Die Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), der Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AS070045, 202301AY070001-011) und der Scientific Research Foundation des Bildungsministeriums der Provinz Yunnan (2023Y0784) unterstützt.

Diese Forschung wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Alle Versuche hielten sich an die etablierten Richtlinien für die Tierpflege. Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) wurden von männlichen C57Bl/6J-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht zwischen 20-25 g gewonnen. Diese Mäuse wurden von der Medizinischen Universität Kunming in Kunming, China, beschafft. Der gesamte Versuchsablauf wurde unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt. Alle Zentrifugationsschritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.
1. Vorbereitung von Reagenzien und Instrumenten
HINWEIS: Alle Schritte, bei denen Lösungen zum Einsatz kommen, müssen in einem Biogefahrenschrank der Klasse II durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Kalzium und Magnesium, 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) mischen (siehe Materialtabelle). Halten Sie diesen Puffer kalt bei 4 °C. Es ist wichtig, ihn am Tag der Verwendung frisch zuzubereiten und den Puffer zu entgasen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verdauungsenzyme vor, indem Sie 10 ml PBS (ohne Kalzium und Magnesium) mit 2 ml 0,25%igem Trypsin, 1 ml 20 mg/ml Papain und 200 μl 1 mg/ml Kollagenase I kombinieren (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Aliquots geeigneter Volumina verwenden, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Lagern Sie diese Aliquoten bei -20 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie das handelsübliche Endothelzell-Wachstumsmedium-Kit verwenden, das VEGF-C (100 ng/ml) und 1 % P/S enthält (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bereiten Sie den Stopppuffer vor, indem Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10% FBS ergänzen, um den Verdauungsprozess zu stoppen.</li>
	<li>Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente vor: Zu diesen Instrumenten sollten eine Schere, eine Pinzette mit gezackter Spitze und eine Pinzette mit feiner Spitze gehören.</li>
</ol>2. Kolbenbeschichtung
<ol><li>Der T25-Kolben wird mit einer 100 μg/ml Fibronektinlösung bestrichen (siehe Materialtabelle) und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vor Gebrauch mit einer Pipette.</li>
	<li>Waschen Sie den Kolben dreimal mit PBS, saugen Sie anschließend den PBS an und lassen Sie den T25-Kolben an der Luft trocknen.</li>
</ol>3. Dissoziation von Leptomeningen
HINWEIS: Verwenden Sie immer vorgekühlte Puffer und Lösungen bei 4 °C.
<ol><li>Betäuben Sie die Mäuse mit einer übermäßigen Inhalation von 4 % Isofluran und opfern Sie sie dann durch schnelle Enthauptung mit einer Schere, die zuvor mit 70 % Ethanol gereinigt wurde.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut vorsichtig entlang der Mittellinie ein, beginnend mit der Öffnung an der Rückseite des Schädels und in Richtung des vorderen Bereichs.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schädel vorsichtig und heben Sie ihn vorsichtig mit der Schere an, um eine Beschädigung der Leptomeninge zu vermeiden und sicherzustellen, dass das gesamte Gehirn, einschließlich der Leptomeninge, erhalten wird.</li>
	<li>Tauchen Sie das gesamte Gehirn in einen Waschpuffer und spülen Sie ihn vorsichtig aus, um oberflächliches Blut zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gehirn in eine sterile Petrischale, ohne es zu zerkleinern, und extrahieren Sie die Leptomeninge mit einer feinen Pinzette unter einem Mikroskop von der Gehirnoberfläche.</li>
	<li>Schneiden Sie das Leptomening-Gewebe mit einer sterilen Mikroschere in Fragmente.</li>
</ol>4. Enzymatische Verdauung von Leptomeningen
<ol><li>Zu den Fragmenten werden 10 ml der Enzymmischung (Schritt 1.2) gegeben und bei 37 °C 15 min inkubiert. Rühren Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich die Fragmente vom Boden des Röhrchens lösen. Geben Sie anschließend 10 ml Stopppuffer hinzu (Schritt 1.4), um die Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml kaltes PBS hinzu und leiten Sie die Mischung durch ein 70-μm-Sieb in ein steriles 50-ml-Röhrchen, um Klumpen herauszufiltern.</li>
</ol>5. Zellausdehnung
<ol><li>1 x 10 5 Zellen procm2 in einen mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben (Schritt 2) mit5 ml Nährmedium geben.</li>
	<li>Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 %CO2 für 24 h inkubiert. Entfernen Sie anschließend das Medium, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.</li>
	<li>Pflegen Sie die Kultur, indem Sie alle zwei Tage 50 % des Mediums austauschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal.</li>
</ol>6. Auswahl der Magnetzellen
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, halten Sie die Zellkälte aufrecht und verwenden Sie vorgekühlte Lösungen, um eine unspezifische Zellmarkierung zu verhindern.
<ol><li>Vorbereitung von Instrumenten und Reagenzien: Befestigen Sie einen Magnetabscheider an einem Magnetabscheiderständer (siehe Materialtabelle). Schließen Sie eine Auswahlsäule an den Magnetabscheider an und positionieren Sie ein 70-μm-Zellsieb auf der Auswahlsäule. Platzieren Sie ein 50-ml-Röhrchen unter der Auswahlsäule, um den Durchfluss aufzufangen.</li>
	<li>Enzymatische Verdauung: Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, saugen Sie das Medium ab und spülen Sie die Zellen mit PBS. Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um adhärente Zellen abzulösen, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie den Stopppuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Antikörper-Inkubation: Resuspendierung von 1 x10 7 Gesamtzellen in 100 μl PBS und Zugabe von 10 μl LYVE-1-Antikörper (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.<ol><li>Drehen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g und verwerfen Sie den Überstand. Spülen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS einführen und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vollständig.</li>
	</ol></li>
	<li>Markierung von Mikrokügelchen: Resuspendierung der Zellen in 100 μl PBS und Zugabe von 20 μl Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.<ol><li>Schleudern Sie die Zellen 5 min lang bei 300 x g und dekantieren Sie den Überstand. Anschließend werden die Zellen mit 1 ml PBS durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min gereinigt. Zum Schluss entfernen Sie den Überstand vollständig.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetischer negativer Ausschluss: Resuspendierung der Zellen in 4 ml PBS. Führen Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb, um Klumpen zu entfernen. Bereiten Sie die Auswahlsäule (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie sie mit 3 ml PBS spülen und dann die Zellsuspension in die Auswahlsäule auftragen.<ol><li>Waschschritte mit 3 ml PBS durchführen und LYVE-1-negative Zellen in einem 50-ml-Röhrchen sammeln, das unterhalb der Auswahlsäule positioniert ist, damit sie passieren können.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetische positive Auswahl: Pipettieren Sie 6 ml PBS in die Auswahlspalte. Spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Auswahlsäule drücken, um LYVE-1-positive LLECs zu erhalten. HINWEIS: Warten Sie immer, bis das Auswahlspaltenreservoir leer ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
</ol>7. LLEC-Kultur
<ol><li>Zentrifugieren Sie die LYVE-1-positiven LLECs bei 300 x g für 5 Minuten und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.</li>
	<li>1 x 10 5 Zellen procm2 in einen mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben mit5 ml Nährmedium geben.</li>
	<li>Pflegen Sie die Kultur, indem Sie jeden zweiten Tag 50 % des Mediums austauschen. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, trennen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin und führen Sie die Zellpassage durch. Verwenden Sie die Zellen nach 2-3 Durchgängen für nachfolgende Experimente.</li>
</ol>8. Durchflusszytometrische Analyse
HINWEIS: Die durchflusszytometrische Analyse wurde nach dem zuvor beschriebenen Verfahren15 durchgeführt.
<ol><li>Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um adhärente Zellen abzulösen, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten. Fügen Sie dann den Stopppuffer hinzu, um die Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Resuspendieren Sie 1 x 106 Zellen in 100 μl PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 μl LYVE-1-Antikörper hinzu. Gründlich mischen und 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge PBS-Puffer für die Analyse mit Durchflusszytometrie und FlowJo-Software (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>9. Immunfluoreszenz-Färbung
HINWEIS: Die Immunfluoreszenzfärbung wurde nach dem zuvor beschriebenen Verfahrendurchgeführt 16.
<ol><li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das PFA und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.</li>
	<li>Wenden Sie den Blockpuffer 1 h bei Raumtemperatur an. Entfernen Sie den Blockpuffer aus den Deckgläsern.</li>
	<li>Geben Sie den LYVE-1-Antikörper im Färbepuffer zu den Zellen und inkubieren Sie im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.</li>
	<li>Geben Sie einen geeigneten Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) in den Färbepuffer zu den Zellen und inkubieren Sie im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.</li>
	<li>Gegenfärbung mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Die Zellen sind nun bereit für die Immunfluoreszenzmikroskopie.</li>
</ol>

Etablierung von In-vitro-LLEC-Kulturen mittels magnetischer Zellselektion

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium.">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells.">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt offenlegen müssen.

Über das bestehende Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro wurde bisher nicht berichtet. In dieser Studie wird ein reproduzierbares, multiprozedurales Protokoll für die Gewinnung und Kultivierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus vorgestellt.
Obwohl dieses multiprozedurale Protokoll reproduzierbar ist, gibt es mehrere wichtige Überlegungen. Zum Beispiel fördern Fibronektin-beschichtete T25-Kolben die Adhäsion von LLECs und ihre Funktion, indem sie nicht a...

Die neu entdeckten leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen (LLECs) bilden ein Geflecht aus einzelnen Zellen innerhalb der Leptomeninge und weisen im Vergleich zu peripheren lymphatischen Endothelzellen ein deutliches Verteilungsmuster auf 1,2. Die zellulären Funktionen und klinischen Implikationen, die mit LLECs verbunden sind, sind nach wie vor weitgehend unbekanntes Terrain. Um den Weg für die funktionelle Forschung an LLECs zu ebnen, ist es zwingend erforderlich, ein In-vitro-Modell für ihre Untersuchung zu etablieren. Daher wurde in dieser Studie ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Primärkultur von LLECs entwickelt.
Mäuse sind aufgrund ihrer Eignung für die genetische Manipulation in der Krankheitsforschung das bevorzugte Tiermodell. Frühere Studien haben erfolgreich lymphatische Endothelzellen aus verschiedenen Mausgeweben isoliert, darunter Lymphknoten3, Mesenterialgewebe4, Hautgewebe5, sammelnde Lymphgefäße6 und Lungengewebe7. Diese Isolierungsverfahren beruhen in erster Linie auf Techniken wie der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) und der Durchflusszytometrie 8,9,10. Darüber hinaus haben die Forschungsbemühungen zur Etablierung von Arachnoidalzelllinien der Ratte und lymphatischen Kapillarzelllinien der Ratte geführt11,12. Trotz der Existenz von Explantatkulturtechniken für Leptomeninge13 besteht ein dringender Bedarf an einem standardisierten Protokoll für die Isolierung und Kultur von LLECs. Folglich wurden in dieser Studie erfolgreich LLECs geerntet und kultiviert, indem Leptomeninge unter Anleitung eines Mikroskops akribisch dissoziiert und die LLEC-Expansion durch den Einsatz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors-C (VEGF-C) gefördert wurden. Der charakteristische Marker für lymphatische Endothelzellen ist der lymphatische Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)14. Dieses mehrstufige Protokoll isoliert selektiv LYVE-1-positive LLECs mittels MACS und verifiziert anschließend ihre Reinheit durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung.
Die Hauptschritte dieses mehrstufigen Protokolls können wie folgt zusammengefasst werden: Kolbenbeschichtung, Dissoziation von Leptomeningen, enzymatischer Verdau von Leptomeningen, Zellexpansion, magnetische Zellselektion und anschließende Kultur von LLECs. Abschließend wird die Reinheit der isolierten LLECs durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Isolierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus und deren anschließende in vitro Kultur vorzustellen. Dieses Protokoll wird die Untersuchung der zellulären Funktionen und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) sind eine kürzlich entdeckte intrakranielle Zellpopulation mit einer einzigartigen Verteilung, die sich deutlich von peripheren lymphatischen Endothelzellen unterscheidet. Ihre zelluläre Funktion und ihre klinischen Implikationen sind noch weitgehend unbekannt. Folglich ist die Verfügbarkeit eines Angebots an LLECs für die Durchführung funktioneller Forschung in vitro unerlässlich. Derzeit gibt es jedoch kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro.
In dieser Studie wurden LLECs erfolgreich mit einem mehrstufigen Protokoll geerntet, das die Beschichtung des Kolbens mit Fibronektin, die Präparation der Leptomeninge mit Hilfe eines Mikroskops, die enzymatische Verdauung der Leptomeninge zur Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Induktion der Expansion von LLECs mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-C (VEGF-C) und die Selektion von lymphatischen Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)-positiven Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) umfasste. Dieser Prozess führte schließlich zur Etablierung einer Primärkultur. Die Reinheit der LLECs wurde durch Immunfluoreszenzfärbung und durchflusszytometrische Analyse mit einem Reinheitsgrad von über 95 % bestätigt. Dieses mehrstufige Protokoll hat die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit unter Beweis gestellt, was die Erforschung der zellulären Funktion und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern wird.

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung zellulärer Funktionen und potenzieller klinischer Implikationen von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen 

Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

In dieser Studie wird ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Entnahme von lymphatischen Endothelzellen (LLECs) aus Mäusen und die anschließende Etablierung ihrer Primärkultur in vitro vorgestellt. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Kolbenvorbereitung und die Fibronektin-Beschichtung, die Dissoziation von Leptomeningen, die Gewinnung einer Einzelzellsuspension durch enzymatischen Aufschluss und die Induktion der LLEC-Expansion mit VEGF-C. LYVE-1-positive LLECs werden dann selektiv mittels...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Cellular Functions and Potential Clinical Implications of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Dieses Protokoll ist für Gebiete von anderen Forschern konzipiert, die nur daran interessiert sind, das Multiverfahren zu und kulturelle Primärgebiete zu etablieren Unser Protokoll führte letztendlich zur Etablierung unserer Primärkultur des Bereichs CS mit einem Reinheitsgrad von über 95%Es gibt derzeit kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung Unsere Ergebnisse ebneten den Weg für die weitere Untersuchung der ähnlichen Funktion von LLECS in der virtuellen Anwendung. Bei RUC, unserer jüngsten Entdeckung der intrakraniellen zellulären Population, werden wir weitere Forschungen zur zellulären Funktion durchführen und ihre klinischen Auswirkungen überprüfen.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

871 Aufrufe.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Dieses Protokoll ist für Gebiete von anderen Forschern konzipiert, die nur daran interessiert sind, das Multiverfahren zu und kulturelle Primärgebiete zu etablieren Unser Protokoll führte letztendlich zur Etablierung unserer Primärkultur des Bereichs CS mit einem Reinheitsgrad von über 95%Es gibt derzeit kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung Unsere Ergebnisse ebneten den Weg für die weitere Untersuchung der ähnlichen Funktion von LLECS in der virtuellen Anwendung. ...

Serie: Autor im Rampenlicht: Enthüllung zellulärer Funktionen und potenzieller klinischer Implikationen von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

Leptomeninge-Dissoziation und enzymatischer Verdau der Maus zur effizienten Kultivierung von Leptomeningealzellen

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.