Wir möchten die Mitglieder des Mari-Labor und das Labor Godenschwege, insbesondere Aline Yonezawa anerkennen, für Kommentare und helfen mit diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde vom National Institute for Neurological Disorders and Stroke Zuschuss R21NS06637 von UKW-und TAG finanziert werden; AB wurde von der National Science Foundation Award Nummer 082925, URM finanziert: Integrative Biologie für zukünftige Forscher.

1. Elektrophysiologie Rig Set-up <ol><li> Die erforderliche Ausrüstung für die Elektrophysiologie Rig Set-up wird im Detail von Augustin et al. in diesem Journal 14. Bitte beachten Sie in diesem Artikel für eine detaillierte Erklärung der elektrophysiologischen Geräte benötigt. </li><li> Ändern Sie den zuvor beschriebenen Elektrophysiologie Rig Set-up 14 durch das Hinzufügen eines sechsten Mikromanipulator, der die nanoinjector hält. Für einen einfachen Zugriff auf den Kopf des Tieres sie zwischen den beiden Stimulationselektrode Mikromanipulatoren platziert werden soll, wie in 2 gezeigt. </li><li> Vor dem Versuch, sicherzustellen, dass Sie einen komfortablen Bereich auf allen Drehachsen mit allen Mikromanipulatoren haben, und dass alle Elektroden sowie die Injektion Mikropipette (siehe Schritt 2) kann das Tier zu erreichen. </li></ol> 2. Nanoinjection Set-up <ol><li> Die nanoinjection Set-up erfordert ein Nanoliter2000 (World Präzisiauf Instruments, Sarasota, FL, USA) oder eine ähnliche Art von Injektor, der kontrollierte Injektionen können in Nanolitermengen. </li><li> Planen Injektionsnadel mit den Glas-Mikropipetten mit dem Injektor, indem man sie auf einen Widerstand von 80-100 MOhm mit einer Elektrode Abzieher zugeführt. </li><li> Für einen reibungslosen Injektionen ist es erforderlich, die Fase Mikropipetten zu einer Öffnung am 17.11 um einem 45 Grad Winkel (Abbildung 3). </li><li> Langsam verfüllen die Injektion Mikropipette mit synthetischem Öl mit einer Hamilton-Spritze, wie durch die manuelle Nanoliter2000 angewiesen, sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Sorgfältig sichern die Mikropipette auf dem nanoinjector und bereiten Sie es, die Verbindung durch das Entleeren überschüssiges Öl als durch die manuelle Nanoliter2000 angewiesen zu laden. </li><li> Setzen Sie den Injektor auf dem Mikromanipulator und laden Sie die Verbindung wie in der Anleitung beschrieben Nanoliter2000. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Mikropipette nicht während dieser brechenVerfahren. </li><li> Die gewünschte Menge von in Nanoliter des Injektors Steuergerät injiziert werden, durch die Nanoliter2000 Handbuch beschrieben. Bitte beachten Sie, dass der Gesamtbetrag injizierten sollte nicht mehr als 100 nl. Wir fanden, dass größere Mengen an Kochsalz-Control-Lösungen kann die Funktion des GFS-Schaltung auswirken. </li><li> Es ist wichtig, damit der Injektor von der Steuereinheit während der Aufnahme Übernahme unplugged mit Ausnahme der Injektion selbst, da die Stromversorgung des nanoinjector stört die Aufnahmen, die sichtbar als Hintergrundrauschen (4) ist. Jedoch nicht die Stromversorgung unterbrechen, um die Steuereinheit wie es neu eingestellt wird. </li></ol> 3. Drosophila melanogaster Vorbereitung <ol><li> Anesthetize 2 bis 6 Tage alten Fliegen mit CO 2 oder auf Eis, wie vorher beschrieben 14,15. </li><li> Sobald unbeweglich, verwenden Sie eine Pinzette, um das Tier zu einer kleinen Platte übertragen with weichen Dentalwachs, indem man es von seinen Beinen. Bitte beachten Sie, dass ein männlicher Fruchtfliegen etwa 1,0 mg wiegt und eine weibliche Fruchtfliege wiegt etwa 1,2 mg, also Verbindung-zu-Körpergewicht-Verhältnis ist anders im Vergleich zu männlichen weibliche Fliegen. Daher ist es empfehlenswert, nur ein Geschlecht für die Experimente verwendet. </li><li> Wie bereits beschrieben, 14,15, vorsichtig montieren die Fliege Rückenseite nach oben und sicherzustellen, dass der Brustkorb und Kopf mit weichen Dentalwachs um den Körper gelegt werden immobilisiert. Sorgfältig breitete die Flügel aus, so dass sie senkrecht zu legen, um den Thorax (Abb. 2, C). Die Fliege sollte mit so wenig Schaden wie möglich montiert werden. </li></ol> 4. Gepaart Nanoinjection / Elektrophysiologie <ol><li> Stellen Sie das montierte Fliege an der Elektrophysiologie Rigg mit seinem Kopf in Richtung der stimulierenden Elektroden. </li><li> Aufspießen, das Tier mit dem entsprechenden anregende, Boden-und Aufzeichnungs-Elektroden wie zuvor 14,15 (F beschriebenbbildung 2, C). Wenn nicht anders gewünscht, erfolgt eine Aufnahme Elektrode in die DLM und die andere in die TTM Muskel. Das DLM-Muskel im Brustkorb zwischen den vorderen Dorso-Central Haare und der Mittellinie des Fliege befindet. Die TTM Muskel wird in der Nähe der Flügel-Anhänge, zwischen den hinteren und vorderen Supra-Alar Haare der Fliege 7. </li><li> Richten der Injektion Mikropipette, die die Verbindung mit dem Zentrum der drei Augenflecken auf der medialen hinteren Teil des Kopfes liegt, aber noch nicht zu injizieren (Abb. 2, C). </li><li> Vor der Verbindung Injektion erhalten eine Grundlinie Aufzeichnung des GF zu TTM und GF, Wege des Riesen Fiber System (GFS, Abbildung 1) über Hirnstimulation DLM. Dazu aktivieren Sie die Riesen-Fibers (GF) mit 10 Zügen von 10 Stimuli (40-50 mV) jeweils für eine Dauer von 0,03 ms bei 100 Hz gegeben mit einem 1-Sekunden-Verzögerung zwischen den Zügen 14,15 (Abbildung 4). Wildtyp fliegt shOuld der Lage sein, eins-zu-eins in diesem Tempo folgen der Anregung sowohl für DLM und TTM Wege. Entsorgen Sie die Fliege, wenn der GF zu DLM und GF zu TTM Wege nicht folgen, die 100-Hz-Stimulation im Verhältnis 1:1. </li><li> Wechseln zu kontinuierliche Stimulation des GF mit einzelnen Pulsen bei 1 Hz (Abbildung 4). </li><li> Schnell stecken Sie den Injektor in das Steuergerät. Auch wenn Hintergrundgeräusche werden mit den 1-Hz-Stimulation Aufnahmen stören, nicht abbrechen. </li><li> Vorsichtig die Injektion Mikropipette in die Kopfkapsel der Fliege direkt unter der Kutikula und injiziert die gewünschte Menge der Verbindung in die Hämolymphe der Fliege, während die 1 Hz Stimulation (Abbildung 4). Aufgrund der offenen Kreislaufsystem der Fliege, wird das gesamte Nervensystem zu der Verbindung innerhalb weniger Sekunden belichtet werden. Obwohl ein bestimmter Injektionsstelle ist nicht kritisch für Verbindungen in die Hämolymphe liefern, finden wir in den Bereich der Augenflecken, die sich lokalisierend medialen am meisten dorsalen Seite des Kopfes Kapsel, eine geeignete Stellen, die für eine einfache Injektion, die eine schnelle und gleichmäßige Verteilung der Verbindung führt ermöglicht werden. </li><li> Unverzüglich entfernen Injektion Mikropipette aus der Injektionsstelle und ziehen Sie den Injektor aus dem Schaltkasten während der Fortsetzung des 1 Hz GF Stimulation bis zu 1 Min. nach der Injektion (Abb. 4). </li><li> Um subtilere Effekte von Verbindungen auf der GFS zeigen, betonen die Giant Fibers (GF) mit 10 Zügen von 10 Stimuli bei 100 Hz mit einer Verzögerung von 1 Sekunde zwischen den Zügen. Fortfahren, um die Funktion der GF Wege zu diesem Paradigma alle 5 Minuten bis zu 15 Minuten (4) zu testen. Allerdings sind kürzere Intervalle oder längere Überwachungszeiträume ebenfalls möglich. </li><li> Um zu testen, ob die Verbindung eine Wirkung an der neuromuskulären Endplatten (NMJ) der GFS hat, und möglicherweise verengen die Wirkungen der Verbindung, fahren Sie mit den Motoneuronen Richtungen aktivierenTLY von Brust-Stimulation. Dazu entfernen Sie die stimulierenden Elektroden aus den Augen und ersetzen Sie sie auf den vorderen Seiten des Thorax, um die motorischen Neuronen mit 10 von 10 Zügen Reize stimulieren bei 100 Hz. </li></ol> Hinweis: Die Elektrophysiologie Spuren in dem Video gezeigt werden, sind nicht auf die Wirkungen von reinem Farbstoffinjektion entsprechen. 5. Repräsentative Ergebnisse Wirkung eines Antagonisten am PSI zur Synapse des Riesen Fiber System DLM Methyllycaconitine Citrat (MLA) ist ein nAChR-Antagonisten, die spezifisch für α7 nAChR-Subtypen ist. Die PSI zu Synapse in der GF-DLM Weg DLMn ist abhängig von der Dα7 nAChR-Subtyp für die ordnungsgemäße Funktion, während die genetische Entfernung von Dα7 nAChR-Subtyp hat keine Auswirkung auf die GF-Weg TTM 5,6. Um die Spezifität und Sensitivität unserer Test zeigen wir, injiziert MLA in unterschiedlichen Konzentrationen (0, 0,02, 0,04, 0.08, injiziert 0,12 ng / mg, 46 nl) in den Kopf des Tieres (n = 10 pro Verbindung Behandlung, n = 15 für Kochsalzlösung Behandlung). Nur männlichen Fliegen (des Wildtyp-Genotyp Wildtyp 10E) verwendet wurden, und die Wirkung der Verbindung wurde für insgesamt 15 Minuten nach der Injektion überwacht. Abbildung 5 zeigt den Unterschied zwischen Baseline-Aufnahmen vor der Injektion erhalten und diese nach der Injektion in Reaktion auf MLA und Kochsalzlösung Control-Lösung erhalten. Wir fanden, dass die Injektion von MLA resultierte in der Unfähigkeit der GF-DLM Weg zum Eins-zu-eins bei 100 Hz folgen durch Reize der GfS im Gehirn während der GF-TTM Weg unbeeinflusst blieb. (Abbildung 5, Top-und mittleren Spur, t-Test zwischen Kochsalzlösung bei den Kontrollen [0 ng / mg] und den verschiedenen Konzentrationen von MLA zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden, es sei denn die Daten sind nicht-parametrische [Normalität und gleiche Varianzen getestet], da wir sonst verwenden ein Mann-Whitney-Rangsummentest. * p &lt;0,001). Jedoch eine Eins-zu-Eins-response des DLM wurde beobachtet, wenn die motorischen Neurone wurden direkt (Abbildung 5, untere Kurve) stimuliert, die belegen, dass die NMJ Funktion des DLM und TTM nicht durch MLA betroffen. MLA erschien auf seine maximale Wirkung 1 Minute nach der Injektion zu erreichen für 0,04, 0,08 und 0,12 ng / mg MLA injiziert, da keine weiteren signifikanten Veränderungen während der folgenden 15 Minuten der Testphase festgestellt wurden. Darüber hinaus erreicht die Verbindung eine maximale Wirkung bei 0,08 ng / mg seit stärkere Reaktionen wurden nicht mit der höheren Dosierung von 0,12 ng / mg beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Der Riese Fiber System Diagram of the Giant Fiber System (GFS). The Giant Fibers (GFS, in rot dargestellt) elektrisch Synapse (Gap Junctions) sowie chemisch (cholinergen) auf eine periphere Synapsing Interneuron (PSI, in grün dargestellt) und die Tergo Trochanteral Muscle Neuron (TTMn, gelb dargestellt) 5. Die PSIch DLMn (Dorsal Längsmuskulatur Neuron, in blau dargestellt) Verbindung ist abhängig von Dα7 nAChR-Subtyp 6. Schließlich wird der neuromuskulären Synapse (NMJ) des TTMn und der DLMn auf dem Sprung (TTM, dargestellt in lila) und Flugmuskeln (DLM, dargestellt in lila) ist Glutamat. Hinweis: Die GF zu PSI-Verbindung ist sowohl elektrische und chemische. In shakB Mutanten (die Gap Junctions fehlt), kann keine Antwort von der DLM bei der Stimulation des GF im Gehirn aufgenommen werden, zeigt, daß die chemische Komponente in Abwesenheit von elektrischen Verbindungen nicht ausreicht, um ein Aktionspotential in der hervorzurufen PSI 5,16-18. Weil der GF zu PSI-Verbindung ist abhängig von Gap Junction zeigt diese Figur nur den Gap Junction an der Synapse der Einfachheit halber. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Mikromanipulatoren set-up. <ol class="ualpha"><li> Eine modifizierte Set-up eines zuvor veröffentlichten Protokoll 14 wird verwendet, um die Injektion Mikromanipulator für gepaarte GFS-Aufnahmen mit gleichzeitiger nanoinjections passen. Die Zubereitung ist montiert Fliege mit dem Kopf der Fliege auf den Experimentator orientiert. Die Injektion Mikromanipulator (# 1) wird vor dem Experimentator zwischen den beiden Manipulatoren für die Wolfram-stimulierenden Elektroden (2 # und # 3) angeordnet ist. Die beiden Mikromanipulatoren für die Glas-Aufzeichnungselektroden (# 4 und # 5) auf der linken und rechten Seite angeordnet ist, jeweils. Der Mikromanipulator der Wolfram-Masseelektrode (# 6) angeordnet weitesten entweder auf der linken Seite (hier gezeigt) oder auf der rechten Seite in den Rücken. </li><li> Eine Nahaufnahme von der Spitze der Regelungen der verschiedenen Elektroden und Injektion Mikropipette. </li><li> Ein richtig montiert D. melanogaster aufgespießt mit Elektroden und Injektion Mikropipette bereit zur Injektion. Beachten Sie, dass der Körper des Tieresist mit seinen Brustkorb horizontal und mit den Flügeln montiert ausbreiten. Das Wachs wird fest um seinen Körper gewickelt zu verhindern, das Tier bewegt. Zusätzlich kann die Masseelektrode (Nr. 6, im Abdomen), die Glas Aufzeichnungselektroden (# 4 und # 5, des Thorax, durch dunkle Linien markiert), und die Stimulationselektroden (# 2 und # 3, einem für jedes Auge ) an ihrem Platz aufgespießt, wie zuvor 14 beschrieben. Die Injektion Mikropipette (# 1) ordnungsgemäß mit der Mitte der drei Ocellen (eingekreist) ausgerichtet ist. Angabe der Injektion Mikropipette sollte in diesem Bereich gespeichert. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Abgeschrägte Injektion Mikropipette. Ein Diagramm eines ordnungsgemäß abgeschrägt Mikropipette wird hier gezeigt. Die Elektrode Öffnung sollte in einem 45 Grad-Winkel abgeschrägt sein und eine Öffnung zwischen 11 und 17 um. Ein richtiges abgeschrägte Injektion Mikropipette ist von entscheidender Bedeutung für einen reibungslosen Injektion mit minimalem dAmage zur Fliege. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Allgemeine Systematik des nanoinjection / Elektrophysiologie-Protokoll. Eine repräsentative Darstellung des Gesamtkonzepts für die nanoinjection / Elektrophysiologie-Protokoll. Beginnen Sie mit dem Erhalt einer Grundlinie Aufnahme durch die Stimulierung der Riesen-Fibers (GF) bei 100 Hz mit 10 von 10 Zügen je Reize (nur ein Zug hier abgebildet). Vor der Injektion beginnen die 1-Hz-Stimulation eine Sekunde auseinander. Während der Injektion (während Injektor angeschlossen wird beim Control Box), werden Sie feststellen, erhebliche Geräuschkulisse, jedoch nicht beenden die Aufnahmen. Nach der Injektion (und Injektor wird vom Steuergerät unplugged), weiterhin die 1-Hz-Stimulation für etwa 1 Minute. Schließlich gehen Sie auf das GVS mit 10 Züge von 10 Stimuli Spannung bei 100 Hz und weiterhin die Funktion der GF Wege mit diesem Paradigma alle 5 Minuten bis zu 15 Minuten zu testen. Hinweis: Aufnahmen were manipuliert werden, um die allgemeine Systematik zu schaffen und repräsentieren nicht ein bestimmtes Ergebnis zu erhalten. Nicht maßstabsgetreu sind nicht alle Spuren gezeigt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">Klicken Sie hier für ein größeres Bild</a> . <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Die Auswirkungen der MLA in der GFS. <ol class="ualpha"><li> Eine grafische Darstellung der Auswirkungen der α7 nAChR-Antagonist Methyllycaconitine Citrat (MLA) auf der GF-DLM Weg der Taufliege in verschiedenen Konzentrationen (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg n = 10 pro Verbindung Behandlung. n = 15 für Kochsalzlösung Behandlung). Nur eine Minute nach der Injektion wurde eine deutliche und unmittelbare Wirkung mit 0,04 ng / mg MLA gesehen. Ein signifikanter Effekt wurde auch mit 0.8ng/mg und 0.12ng/mg von MLA bei 100Hz Stimulation der GfS gesehen. Wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Kochsalzlösung bei den Kontrollen und 0,02 ng / mg MLA zur Kenntnis genommen. Außerdem, keine Veränderung in Effekt wurde nach 1 Minute nach der Injektion in der Zeit getestet (15 Minuten) zu sehen. Ein t-Test wurde zwischen Kochsalzkontrollen (0 ng / mg) und verschiedenen Konzentrationen von MLA zu jedem Zeitpunkt durchgeführt. SEM, * p &lt;0,001 - Levels werden als Mittelwert + / berichtet. </li><li> Probe Spuren der DLM-Reaktionen bei 100 Hz Stimulation. Obere Kurve zeigt die Antworten der Muskel vor der Injektion zu MLA GF Stimulation im Gehirn. Beachten Sie, dass der Muskel in der Lage, auf jeden Reiz eins-zu-eins bei 100 Hz zu reagieren. Mittlere Spur zeigt die Antworten der DLM nach MLA Injektion (0,12 ng / mg). Beachten Sie, dass der Muskel nicht in der Lage ist auf jeden Reiz eins-zu-eins bei 100 Hz zu reagieren. (Sternchen). Untere Spur zeigt die Antworten der DLM aus dem gleichen Präparat (0,12 ng / mg) auf direkte Stimulation der motorischen Neuronen im Thorax. Da DLM reagiert eins-zu-eins bei 100 Hz mit thorakalen Stimulation, kann der Ausfall der Antworten mit Gehirn Stimulationen an das cholinerge PSI-Verbindung zugeschrieben werden DLMn. </li><li> Eine grafische Darstellung der Auswirkungen mit verschiedenen MLA Konzentrationen (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) auf dem GF-TTM Weg. Keine signifikanten Effekte wurden zwischen Saline (0 ng / mg) und Verbindung Injektionen jederzeit Punkt gesehen. Ein t-Test wurde zwischen Kochsalzlösung bei den Kontrollen (0 ng / mg) und den verschiedenen Konzentrationen von MLA zu jedem Zeitpunkt durchgeführt, * p &lt;0,001. </li><li> Probe Spuren der TTM Reaktionen bei 100 Hz Stimulation. Obere Kurve zeigt die Antworten der Muskel vor der Injektion zu MLA GF Aktivierung mit Stimulation des Gehirns. Beachten Sie, dass der Muskel in der Lage, auf alle Reize reagieren bei 100 Hz liegt. Mittlere Spur zeigt die Antworten der DLM nach MLA Injektion (0,12 ng / mg). Antworten von der TTM Muskel auf die Stimulation des GF im Gehirn verbleiben eins-zu-eins. Untere Spur zeigt die Antworten der TTM der gleichen Vorbereitung bis 100 Hz Stimulation der motorischen Neuronen im Thorax (0,12 ng / mg). </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die nanoinjection / Elektrophysiologie Bioassay hier vorgestellten ermöglicht eine schnelle Screening von Verbindungen im Nervensystem der Fruchtfliege. Dies ist ein neues in vivo-Technik, die kleine Mengen einer Verbindung benötigt, um einen Effekt auf einer Vielzahl von molekularen Zielstrukturen in einer gut charakterisierten neuronalen Schaltung auszulösen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Bioaktivität von verschiedenen Verbindungen zu testen, von unbekannten Toxine im Handel erhältlich p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Recording Glaselektroden: Borosilikatglas Kapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm ID </td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> Grass Instruments </td><td> Modell S48 </td><td></td></tr><tr><td> Verstärker </td><td> Erste Instruments Inc. </td><td> Modell 5A </td><td></td></tr><tr><td> Datenerfassungs-Software: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modell 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Software zur Datenerfassung: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> Version 10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereomikroskop wit LWL-Mikroskop Ringlicht </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modell HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> Binokular für die Montage </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Kite &amp; Manuelle Mikromanipulator Schwenkfuß </td><td> World Precision Instruments </td><td> Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster Wilde 10E-Genotyp (Wildtyp) </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> Stock # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Vertikale Pipette Abzieher </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modell 700C </td><td></td></tr><tr><td> Injection Glasmikropipetten: Borosilikatglas Kapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> Katalog # 4878 </td&gt; <td> OD 1,14 mm, 0,5 mm ID </td></tr><tr><td> Silikonöl </td><td> Fischer </td><td> Katalog # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beveler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> KT Braun Typ Model # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> World Precision Instruments </td><td> Katalog # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Blaue Lebensmittelfarbe </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Zutaten: Wasser, Propylenglykol, FD &amp; C Blue 1, und 0,1% Propylparaben (Konservierungsmittel). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine Citrat (MLA) </td><td> Tocris Bioscience </td><td> Katalog # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Kunststoff-Wachs-Sticks </td><td> Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system

Screening von Verbindungen für die in vivo-Aktivität kann in einem ersten Schritt die Kandidaten, die in pharmakologischen Mitteln 1,2 entwickelt werden kann, zu identifizieren verwendet werden. Wir haben ein neues nanoinjection / Elektrophysiologie Assay, der die Detektion der bioaktiven modulatorische Wirkungen von Verbindungen auf die Funktion eines neuronalen Schaltung, vermittelt die Fluchtreaktion in Drosophila melanogaster 3,4 ermöglicht. Unsere in vivo Assay, der die Drosophila Riesenfaser System (GFS, Abbildung 1) können Screening von verschiedenen Arten von Verbindungen, wie kleine Moleküle oder Peptide verwendet, und erfordert nur sehr geringe Mengen, um eine Wirkung hervorrufen. Darüber hinaus bietet das Drosophila GFS eine große Vielfalt an mögliche molekulare Zielstrukturen auf Neuronen oder Muskeln. Die Riesen-Fibers (GF) elektrisch Synapse (Gap Junctions) sowie chemisch (cholinergen) auf eine periphere Synapsing Interneuron (PSI) und der Tergo Trochanteral Muscle Neuron (TTMn) 5 </sup&gt;. Die PSI zu DLMn (Dorsal Längsmuskulatur Neuron)-Verbindung ist abhängig von Dα7 Acetylcholinrezeptoren (nAChR) 6. Schließlich sind die neuromuskulären Endplatten (NMJ) des TTMn und der DLMn mit dem Sprung (TTM) und Flugmuskeln (DLM) glutamatergen 12.07. Hier zeigen wir, wie man Nanolitermengen einer Verbindung zu injizieren, die trotzdem eine elektrophysiologische intrazelluläre Ableitungen aus dem Riesen-Fiber System 13 und wie man die Wirkungen der Verbindung auf die Funktion dieser Schaltung zu überwachen. Wir zeigen Spezifität des Tests mit Methyllycaconitine Citrat (MLA), ein nAChR-Antagonist, der die Verbindung zum PSI DLMn aber nicht die Verbindung zu GF oder die Funktion des NMJ am Sprung oder Flug Muskeln TTMn stört. Vor Beginn dieses Video ist es wichtig, dass Sie genau beobachten und sich mit dem JoVE Video mit dem Titel &quot;elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway von D. Melanogaster &quot;von Augustin et al 7, da das Video hier vorgestellt wird als Erweiterung dieser herkömmlichen Technik bestimmt. Hier haben wir die elektrophysiologischen Verfahren und Fokus verwenden im Detail nur für die Aufnahme eines der gepaarten nanoinjections und Überwachungstechnik.

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Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Ein schneller<em&gt; In-vivo-</em&gt; Test für neuromodulatorische Verbindungen mit dem Riesen-Fiber System (GFS) von Test<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Beschrieben. Nanoinjections im Kopf des Tieres zusammen mit elektrophysiologischen Ableitungen der GFS offenbaren kann Bioaktivität von Verbindungen auf Neuronen oder Muskeln.

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

paired-nanoinjection-electrophysiology-assay-to-screen-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

13.0K Aufrufe.  Florida Atlantic University. Ein schneller In-vivo- Test für neuromodulatorische Verbindungen mit dem Riesen-Fiber System (GFS) von Test Drosophila melanogaster Beschrieben. Nanoinjections im Kopf des Tieres zusammen mit elektrophysiologischen Ableitungen der GFS offenbaren kann Bioaktivität von Verbindungen auf Neuronen oder Muskeln.

Serie: Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Einfache Assay zur Quantifizierung von Sozialvermeidung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Ein Verhaltenstest für Mechanosensation der MARCM-basierte Klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...