Speicherpuffer entfernt werden. Da sich das Hydrogel in einer inneren Vertiefung innerhalb der Standardvertiefung der 96-Well-Belichtungsplatte befindet, ist es sicher, die Aspirationsspitze an der Seite der Vertiefung einzuführen, bis sie den inneren Vertiefungsring berührt. Eine Vakuumpumpe kann zur Absaugung verwendet werden, wenn sie auf eine möglichst geringe Saugkraft eingestellt ist. Alternativ kann eine automatische Plattenwaschanlage mit einer auf mindestens 0,8 mm eingestellten Düsenhöhe über dem inneren Wellring verwendet werden, um den Puffer von der Hydrogelplatte abzusaugen. Durch den Einsatz von Automatisierung für das Liquid Handling kann die Beschädigung der Hydrogeloberfläche minimiert und eine höhere Reproduzierbarkeit der resultierenden Kulturen erreicht werden. Kleine Defekte auf der Hydrogeloberfläche werden sichtbar, sobald sich die Zellen auf dem Hydrogel absetzen, und erscheinen in defekten Hydrogelbereichen auf einer niedrigeren Fokusebene. Daher dient die Aufnahme von Referenzbildern an Tag 0 als gute Qualitätskontrolle für die Homogenität der Zellaussaat und die Integrität der Hydrogeloberfläche. Während kleine Hydrogel-Oberflächendefekte die weitere Verwendung des Wells nicht ausschließen, neigen die Zellen dazu, sich an den defekten Stellen zu bündeln und zu nicht repräsentativen Mustern zu wachsen oder schneller das untere Glas zu erreichen, wo sie zu einer Monoschicht heranwachsen. Diese Artefakte müssen bei der Nutzung/Auswertung dieser Bohrungen beachtet werden. Ähnliche Überlegungen gelten für alle Mediumsänderungen, die während der gesamten Dauer des Assays durchgeführt werden.
Der zweite Schritt des Protokolls beinhaltet die Zugabe von GFP-HUVECs zur vorgeformten hBM-MSC-Monokultur (Tag 0 der Kokultur). Die von der hBM-MSC abgeschiedene EZM bietet ein großartiges Gerüst für das Wachstum von Endothelzellen, die in dieser Arbeit selbst in Gegenwart von hBM-MSC-konditioniertem Medium nur runde Zellcluster auf den Hydrogelen bilden konnten (nicht gezeigt). Nach der Aussaat auf den hBM-MSC-Kulturen integrieren sich die HUVECs und bilden mikrogefäßartige Strukturen, die mit denen vergleichbar sind, die in Kokulturen beobachtet werden, die durch Zellverkapselung erzeugt werden27,28. Typischerweise bilden sich innerhalb von 4 Tagen nach der Kokultur gut entwickelte mikrovaskuläre 3D-Netzwerke, die durch die Verwendung von GFP-markierten HUVECs longitudinal überwacht werden können. Diese Strukturen können mindestens 7 Tage lang in Kultur erhalten bleiben, was bedeutet, dass genügend Zeit bleibt, um Veränderungen in der Organisation des Gefäßnetzwerks als Reaktion auf Behandlungen, z. B. für das Screening von antiangiogenen Medikamenten, zu verfolgen. Die morphologischen Elemente des Endothelnetzwerks können im Batch-Modus quantifiziert werden, indem die GFP-Bilder mit etablierten Werkzeugen, wie dem Angiogenesis Analyzer-Plugin von ImageJ33, segmentiert werden, und ihre Parameter können verwendet werden, um beispielsweise die Wirksamkeit und Pharmakodynamik von Medikamenten zu bewerten.
Ein wesentlicher Vorteil des beschriebenen zellulären Modells für viele mögliche Anwendungen ist seine Plastizität. Allein die Ergänzung des Nährmediums mit verschiedenen Wachstumsfaktoren kann das Erscheinungsbild der Co-Kultur verändern. Zum Beispiel schafft die Anwesenheit von BMP-2 während der Mono- und Co-Kulturperiode eine osteogene vaskuläre Nische, die eine erhöhte ALP-Aktivität, extrazelluläre Kalziumablagerung sowie ECM-Assemblierung und -Ablagerung zeigt. Im Gegenteil, in Gegenwart von FGF-2 fehlen die osteogenen Marker, und die Co-Kultur bildet weniger laterale Zellverbände, zeigt aber ein ausgeprägteres 3D-Zellwachstum. Die Tatsache, dass FGF-2 die ALP-Aktivität unterdrückt, während BMP-2 im Vergleich zu keiner Behandlung mit Wachstumsfaktoren eine stärkere ALP-Aktivität hervorruft, stimmt mit früheren Beobachtungen überein27. Trotz dieser großen Unterschiede in der hBM-MSC-Stromakomponente war das Ausmaß des mikrovaskulären Netzwerks für die beiden mit Wachstumsfaktoren behandelten Erkrankungen in dieser Arbeit sehr ähnlich. In den Kontrollkulturen bildeten sich nur wenige kurze Gefäßnetzwerke, die möglicherweise eine schlecht vaskularisierte Knochenmarksnische darstellen. Dies deutet darauf hin, dass durch einfache Änderung der Art, der Konzentration und des Zeitpunkts der Wachstumsfaktoren, die dem Nährmedium zugesetzt werden, eine Reihe von gut definierten vaskularisierten Knochenmarknischen erzeugt werden könnte, wie sie für vergleichende Studien erforderlich wären. Um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, ist es jedoch wichtig zu beachten, dass der Kulturverlauf und die Morphologie je nach Vorgeschichte der verwendeten Zellen variieren können (z. B. die Anzahl der Passagen und die Ablösungsmethode, die bei der routinemäßigen Kulturpflege verwendet wird), und es ist ratsam, solche Faktoren während des Assay-Designs zu kontrollieren.
Hier demonstrieren wir als erste Anwendung dieses Modells die Sensitivität der konstruierten mikrovaskulären Netzwerke gegenüber der Behandlung mit 10 μg/ml Bevacizumab. Insbesondere ist es wichtig zu bestätigen, dass der verwendete Algorithmus das Endothelnetzwerk genau erkennen kann, da Artefakte oft in Bildern mit schlecht entwickelten Netzwerken erzeugt werden. Wenn dies der Fall ist, müssen die für die Bildverarbeitung verwendeten Parameter (vor und während der Segmentierung) fein abgestimmt werden, oft nach dem Prinzip von Versuch und Irrtum.
Als zweite Anwendung präsentieren wir ein fortschrittliches Co-Kulturmodell, das durch die sequentielle Aussaat von mesenchymalen, endothelialen und Krebszellen gebildet wird. Dieses Modell ermöglicht es, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen, dem Stroma und dem Gefäßsystem des Knochenmarks zu untersuchen, die wichtige Faktoren während der Metastasierung sein können. Darüber hinaus könnte dieses Modell für das Screening von Medikamenten und zum Testen von Wirkstoffen verwendet werden, deren Ziele über die Angiogenese hinausgehen.
In 2D-Kulturen erhalten Zellen keine physiologischen Mikroumgebungssignale, erwerben keine natürlich vorkommenden Zellmorphologien und differenzieren sich daher anders als Zellen in nativen 3D-Umgebungen35. Wenn die Zellen in technisch hergestellten 3D-Hydrogelen gezüchtet werden, lagern sie frühzeitig eine inhärente EZM ab, die Adhäsionsstellen bietet und aktiv umgestaltet werden kann28,36. Um ein vereinfachtes 3D-Modell für Screening-Anwendungen zu erstellen, wurden gefäßbildende Zellen auf die Oberfläche von künstlich hergestellten Hydrogelen gesät und in der Lage sein, Gefäßnetzwerke ohne Perfusion aufzubauen. Die bildgebenden Auswertungen wurden an 2D-Projektionen der Endothelzellen durchgeführt, die zu vaskulären Strukturen beitragen. Allerdings zeigten nur konfokale Aufnahmen das weniger ausgeprägte Einwachsen der 3D-Gefäßnetzwerke in den BMP-2-stimulierten Proben im Vergleich zu den FGF-2-stimulierten Proben. Dies deutet darauf hin, dass die Länge der gebildeten Gefäßstrukturen unterschätzt wurde, während ihre Konnektivität überschätzt wurde. Darüber hinaus wurden die Wechselwirkungen zwischen perivaskulären und endothelialen Zellen und der vaskulären Lumenbildung nicht untersucht. Diese Aspekte, insbesondere im Hinblick auf das Ansprechen auf die medikamentöse Behandlung, müssen weiter beachtet werden. Schließlich wären verfeinerte Protokolle wünschenswert, um zunächst umfangreiche 3D-Gefäßnetzwerke zu etablieren und erst dann deren osteogene Differenzierung zu induzieren, um physiologischere Knochen- und Knochenmarkmodelle zu generieren.
Insgesamt ist das hier vorgestellte Modell sehr vielseitig und kann leicht auf bestimmte Anwendungen zugeschnitten werden. Zum Beispiel könnten mesenchymale und endotheliale Zellen aus unterschiedlichen Quellen verwendet werden. Es ist bekannt, dass Fettgewebs-MSCs und Nabelschnur-MSCs im Vergleich zu BM-MSCs unterschiedliche angiogene Faktoren exprimieren und leicht als alternative Stromakomponente substituiert werden können37. Anstelle von HUVECs könnten auch Endothelzellen verwendet werden, die aus bereits definierten Knochenmarknischen isoliert wurden. Man könnte die Co-Kultur auch mit patientenbezogenen, passenden mesenchymalen und endothelialen Knochenmarkszellen für Anwendungen in der personalisierten Medizin etablieren, wie es kürzlich für vaskularisierte Muskel-Co-Kulturen vorgeschlagen wurde38. Darüber hinaus ermöglicht das Design der Hydrogelplatte die longitudinale Überwachung der Kultur sowohl mit Hellfeld- als auch mit Fluoreszenzmikroskopie und bietet dem Anwender somit die Möglichkeit, die Kulturzeit je nach Anwendung zu verkürzen oder zu verlängern. Alternativ könnten die Zelldichten, die für die Aussaat verwendet werden, entsprechend angepasst werden, um die Bildung des Zellnetzwerks zu beschleunigen oder zu verzögern, wenn kürzere oder längere Beobachtungszeiten als die in diesem Protokoll vorgesehenen erforderlich sind. In jedem Fall ist Vorsicht geboten, um ein Überwachsen der Zellen zu schichtartigen Strukturen zu vermeiden, was zur Kontraktion des Hydrogels und schließlich zur Zellablösung führen kann.
Schließlich kann mit diesem Modell eine breite Palette von Assays durchgeführt werden. Zusätzlich zur Immunfluoreszenz und Mikroskopie, die in lebenden oder festen Kulturen durchgeführt wird, können die 3D-Kulturen enzymatisch verdaut werden, und die Zellen können entnommen und jeder Art von biochemischem Assay unterzogen werden. Hier demonstrieren wir die Bestimmung der ALP-Aktivität und der Quantifizierung des DNA-Gehalts in Zelllysaten mit Hilfe von kolorimetrischen/fluorometrischen Assays, aber das System ist mit vielen anderen Techniken kompatibel, einschließlich PCR, RNAseq und Proteomik. Wenn die Empfindlichkeit des gewünschten Assays nicht sehr hoch ist, kann man Proben aus mehr als einem Well zusammenfassen, um die für den Assay verfügbare Probenmenge zu erhöhen. Wenn die gewünschte Anwendung eine schnellere Gelauflösung erfordert, könnte ein orbitales Schütteln der Platte in Kombination mit kleineren Volumina der Verdauungslösung angewendet werden, um die Wirbelbildung in den Vertiefungen zu gewährleisten, vorausgesetzt, dass alle Vertiefungen auf der Platte auf diese Weise verwendet werden (lebende Kulturen reagieren empfindlich auf eine solch raue Handhabung). Zusammenfassend stellen wir hier ein Protokoll vor, das, wenn es wie beschrieben verwendet wird, die Generierung eines in vitro Modells garantiert, das die wichtigsten Aspekte osteogener vaskulärer Nischen rekapituliert, aber auch vielseitig genug ist, um für maßgeschneiderte Anwendungen modifiziert zu werden.

Der Knochen und das Knochenmark sind strukturell und funktionell komplexe Organe, die für die menschliche Gesundheit von zentraler Bedeutung sind. Dies spiegelt sich in der Existenz unterschiedlicher Nischen wider, die die Hämatopoese und den Knochenerhalt regulieren1. Es ist heute allgemein anerkannt, dass im gesunden Knochenmark der Erhalt und die Expansion von hämatopoetischen und skelettalen Stammzellen sowie ihrer Nachkommen durch bestimmte Nischen gesteuert werden. Diese Nischen umfassen verschiedene Zelltypen, darunter Osteolinienzellen, mesenchymale Stammzellen, Endothel- und Perivaskulärzellen, neuronale und Gliazellen, Adipozyten, Osteoklasten, Makrophagen und Neutrophile2. Es überrascht nicht, dass diese meist mit Gefäßen assoziierten Nischen auch an der Entstehung verschiedener Arten von Leukämie beteiligtsind 3 und der Ort der Metastasierung für verschiedene Krebsarten sind4. Aufgrund seiner spezifischen Rolle bei der Knochenbildung, dem Umbau und der Erhaltung des Knochenmarks (Knochenmarks) weist das knochenassoziierte Gefäßsystem ausgeprägte spezialisierte Strukturen auf, die sich von den Gefäßen unterscheiden, die anderswo im Körper zu finden sind 5,6,7. Daher können anti-angiogene oder gefäßmodulierende Medikamente, die systemisch angewendet werden, in diesen spezialisiertenUmgebungen unterschiedliche Wirkungen haben 8. Daher sind Modelle zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die an der Aufrechterhaltung der physiologischen Eigenschaften des Knochens und des Knochenmarks, der Regeneration von Knochen und Knochenmark und dem Ansprechen auf therapeutische Behandlungen beteiligt sind, sehr wünschenswert.
Klassische zweidimensionale (2D) Gewebekulturen und In-vivo-Untersuchungen an Tiermodellen haben unschätzbare Einblicke in die Rolle verschiedener Zellen und molekularer Akteure gegeben, die an der Entwicklung von Knochen und Knochenmark beteiligt sind 9,10. Modelle, die Hochdurchsatzexperimente mit relevanten menschlichen Zellen ermöglichen, könnten unser Verständnis dafür verbessern, wie ausgewählte Parameter in diesen hochkomplexen Systemen moduliert werden können.
In den letzten zehn Jahren wurden aus dem Tissue Engineering abgeleitete Prinzipien zur Erstellung von 3D-Gewebemodellen eingesetzt11,12. Diese beruhten meist auf der Verkapselung geweberelevanter Zellen in Biomaterialien, um 3D-Mono- oder Co-Kulturen zu etablieren13. Zu den am häufigsten verwendeten Biomaterialien gehören Fibrin14, Kollagen 15 und Matrigel16,17, die alle hochgradig biokompatibel sind und geeignete Bedingungen für das Wachstum vieler Zelltypen bieten. Diese Biomaterialien sind in der Lage, In-vitro-Modelle zu generieren, die Schlüsselaspekte der verschiedenen vaskulären Nischen in vivo rekapitulieren 18. Darüber hinaus hat die Verwendung von mikrofluidischen Geräten zur Erzeugung von perfundierten vaskulären Knochen- und Knochenmarkmodellen zur Erzeugung von In-vitro-Modellen höherer Komplexität beigetragen 19,20,21,22.
Die Schwierigkeit, die Zusammensetzung zu kontrollieren und die Eigenschaften natürlich vorkommender Biomaterialien zu beeinflussen, hat die Entwicklung synthetischer Analoga inspiriert, die rational mit vorhersagbaren physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften entworfen werden können23,24. Wir haben vollsynthetische, mit Faktor XIII (FXIII) vernetzte Hydrogele auf Basis von Poly(ethylenglykol) (PEG) entwickelt, die mit RGD-Peptiden und Matrix-Metalloproteasen (MMP)-Spaltstellen funktionalisiert sind, um die Zellanhaftung und den Zellumbau zu erleichtern25,26. Der modulare Aufbau dieser Biomaterialien wurde erfolgreich eingesetzt, um die Bedingungen für die Bildung von 3D-vaskularisiertem Knochen und Knochenmarkmodellen zu optimieren27,28.
Für die Erprobung einer größeren Anzahl unterschiedlicher Kulturbedingungen und neuer Therapeutika werden Modelle mit einer höheren Durchsatzfähigkeit benötigt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die FXIII-Vernetzung unseres PEG-Hydrogels durch einen elektrochemischen Prozess so gesteuert werden kann, dass ein tiefer Hydrogel-Steifigkeitsgradient gebildet wird29. Wenn Zellen auf solche Hydrogele aufgesetzt werden, wandern sie ins Innere und entwickeln sich allmählich zu hochgradig vernetzten zellulären3D-Netzwerken 30. Der Wegfall der Verkapselung von Zellen in das Hydrogel, die normalerweise bei anderen 3D-Gerüsten vorhanden ist, vereinfacht nicht nur das experimentelle Design, sondern ermöglicht auch die sequentielle Zugabe verschiedener Zelltypen zu verschiedenen Zeitpunkten, um komplexe Co-Kultursysteme zu erzeugen. Diese Hydrogele sind vorgegossen auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden erhältlich, wodurch die Etablierung von 3D-Kulturen sowohl durch manuelle als auch durch automatisierte Zellaussaatprotokolle möglich ist. Die optische Transparenz der PEG-Hydrogele macht die Plattform mit der Mikroskopie kompatibel.
Hier stellen wir eine einfache Methode zur Generierung und Charakterisierung vaskularisierter osteogener Nischen innerhalb dieser gebrauchsfertigen, synthetischen Plug-and-Play-Plattform vor. Wir zeigen, dass die Entwicklung vaskulärer Netzwerke mit einem Wachstumsfaktor stimuliert werden kann, der üblicherweise zur Induktion der in vitro Osteogenese verwendet wird, dem knochenmorphogenetischen Protein-2 (BMP-2), während die osteogene Differenzierung durch die Supplementierung von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) verhindert werden kann27,31. Die gebildeten Netzwerke unterscheiden sich im Vergleich zu FGF-2-stimulierten Netzwerken in Bezug auf das Gesamterscheinungsbild sowie die Zell- und EZM-Verteilung. Darüber hinaus wurde die osteogene Induktion mit Hilfe der alkalischen Phosphatase als Marker überwacht. Wir demonstrieren die erhöhte Expression dieses Markers über die Zeit und vergleichen die Expression mit der in FGF-2-stimulierten Netzwerken mit qualitativen und quantitativen Methoden. Abschließend zeigen wir die Eignung der generierten Nischen dieses Modells für zwei potentielle Anwendungen. Zunächst führten wir einen Proof-of-Concept-Test zur Arzneimittelsensitivität durch, indem wir Bevacizumab zu vorgeformten Nischen hinzufügten und den Abbau der vaskulären Netzwerke in seiner Gegenwart überwachten. Zweitens fügten wir MDA-MB-231 Brustkrebs- und U2OS-Osteosarkomzellen zu vorgeformten osteogenen Nischen hinzu, was zeigt, dass die Nischen genutzt werden können, um Interaktionen zwischen Krebszellen und ihrer Umgebung zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-methyl-1-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DProSeed hydrogel well plate</td>
			<td>Ectica Technologies</td>
			<td>ECT.PS1.001.096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin 1+2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated plate washer</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>EL&#967;50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated washer/dispenser</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bevacizumab</td>
			<td>Evidentic</td>
			<td>ID PS-E07-2019-00119 A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-02C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td>To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Stellaris 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>406406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (IST-9)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-59826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-HUVECs</td>
			<td>PELOBiotech</td>
			<td>PB-CAP-0001GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBM-MSCs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cell line</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Kindly obtained from J Massagu&#233; at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22571-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode imaging reader</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>Cytation 1</td>
			<td>For automated imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Artechemis</td>
			<td>US 040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-rhodamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picro-Sirius Red Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab246832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Collagen I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST BCIP/NBT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-25TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1064981000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS osteosarcoma cell line</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple establishment of a vascularized osteogenic bone marrow niche using pre-cast poly(ethylene glycol) (peg) hydrogels in an imaging microplate

Der Knochen und das Knochenmark sind stark vaskularisierte und strukturell komplexe Organe und Orte für Krebs- und Metastasenbildung. In-vitro-Modelle , die knochen- und knochenmarkspezifische Funktionen, einschließlich der Vaskularisierung, rekapitulieren, die mit dem Wirkstoffscreening kompatibel sind, sind sehr wünschenswert. Solche Modelle können die Lücke zwischen einfachen, strukturell irrelevanten zweidimensionalen (2D) In-vitro-Modellen und den teureren, ethisch anspruchsvollen In-vivo-Modellen schließen. Dieser Artikel beschreibt einen kontrollierbaren dreidimensionalen (3D) Co-Kultur-Assay auf Basis von technisch hergestellten Poly(ethylenglykol) (PEG)-Matrizen zur Erzeugung vaskularisierter, osteogener Knochenmarknischen. Das PEG-Matrix-Design ermöglicht die Entwicklung von 3D-Zellkulturen durch einen einfachen Zellaussaatschritt, der keine Verkapselung erfordert, und ermöglicht so die Entwicklung komplexer Co-Kultursysteme. Darüber hinaus sind die Matrizen transparent und auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden vorgegossen, wodurch das System für die Mikroskopie geeignet ist. Für den hier beschriebenen Assay werden zunächst humane mesenchymale Stromazellen (hBM-MSCs) aus dem Knochenmark kultiviert, bis sich ein ausreichend entwickeltes 3D-Zellnetzwerk gebildet hat. Anschließend werden GFP-exprimierende humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) hinzugefügt. Auf die Kulturentwicklung folgt die Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie. Das Vorhandensein des hBM-MSC-Netzwerks unterstützt die Bildung von gefäßähnlichen Strukturen, die sich sonst nicht bilden würden und die mindestens 7 Tage lang stabil bleiben. Das Ausmaß der vaskulären Netzwerkbildung lässt sich leicht quantifizieren. Dieses Modell kann auf eine osteogene Knochenmarksnische abgestimmt werden, indem das Nährmedium mit dem knochenmorphogenetischen Protein 2 (BMP-2) ergänzt wird, das die osteogene Differenzierung der hBM-MSCs fördert, was durch eine erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) an Tag 4 und Tag 7 der Kokultur beurteilt wird. Dieses zelluläre Modell kann als Plattform genutzt werden, um verschiedene Krebszellen zu kultivieren und zu untersuchen, wie sie mit knochen- und knochenmarkspezifischen Gefäßnischen interagieren. Darüber hinaus eignet es sich für die Automatisierung und High-Content-Analysen, was bedeutet, dass es das Screening von Krebsmedikamenten unter hochreproduzierbaren Kulturbedingungen ermöglichen würde.

The bone and bone marrow are structurally and functionally complex organs central to human health. This is reflected by the existence of distinct niches that regulate hematopoiesis and bone maintenance1. It is now widely accepted that in healthy bone marrow, the maintenance and expansion of hematopoietic and skeletal stem cells, as well as their progeny, are controlled by distinct niches. These niches comprise various cell types, including osteolineage cells, mesenchymal stem cells, endothelial and perivascular cells, neuronal and glial cells, adipocytes, osteoclasts, macrophages, and neutrophils2. Not surprisingly, these mostly vasculature-associated niches are also involved in the development of various types of leukemia3 and are the site of metastasis for different cancers4. Owing to its specific roles in bone formation, remodeling, and bone (marrow) maintenance, the bone-associated vasculature has distinct specialized structures different from the vasculature found elsewhere in the body5,6,7. Thus, anti-angiogenic or vasculature-modulating drugs applied systemically may have different effects within these specialized environments8. Therefore, models to investigate the molecular mechanisms involved in maintaining the bone and bone marrow physiological properties, bone and bone marrow regeneration, and responses to therapeutic treatments are highly desirable.
Classical two-dimensional (2D) tissue cultures and in vivo investigations using animal models have provided invaluable insight into the roles of different cells and molecular players involved in the development of bone and bone marrow9,10. Models that allow for high-throughput experiments with relevant human cells could improve our understanding of how to modulate selected parameters in these highly complex systems.
In the past decade, principles derived from tissue engineering have been employed to generate 3D tissue models11,12. These have mostly relied on the encapsulation of tissue-relevant cells into biomaterials to establish 3D mono- or co-cultures13. Among the most used biomaterials are fibrin14, collagen15, and Matrigel16,17, all of which are highly biocompatible and provide appropriate conditions for the growth of many cell types. These biomaterials have the ability to generate in vitro models that recapitulate key aspects of the different vascular niches found in vivo18. Moreover, the use of microfluidic devices to generate perfused vascular bone and bone marrow models has contributed to the generation of in vitro models of higher complexity19,20,21,22.
The difficulty in controlling the composition and engineering the properties of naturally occurring biomaterials has inspired the development of synthetic analogs that can be rationally designed with predictable physical, chemical, and biological properties23,24. We have developed fully synthetic factor XIII (FXIII) cross-linked poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels, which are functionalized with RGD peptides and matrix metalloprotease (MMP) cleavage sites to facilitate cell attachment and remodeling25,26. The modular design of these biomaterials has been successfully used to optimize conditions for the formation of 3D vascularized bone and bone marrow models27,28.
For the testing of larger numbers of different culture conditions and new therapeutics, models with a higher throughput capability are required. We have recently shown that the FXIII cross-linking of our PEG hydrogel can be controlled through an electrochemical process such that an in-depth hydrogel stiffness gradient is formed29. When cells are added on top of such hydrogels, they migrate toward the interior and gradually develop into highly interconnected 3D cellular networks30. The elimination of the need to encapsulate cells into the hydrogel, which is usually present with other 3D scaffolds, not only simplifies the experimental design but also allows the sequential addition of different cell types at different time points to generate complex co-culture systems. These hydrogels are available pre-cast onto glass-bottom 96-well imaging plates, thus making the establishment of 3D cultures achievable by manual as well as automated cell seeding protocols. The optical transparency of the PEG hydrogels renders the platform compatible with microscopy.
Here, we present a straightforward method for the generation and characterization of vascularized osteogenic niches within this&#160;ready-to-use, synthetic plug-and-play platform. We show that the development of vascular networks can be stimulated with a growth factor commonly used for inducing in vitro osteogenesis, bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), while osteogenic differentiation can be prevented by supplementation of fibroblast growth factor 2 (FGF-2)27,31. The networks formed are different when compared to FGF-2-stimulated networks in terms of the overall appearance, as well as the cell and ECM distribution. Moreover, we monitored the osteogenic induction using alkaline phosphatase as a marker. We demonstrate the increased expression of this marker over time and compare the expression to that in FGF-2 stimulated networks using qualitative and quantitative methods. Finally, we demonstrate the suitability of the generated niches of this model for two potential applications. Firstly, we performed a proof-of-concept drug sensitivity assay by adding bevacizumab to pre-formed niches and monitoring the degradation of the vascular networks in its presence. Secondly, we added MDA-MB-231 breast cancer and U2OS osteosarcoma cells to pre-formed osteogenic niches, showing that the niches can be used to study interactions between cancer cells and their environment.

Autor im Rampenlicht: Einfache Etablierung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarknische mit vorgegossenen Poly(ethylenglykol) (PEG)-Hydrogelen in einer bildgebenden Mikroplatte  

Einfache Etablierung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarksnische unter Verwendung von vorgegossenen Poly(ethylenglykol) (PEG)-Hydrogelen in einer bildgebenden Mikrotiterplatte

Most in vitro vascularization studies use naturally-derived matrices. While typically very conductive to biological processes, their inherent biological activity complicates the study of influences of single parameters. Here, we can selectively add our players of interest and assess how the system changes.The sequential seeding of cells on our blank slate synthetic hydrogels enables the formation of very defined niches. Here, hBMMSs colonize the hydrogels and deposit their inherent extracellular matrix. This provides the substrate for the subsequently seeded endothelial cells.This feature is not commonly found in other 3D in vitro models. The possibility to add different cell types sequentially allows for the creation of high-throughput compatible in vitro models with great complexity. These models can be adapted to generate more specific osteogenic vascularized niches and to investigate the functions of cellular and molecular players.

Vaskuläre Nischenkulturen wurden durch sequentielle Aussaat von hBM-MSCs und GFP-HUVECs auf vorgegossene PEG-basierte Hydrogele mit einem Steifigkeitsgradienten innerhalb einer 96-Well-Bildgebungsplatte etabliert (Abbildung 1). Die Kulturen wurden longitudinal mittels Live-Epifluoreszenzmikroskopie beobachtet und zu ausgewählten Zeitpunkten weiter charakterisiert. Das extrazelluläre Kompartiment wurde mittels direkter Farbfärbung und Antikörper-basierter Färbung beurteilt. Die ALP-Aktivität wurde nach der Entnahme und Lyse der Zellen aus den generierten Nischen quantifiziert. Darüber hinaus demonstrieren wir die Eignung dieser Plattform für anti-angiogene Wirkstoffsensitivitätsassays und als Grundlage für Krebs-Co-Kulturmodelle.
Kokulturen von hBM-MSCs und GFP-exprimierenden HUVECs wurden durch Aussaat von 3 x 104 Zellen/Well in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 bei 50 ng/ml hergestellt, wie im Protokoll beschrieben. Schon früh konnten Unterschiede zwischen den Kulturen sowohl aus den Hellfeld- als auch aus den Fluoreszenzbildern beobachtet werden, die nur die GFP-HUVECs zeigten (Abbildung 2A). Durch die Beobachtung der gleichen Gebiete im Längsschnitt konnten Unterschiede in der Entwicklung der Kulturen festgestellt werden, wie z.B. eine schnellere Entwicklung in Gegenwart von FGF-2. Im Allgemeinen schienen die Kulturen weniger entwickelt zu sein, da kein Wachstumsfaktor vorhanden war, wobei sich weniger Zellen beider Typen ausbreiteten und azelluläre Bereiche vorhanden waren. Im Gegensatz dazu zeigten die Hellfeldbilder die dichtesten Kulturen in Gegenwart von BMP-2. Allerdings bildeten sich vaskuläre Netzwerke sowohl unter Wachstumsfaktor-haltigen Bedingungen, als auch die umfangreichsten und miteinander verbundenen Netzwerke mit FGF-2. Diese beobachteten Unterschiede konnten auch mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ quantifiziert werden. In der Tat war die Gesamtlänge des Netzwerks in Gegenwart von FGF-2 am höchsten und in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren am niedrigsten (Abbildung 2B). Die Anzahl der Knoten, die Verzweigungspunkte in den Netzen anzeigen, folgte dem gleichen Trend wie die Gesamtlänge (Abbildung 2C). Umgekehrt wiesen beide Wachstumsfaktor-haltigen Bedingungen signifikant weniger isolierte Segmente auf, was auf eine höhere Interkonnektivität hindeutet, als die Bedingungen ohne Wachstumsfaktor (Abbildung 2D). Darüber hinaus zeigte die konfokale 3D-Bildgebung eine stärkere Penetration der Endothelzellen in Bezug auf die Tiefe in der FGF-2-stimulierten Bedingung (Abbildung 2E).
hBM-MSC/GFP-HUVEC-Kokulturen wurden 7 Tage lang in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 gehalten, bevor sie für ECM-Komponenten fixiert und gefärbt wurden. Immunzytochemische Färbungen mit anschließender konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie zeigten auffällige Unterschiede in der Kulturmorphologie in Abhängigkeit von der Art der Wachstumsfaktor-Supplementierung (Abbildung 3A). Mit FGF-2 war die Kultur in kondensierten mikrovaskulären Strukturen organisiert, die sowohl in Endothel- als auch in Mesenchymzellen dicht waren, während sich die hBM-MSCs in Gegenwart von BMP-2 über eine viel größere Fläche erstreckten, wie aus den ausgedehnteren F-Aktin-positiven und GFP-negativen Bereichen hervorgeht. Die EZM-Proteine Fibronektin und Kollagen I waren in ähnlicher Weise lokalisiert, während Laminin und Kollagen IV stärker um die Endothelstrukturen herum konzentriert waren. Diese erhöhte Konzentration um die Endothelstrukturen herum war jedoch in Gegenwart von FGF-2 viel stärker ausgeprägt als in Gegenwart von BMP-2. Zusätzlich zu den Antikörper-basierten Färbungen wurden direkte Farbfärbungen durchgeführt, um den fibrotischen Gesamtzustand der EZM zu beurteilen (Picrosirius-Rot-Färbung; Abbildung 3B) sowie die Abscheidung von Ca auf der ECM (Alizarinrot-Färbung; Abbildung 3C) der gebildeten Nischen. Die Picrosirius-Rot-Färbung war in den mit BMP-2 kultivierten Nischen stärker und umfangreicher, und die Alizarinrot-Färbung folgte dem gleichen Trend.
Anschließend wurden die Kulturen hinsichtlich ihres osteogenen Potenzials charakterisiert, indem die ALP-Aktivität als früher osteogener Marker bewertet wurde. An Tag 4 und Tag 7 der Co-Kultur wurden Zellen aus den Nischen gewonnen, indem die Hydrogele mit Trypsin verdaut wurden. Um die ALP-Aktivität zu quantifizieren, wurden die gewonnenen Zellen lysiert und ein pNPP-Assay durchgeführt. Die erhaltenen Werte wurden gegen die Gesamt-DNA für jede Probe normalisiert, um mögliche Unterschiede in der Zellzahl zwischen den Bedingungen zu berücksichtigen. In der Tat konnten kleine Unterschiede zwischen dem DNA-Gehalt der Erkrankungen beobachtet werden, und die wenigsten Zellen wurden ohne Wachstumsfaktor aus der Erkrankung gewonnen (nicht gezeigt). Die normalisierte ALP-Aktivität variierte jedoch stark zwischen den Bedingungen, mit einem Trend steigender Aktivität mit höheren Konzentrationen von BMP-2 und einem Plateau bei 100 ng/ml (Abbildung 4A,B). Die niedrigsten Aktivitätswerte wurden für die Erkrankung mit 50 ng/ml FGF-2 identifiziert. Während für beide untersuchten Zeitpunkte ähnliche Trends beobachtet werden konnten, stiegen alle Werte im Laufe der Zeit in der Kultur von Tag 4 bis Tag 7 signifikant an. Zusätzlich zum quantitativen Assay konnte die ALP-Aktivität durch direkte Farbfärbung auf Basis der BCIP/NBT-Substratkonversion qualitativ visualisiert werden. In Gegenwart von BMP-2 wurde eine umfangreichere und intensivere violette Färbung im Vergleich zu FGF-2 beobachtet (Abbildung 4C).
Um zwei potentielle Anwendungen der charakterisierten osteogenen Nischen zu demonstrieren, wurden eine Proof-of-Concept-Wirkstoffsensitivitätsstudie und Krebs-Co-Kulturen durchgeführt. Für den Wirkstoffsensitivitätstest wurde Bevacizumab oder eine Kontrolllösung, bestehend aus dem Verdünnungsmittel der Bevacizumab-Formulierung, dem Nährmedium, das frisches BMP-2 enthielt, zugesetzt. An Tag 4, an dem etablierte Netzwerke in Gegenwart von 50 ng/ml BMP-2 gebildet wurden, wurde während des regulären Mediumwechsels entweder die Kontrolllösung oder das Bevacizumab-haltige Medium zugegeben und die Kulturen mittels Fluoreszenzbildgebung überwacht. Die Zugabe von 10 μg/ml Bevacizumab führte zur Retraktion bzw. Ablation des zuvor gebildeten Netzwerks, während die Kontrollbedingung 2 Tage nach dem Mediumwechsel noch ausgedehnte Netzwerke aufwies (Abbildung 5A,B). Diese Veränderungen konnten auch quantifiziert werden, indem die Gesamtlänge der Netzwerke mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ auf täglich aufgenommenen Fluoreszenzbildern verfolgt wurde (Abbildung 5C). Alternativ könnte auch Bevacizumab oder eine andere Verbindung von Beginn der Co-Kultur an hinzugefügt werden, um ihren Einfluss auf die Bildung der Netzwerke zu beurteilen. Im Falle von Bevacizumab hemmte dies die Bildung von Endothelnetzwerken vollständig (nicht dargestellt).
Für die zweite Anwendung wurden MDA-MB-231 Brustkrebs- oder U2OS-Osteosarkomzellen in Tag-4-Kokulturen mit einer Dichte von 1,5 x 103 Zellen/Well in frischem Nährmedium mit 50 ng/ml BMP-2 hinzugefügt. Um sie von den GFP-markierten HUVECs und den nicht-markierten hBM-MSCs zu unterscheiden, wurden die Krebszellen kurz vor der Aussaat in die osteogenen Nischen mit CellTrace FarRed inkubiert. Die Kulturen wurden fluoreszenzmikroskopisch überwacht; Zu Beginn lokalisierten sich die meisten Krebszellen in der Nähe der Oberfläche des Substrats, aber nach 2 Tagen konnten sie in größerer Nähe zu den Schichten gefunden werden, die die vaskulären Kokulturen enthielten. Daher wurde Tag 2 als Ausgangspunkt für die Zeitraffermikroskopie gewählt, um die Dynamik der Interaktionen zwischen den Krebszellen und den Zellen innerhalb der vaskulären Nische zu zeigen. Interessanterweise konnte man beobachten, wie sich die MDA-MB-231-Zellen sowohl Endothelstrukturen näherten als auch von ihnen entfernten und daher möglicherweise ihre Umgebung sondierten oder umbauten (Abbildung 5D). Mit CellTrace FarRed als Markierung für die Krebszellen, GFP als Markierung für HUVECs und zusätzlicher Färbung für F-Aktin konnten alle Zelltypen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie unterschieden werden (Abbildung 5E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig01.jpg"> Abbildung 1: Ein einfacher Ansatz zur zuverlässigen Generierung vaskularisierter, osteogener Nischen. Vorgegossene synthetische Hydrogele mit einem tiefen Steifigkeitsgradienten ermöglichen die Erzeugung von 3D-Kulturen durch sequentielles Zellseeding, ohne dass eine direkte Verkapselung erforderlich ist. hBM-MSCs werden 3 Tage lang vorkultiviert, bevor GFP-exprimierende HUVECs hinzugefügt werden. Die Kulturen werden durch die Erfassung von Hellfeld- und GFP-Signalen longitudinal überwacht. Zu ausgewählten Zeitpunkten werden die Nischen weiter auf ihre ECM-Ablagerung und ihren osteogenen Zustand untersucht. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird durch direkte Farbfärbung und durch die Entnahme von Zellen aus den Nischen und die Durchführung eines pNPP-Assays an den Zelllysaten bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig02.jpg"> Abbildung 2: Stimulation vaskulärer Netzwerke mit FGF-2 oder BMP-2. (A) Hellfeld- und Fluoreszenzbilder (GFP) wurden an Tag 2, Tag 4 und Tag 6 der Co-Kultur von Zellen aufgenommen, die in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 gezüchtet wurden, beide bei 50 ng/ml. Maßstabsbalken: 400 μm. (B-D) Quantifizierte Parameter der GFP-HUVEC-Netzwerke, die an Tag 4 der Co-Kultur abgebildet wurden, analysiert mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.5.1 durchgeführt. Eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest wurde mit n ≥ 4 durchgeführt; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Dreidimensionale Rekonstruktionen, die aus konfokalen Stacks (Gesamthöhe: 547,5 μm; z-Schritt: 2,5 μm) der GFP- und F-Aktin-Signale für die FGF-2- (obere Reihe) und BMP-2- (untere Reihe) stimulierten Bedingungen generiert wurden. Maßstabsbalken: 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig03.jpg"> Abbildung 3: Induktion der delokalisierten hBM-MSC-Ausbreitung und ECM-Ablagerung durch BMP-2. (A-C) Die 7-tägigen Co-Kulturen, die entweder in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 gezüchtet wurden, wurden (A) Immunfluoreszenz oder (B,C) direkter Farbfärbung unterzogen. (A) Die Kulturen wurden für F-Aktin und die ECM-Proteine Fibronektin, Laminin, Kollagen I und Kollagen IV gefärbt. Die Bilder zeigen die maximalen Intensitätsprojektionen der konfokalen Stacks (Gesamthöhe: 100 μm; z-Schritt: 5 μm). Maßstabsbalken: 200 μm. (B,C) Die Kulturen wurden mit (B) Picrosiriusrot und (C) Alizarinrot gefärbt. Die obere Reihe zeigt zusammengefügte Gesamtüberblicke der Bilder, die mit 2,5-facher Vergrößerung aufgenommen wurden (Maßstabsleiste: 1.000 μm), während die untere Reihe ein Sichtfeld darstellt, das mit 5-facher Vergrößerung aufgenommen wurde (Maßstabsleiste: 400 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig04.jpg"> Abbildung 4: Biochemische Bewertung der BMP-2-induzierten ALP-Aktivität durch direkte Farbfärbung. (A,B) Die ALP-Aktivität wurde in den Zelllysaten von Kulturen bestimmt, die in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder in Gegenwart von BMP-2 in unterschiedlichen Konzentrationen oder FGF-2 in 50 ng/ml für (A) 4 Tage oder (B) 7 Tage Co-Kultur. Die ALP-Aktivität wird normalisiert auf den DNA-Gehalt jeder Lysatprobe dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.5.1 durchgeführt. Eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest wurde mit n = 5 durchgeführt; P < 0,0001. (C) Direkte Farbfärbung der ALP-Aktivität in Nischen, die in Gegenwart von 50 ng/ml FGF-2 oder BMP-2 für 7 Tage Co-Kultur gezüchtet wurden. Die Bilder auf der linken Seite zeigen zusammengesetzte Gesamtgutübersichten von Bildern, die mit 2,5-facher Vergrößerung (Maßstab: 1.000 μm) aufgenommen wurden, während die Bilder auf der rechten Seite ein Sichtfeld darstellen, das mit 5-facher Vergrößerung aufgenommen wurde (Maßstab: 400 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig05.jpg"> Abbildung 5: Einsatz osteogener, vaskularisierter Nischen in fortgeschrittenen Krebsmodellen. (A) Die GFP-Signale von Kulturen, die in Gegenwart von BMP-2 gezüchtet wurden, wurden an Tag 4 der Co-Kultur abgebildet, bevor eine Kontrolllösung (links) oder Bevacizumab mit 10 μg/ml (rechts) für 2 Tage hinzugefügt wurde, danach wurden die Kulturen erneut abgebildet (Tag 6 der Co-Kultur). Maßstabsbalken: 600 μm. (B) Bilder mit höherer Vergrößerung der mit Bevacizumab behandelten Kulturen sind in A dargestellt. Maßstab: 250 μm. (C) Die Gesamtlänge der Endothelnetzwerke, wie in A gezeigt, wurde mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ aus täglich aufgenommenen Bildern quantifiziert; Nr. ≥ 3. (D) CellTrace FarRed-markierte MDA-MB-231-Brustkrebszellen wurden zu den 4-tägigen Kokulturen hinzugefügt, die in Gegenwart von BMP-2 gezüchtet wurden, und es wurden Zeitrafferbilder ab 2 Tage nach der Zugabe der Krebszellen aufgenommen. Maßstabsbalken: 100 μm. (E) Maximale Intensitätsprojektionen von konfokalen Stapeln (Gesamthöhe: 70 μm; z-Schritt: 2,4 μm) von Dreifach-Kokulturen, die wie in D beschrieben erzeugt und für F-Aktin fixiert und gefärbt wurden. Links: Nischen mit MDA-MB-231 Brustkrebszellen; rechts: Nischen mit U2OS-Osteosarkomzellen. Maßstabsbalken für Bilder links: 200 μm; Maßstabsbalken für Bilder rechts: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Ein In-vitro-Modell der Gefäßnische des Knochenmarks wird erstellt, indem mesenchymale und endotheliale Zellen auf vorgegossene 3D-PEG-Hydrogele gesät werden. Die endothelialen Netzwerke, die EZM-Komponenten und die ALP-Aktivität der Nischen variieren je nach verwendetem Wachstumsfaktor. Die Plattform kann für fortgeschrittene Krebsmodelle verwendet werden.

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models ...

Die meisten In-vitro-Vaskularisierungsstudien verwenden natürlich gewonnene Matrices. Obwohl sie in der Regel sehr leitfähig für biologische Prozesse sind, erschwert ihre inhärente biologische Aktivität die Untersuchung der Einflüsse einzelner Parameter. Hier können wir selektiv unsere interessierenden Spieler hinzufügen und beurteilen, wie sich das System verändert.Die sequentielle Aussaat von Zellen auf unseren synthetischen Hydrogelen mit blankem Schiefer ermöglicht die Bildung sehr definierter Nischen. Hier besiedeln hBMMSs die Hydrogele und lagern ihre inhärente extrazelluläre Matrix ab. Dies liefert das Substrat für die später ausgesäten Endothelzellen.Diese Funktion ist in anderen 3D-In-vitro-Modellen nicht üblich. Die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen sequentiell hinzuzufügen, ermöglicht die Erstellung von Hochdurchsatz-kompatiblen In-vitro-Modellen mit großer Komplexität. Diese Modelle können angepasst werden, um spezifischere osteogene vaskularisierte Nischen zu generieren und die Funktionen zellulärer und molekularer Akteure zu untersuchen.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate

1.1K Aufrufe.  University Hospital Zurich, University of Zurich. Die meisten In-vitro-Vaskularisierungsstudien verwenden natürlich gewonnene Matrices. Obwohl sie in der Regel sehr leitfähig für biologische Prozesse sind, erschwert ihre inhärente biologische Aktivität die Untersuchung der Einflüsse einzelner Parameter. Hier können wir selektiv unsere interessierenden Spieler hinzufügen und beurteilen, wie sich das System verändert.Die sequentielle Aussaat von Zellen auf unseren synthetischen Hydrogelen mit blankem Schiefer ermöglicht die Bi...

Serie: Autor im Rampenlicht: Einfache Etablierung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarknische mit vorgegossenen Poly(ethylenglykol) (PEG)-Hydrogelen in einer bildgebenden Mikroplatte  

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models recapitulating bone- and bone marrow-specific functions, including vascularization, that are compatible with drug screening are highly desirable. Such models can bridge the gap between simplistic, structurally irrelevant two-dimensional (2D) in vitro models and the more expensive, ethically challenging in vivo models. This article describes a controllable three-dimensional (3D) co-culture assay based on engineered poly(ethylene glycol) (PEG) matrices for the generation of vascularized, osteogenic bone-marrow niches. The PEG matrix design allows the development of 3D cell cultures through a simple cell seeding step requiring no encapsulation, thus enabling the development of complex co-culture systems. Furthermore, the matrices are transparent and pre-cast onto glass-bottom 96-well imaging plates, rendering the system suitable for microscopy. For the assay described here, human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (hBM-MSCs) are cultured first until a sufficiently developed 3D cell network is formed. Subsequently, GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are added. The culture development is followed by bright-field and fluorescence microscopy. The presence of the hBM-MSC network supports the formation of vascular-like structures that otherwise&#160;would not form and that remain stable for at least 7 days. The extent of vascular-like network formation can easily be quantified. This model can be tuned toward an osteogenic bone-marrow niche by supplementing the culture medium with bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), which promotes the osteogenic differentiation of the hBM-MSCs, as assessed by increased alkaline phosphatase (ALP) activity at day 4 and day 7 of co-culture. This cellular model can be used as a platform for culturing various cancer cells and studying how they interact with bone- and bone marrow-specific vascular niches. Moreover, it is suitable for automation and high-content analyses, meaning it would enable cancer drug screening under highly reproducible culture conditions.

An in vitro model of the bone marrow vascular niche is established by seeding mesenchymal and endothelial cells onto pre-cast 3D PEG hydrogels. The endothelial networks, ECM components, and ALP activity of the niches vary depending on the growth factor used. The platform can be used for advanced cancer models.

Forschung

Biotechnik

Establishing the 3D Stromal Monoculture

To begin, take a tube of hBM-MSCs and pellet them by centrifugation. Discard the supernatant and resuspend the pellet in an appropriate volume of basal medium. Then, prepare 50 milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors.Finally, add the hBM-MSCs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per milliliter. Remove the polypropylene adhesive film covering the 96 well hydrogel plate to seed the plate. Carefully aspirate the storage buffer covering the hydrogels by positioning the aspirator tip against the wall of the well and slowly moving toward the edge of the inner well.While seeding, mix the cell suspension periodically to keep the mixture homogenous and add 200 microliters of the cell suspension to each well of the plate. Then, maintain the cultures at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere. Alternatively, use an automated plate washer with the aspiration nozzles set at least 3.8 millimeters from the plate carrier and toward the edge of the well and aspirate the storage buffer.Seed the plate by mixing the cells with a serological pipette and dispensing equal numbers of cells to the well of the plate. Monitor the development of the cultures by Bright-field microscopy with a five times objective and acquire reference images approximately 30 minutes after seeding to evaluate the number of cells added.

Etablierung der 3D-Stroma-Monokultur

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

Etablierung der 3D-Stromal-Endothelzell-Kokultur

Quantifying the Endothelial Cell Network Formation After the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

After establishing the stromal endothelial cell co-culture, acquire the GFP signal from the GFP huvec using fluorescence microscopy with settings suitable for quantification. Pre-process all the images acquired on the same day to further enhance the contrast. If using fiji or image J open all the enhanced GFP channel images at the same time point and open the brightness and contrast menu.Select an image representing an intermediate condition and auto adjust the contrast by selecting auto. Click set and check propagate to all other open images. Visually assess whether the automatically selected range fits all the images of the current time point.If needed, manually readjust and repropagate the range to all the images and save the adjusted images as TIFF files. Next, apply a median blur filter to all the images. Reduce the size by binning and save them as gray scale RGB color TIFF files in a folder for quantification.This could be done manually or in batch mode using macros. Analyze all the created images using the batch process mode in the angiogenesis analyzer for image J.Then validate the quantification results by examining the overlays of the recognized structures and the original images. Adjust pre-processing parameters, reanalyze original images, or exclude problematic areas if the algorithm detects artificial structures with few or no cells visible in the original image.Finally normalize the obtained values to an area of one square millimeter by multiplying the values of each sample by the ratio of the analyzed area to one square millimeter. Quantified parameters of the GFP huvec networks showed that the total network length was highest in the presence of FGF-2 and lowest in the absence of growth factors. The number of junctions indicating branching points in the networks followed the same trend as the total length.Conversely, both growth factors featured significantly fewer isolated segments indicating higher interconnectivity than the condition without any growth factor.

Quantifizierung der Bildung von Endothelzellnetzwerken nach der 3D-Stroma-Endothelzell-Kokultur

Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal-Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity

To begin, take the hBM-MSCs and GFP-HUVECs co-culture and wash once with 200 microliters per well of PBS. Add the BCIP/NBT substrate solution and incubate the cultures at 37 degrees Celsius while periodically monitoring the color development. Once the color develops in non-osteogenic conditions, immediately washed with 200 microliters per well of PBS.After fixing the samples in 4%paraformaldehyde, acquire color images of the stained samples. To quantify the ALP activity in cell lysates, add 200 microliters per well of 0.25%Trypsin-EDTA to the cultures washed with PBS and incubate at 37 degrees Celsius. Agitate the cultures every 10 minutes by vigorously pipetting up and down to facilitate digestion and monitor the culture morphology with a standard cell culture microscope.Then transfer the samples to 2-milliliter tubes and add 200 microliters of mesenchymal stem cell basal medium to inhibit the Trypsin. After centrifusing and discarding the supernatant, freeze the pellets at 80 degrees Celsius or proceed directly to the next step. Thaw the cell pellets, add 500 microliters of lysis buffer, and incubate for 30 minutes on ice.Next centrifuge at 16, 100 G for 10 minutes at four degrees Celsius and keep the samples on ice. Without disturbing any pelleted debris, dispense 50 microliters of the supernatant into each well of a transparent tissue culture 96-well plate in duplicates. Add 50 microliters of the prepared alkaline phosphatase reagent to the wells of the 96-well tissue culture plate.Shake the plate briefly and incubate it at 37 degrees Celsius for 10 minutes protected from light. Stop the reaction by adding 100 microliters of 1-molar sodium hydroxide using a multi-channel pipette. Using a plate reader, read the optical density at 410 nanometers.For DNA quantification, thaw the frozen samples, centrifuge them, and place them on ice. Without disturbing any pelleted debris, dispense 50 microliters of the cell lysate supernatant into the wells of a black 96-well plate in duplicates. Add the DNA standards in duplicates.Next, use a multi-channel pipette to add 50 microliters of the DNA staining agent, then incubate and read the fluorescence intensity according to the manufacturer's instructions. Utilize the standard curve values to determine and apply the conversion of the measured intensity values to the DNA concentrations. Finally, normalize the alkaline phosphatase values by dividing them by the respective DNA concentration of each sample.Quantification of alkaline phosphatase activity to characterize the osteogenic potential of the cultures showed that the normalized alkaline phosphatase activity varied greatly across conditions with a trend of increasing activity with higher concentrations of BMP-2 and a plateau at 100 nanograms per milliliter. The lowest activity levels were identified for the condition containing 50 nanograms per milliliter FGF-2. More extensive and intense purple staining was observed in the presence of BMP-2 as compared to FGF-2.