Die Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223) unterstützt; die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)

Das Versuchsprotokoll wurde von der Kommission für Tierethik und -verwendung der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Für die vorliegende Studie wurden Sprague-Dawley (SD)-Ratten beiderlei Geschlechts, 300-350 g, verwendet.
1. Induktion des SAB-Modells
<ol><li>Betäuben Sie die Ratten mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch kontinuierliche Inhalationsanästhesie mit Isofluran (1%-3%). Befestigen Sie den Kopf der Ratte mit einem stereotaktischen Gerät (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Erstellen Sie das SAH-Modell, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Führen Sie eine Mikroinjektionsnadel in den suprasellaren Spülkasten ein. Anschließend wird Eigenblut aus der Rattenschwanzarterie (ohne Antikoagulans) mit einer Spritzenpumpe in die suprasellare Zisterne injiziert (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Implantieren Sie eine Mikroinjektionsnadel in den rechten lateralen Hirnventrikel mit den genannten Koordinaten: bregma, −0,8 mm; seitlich, 1,4 mm; Tiefe, 4 mm9. Für SAB-Gruppen injizieren Sie 0,2 ml Blut aus der Rattenschwanzarterie. Bei Scheingruppen wird die gleiche Menge isotonischer Kochsalzlösung verabreicht (Abbildung 1A).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Präparation und Stabilisierung von Hirnschnitten
<ol><li>Die Ratten werden mit einer Inhalation von 2 % Isofluran tief betäubt. Nach der Enthauptung wird das gesamte Gehirn entnommen und in eiskaltes künstliches Liquor cerebrospinalis (ACSF) getaucht. HINWEIS: Verwenden Sie frisch zubereitete ACSF-Lösungen mit der folgenden Zusammensetzung: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH 2 PO 4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl 2und 10,11 mM D-Glucose (siehe Materialtabelle). Halten Sie einen pH-Wert zwischen 7,3 und 7,4 aufrecht.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Vibratom (siehe Materialtabelle), um akute Hirnschnitte mit einer Dicke von 200 μm von den SD-Ratten in eiskaltem ACSF herzustellen, das mit 5 % CO 2 und 95 % O2 belüftet ist (Abbildung 2).</li>
	<li>Legen Sie die 200 μm dicken akuten Hirnschnitte in eine Vorratskammer auf ein Nylonnetz, das in ACSF getaucht ist. Die ACSF-Lösung wird mit 95 % O2 und 5 %CO2 in einem Temperaturbereich von 35-37 °C ausgeglichen. Lassen Sie die Gehirnschnitte 2 Stunden lang stabilisieren, damit sie sich anpassen können (Abbildung 3).</li>
</ol>3. Markierung von Perizyten in akuten Hirnschnitten mit TO-PRO-3
HINWEIS: Perizyten aus akuten Hirnschnitten wurden mit dem Tracer TO-PRO-310 fluoreszenzmarkiert.
<ol><li>Der Fluoreszenzfarbstoff TO-PRO-3 wird mit dem ACSF versetzt, so dass eine Endkonzentration von 1 μM erreicht wird. Inkubieren Sie die akuten Hirnschnitte bei Raumtemperatur in dunkler Umgebung mit dem TO-PRO-3-haltigen ACSF für 20 min. HINWEIS: Denken Sie daran, Latexhandschuhe zu tragen, wenn Sie TO-PRO-3 zum Schutz handhaben.</li>
	<li>Das Nylongewebesieb mit den Hirnschnitten aus der Ladekammer in eine 6-Well-Plattenspülkammer überführen (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Hirnschnitte 10 Minuten in der Spülkammer verbleiben (Abbildung 4D). HINWEIS: Dieser Spülschritt beendet den Färbeprozess, verringert die Hintergrundbeschriftung und verhindert unspezifische Flecken.</li>
	<li>Spülen Sie die Präparate insgesamt 15 Minuten lang mit einer ACSF-Lösung, die mit einer Mischung aus 5 %CO2 und 95 %O2 äquilibriert ist. Dieser Spülschritt stoppt die Farbstoffaufnahme und minimiert die Hintergrundmarkierung (Abbildung 4C).</li>
</ol>4. Färbung nicht-vitaler Perizyten der zerebralen Mikrozirkulation in akuten Hirnschnitten
<ol><li>Inkubieren Sie Gehirnschnitte, die mit TO-PRO-3 vorgeladen sind, bei 37 °C mit Isolektin B4, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/ml, siehe Materialtabelle) für 30 Minuten in einer dunklen Umgebung. Nach der Inkubation werden die Hirnschnitte 15 Minuten lang in ACSF gespült (Abbildung 4E).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Hirnschnitte wie üblich in ACSF, das mit 5 % CO2 und 95 %O2 vergast ist. Propidiumiodid (PI) in einer Konzentration von 37 μM wird zu beiden Lösungen bei 37 °C gegeben. Dadurch werden nicht-vitale Hirnperizyten markiert. Die Präparate werden in dieser ACSF-Lösung 60 Minuten lang im Dunkeln inkubiert (Abbildung 4F).</li>
	<li>Als nächstes spülen Sie die Präparate 15 Minuten lang mit ACSF-Lösungen, um die Farbstoffaufnahme zu stoppen und die Hintergrundmarkierung zu minimieren.</li>
</ol>5. Bildgebung vitaler und nicht-vitaler Hirnperizyten in akuten Hirnschnitten
<ol><li>Die Gehirnschnitte werden vorsichtig mit Pasteurpipetten aus Kunststoff in konfokale Schalen mit Glasboden (siehe Materialtabelle) übertragen. Füllen Sie die Schalen mit ACSF-Lösung, die zuvor mit 5 % CO2 und 95 %O2 äquilibriert wurde. Verwende ein Eisengitter, um Rattenhirnschnitte an Ort und Stelle zu befestigen.</li>
	<li>Übertragen Sie die konfokalen Glasbodenschalen auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops. Positionieren Sie den akuten Hirnschnitt am Boden der Schale und perfundiertieren Sie ihn9 mit einer ACSF-Lösung, die mit einer Mischung aus 95 % O2 und 5 %CO2 während der konfokalen mikroskopischen Bildgebung äquilibriert ist (Abbildung 5A und Abbildung 5Ab').</li>
	<li>Visualisieren Sie die Wandzellen der zerebralen kortikalen Mikrogefäße mit einem 40-fachen Objektiv. Erfassen Sie Bildstapel mit kompatibler Software (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie geeignete Filter für IB4 (Anregung/Emission 460 nm/520 nm), PI (Anregung/Emission 545 nm/595 nm) und TO-PRO-3 (Anregung/Emission 606 nm/666 nm) (Abbildung 5D). HINWEIS: Nehmen Sie Bilder mit den folgenden Details auf: 40× DIC N1 Objektiv, 3 × 12 Bit: 512 × 512 Pixel (0,22 × 0,22 mm), Kalibrierung: 0,42 μm/px.</li>
	<li>Identifizierung von zerebralen Mikrogefäßen und Perizyten anhand ihres Netzwerks und ihrer Morphologie. Lokalisieren Sie eine bestimmte Region, die ein zerebrales Mikrogefäßsystem auf jedem Hirnschnitt enthält, und nehmen Sie Bilder auf.</li>
	<li>Notieren Sie sich sorgfältig den Aufnahmeort, um die Konsistenz bei nachfolgenden Aufnahmen sicherzustellen (Abbildung 5B,C). Verwenden Sie für die weitere Verarbeitung und Analyse eine Bildanalysesoftware (ImageJ) und eine Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

Visualisierung der Kontraktilität der Perizyten des Gehirns nach einer Subarachnoidalblutung

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es wurden hochauflösende konfokale Bildgebungsverfahren zur Visualisierung von vitalen Hirnperizyten, nicht-vitalen Hirnperizyten und der Mikrogefäße in Hirnschnitten entwickelt. In akuten Hirnschnitten von Ratten werden zunächst Perizyten mit TO-PRO-311 markiert, gefolgt von mikrovaskulären Endothelzellen mit IB412; Anschließend erfolgt die Identifizierung der verstorbenen Perizyten mittels PI. Dieses Protokoll ist einfach, reproduzierbar und in hohem Maße anwendbar...

Hirnperizyten, die sich durch ihre schlanken Ausstülpungen und hervorstehenden Zellkörper auszeichnen, umkreisen die Mikrozirkulation 1,2. Während die zerebrale Durchblutungsaugmentation überwiegend durch kapillare Dilatation angetrieben wird, weisen kleinere Arterien langsamere Dilatationsraten auf3. Die Kontraktilität der Perizyten übt einen Einfluss auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenmorphologie aus und wirkt sich auf die Gefäßdynamik aus4. Die Kontraktion der Hirnperizyten führt zu einer Verengung der Kapillaren, und in pathologischen Szenarien kann eine übermäßige Kontraktion den Erythrozytenfluss behindern5. Verschiedene Faktoren, einschließlich Noradrenalin, das aus dem Locus coeruleus freigesetzt wird, können eine Kontraktion der Gehirnperizyten in den Kapillaren induzieren6. Perizyten spielen eine regulatorische Rolle im zerebralen Blutfluss und zeigen eine 20-HETE-Synthese, die als Sauerstoffsensor während der Hyperoxie7 dient. Die durch oxidativ-nitrativen Stress ausgelöste Kontraktion der Hirnperizyten wirkt sich nachteilig auf die Kapillaren aus5. Trotz In-vivo- und Ex-vivo-Untersuchungen zur Hirnperizytenkontraktion8 ist das Wissen über die Bildgebung von lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Hirnperizyten in Hirnschnitten nach wie vor begrenzt.
Entscheidend ist, dass die Bildgebung der Hirnperizyten nach der Gewebefixierung deren Vitalität und die anschließende Beurteilung der Kontraktilität beeinträchtigt. Darüber hinaus kann in Szenarien wie neurologischen Störungen (z. B. Subarachnoidalblutung - SAB) bei der transgenen Markierung von Hirnperizyten nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten unterschieden werden, wie unsere vorläufige SAB-induzierte Hirnperizytentodstudie9 bestätigt. 
Um diese Herausforderungen zu meistern, setzten wir TO-PRO-3 zur Markierung lebender Perizyten ein, während verstorbene mit Propidiumiodid (PI) gefärbt wurden. Wir verwendeten hochauflösende konfokale Bildgebungstechnologien, um lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten in Hirnschnitten zu visualisieren und gleichzeitig die Schichtaktivität während der Bildgebung zu erhalten. Dieser Artikel zielt darauf ab, eine reproduzierbare Methode zur Darstellung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Hirnperizyten in Hirnschnitten vorzustellen, die als wertvolles Werkzeug dient, um den Einfluss von Hirnperizyten auf die zerebrale Mikrozirkulation nach SAB zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

Perizyten sind wichtige Wandzellen, die sich in der zerebralen Mikrozirkulation befinden und für die aktive Modulation des zerebralen Blutflusses durch Kontraktilitätsanpassungen von entscheidender Bedeutung sind. Konventionell wird ihre Kontraktilität durch die Beobachtung morphologischer Verschiebungen und Änderungen des Kapillardurchmessers in der Nähe unter bestimmten Umständen gemessen. Die Fixierung nach dem Gewebe, die Bewertung der Vitalität und die anschließende Kontraktilität der abgebildeten Hirnperizyten werden jedoch beeinträchtigt. In ähnlicher Weise ist die genetische Markierung von Hirnperizyten nicht in der Lage, zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten zu unterscheiden, insbesondere bei neurologischen Erkrankungen wie Subarachnoidalblutungen (SAB), bei denen unsere vorläufige Untersuchung den Absterben von Hirnperizyten bestätigt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein zuverlässiges Protokoll entwickelt, das die gleichzeitige Fluoreszenzmarkierung von funktionellen und nicht-funktionellen Hirnperizyten in Hirnschnitten ermöglicht. Diese Markierungsmethode ermöglicht eine hochauflösende konfokale mikroskopische Visualisierung bei gleichzeitiger Markierung der Mikrogefäße des Hirnschnitts. Dieses innovative Protokoll bietet die Möglichkeit, die Kontraktilität der Gehirnperizyten, ihre Auswirkungen auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenstruktur zu beurteilen. Die Untersuchung der Kontraktilität von Hirnperizyten im SAB-Kontext liefert ein aufschlussreiches Verständnis ihrer Auswirkungen auf die zerebrale Mikrozirkulation.

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

Autor im Rampenlicht: Bildgebung von Perizyten nach Subarachnoidalblutungen bei Nagetieren 

Bildgebung vitaler und nicht-vitaler Hirnperizyten in Hirnschnitten nach Subarachnoidalblutung

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

Unter normalen physiologischen Bedingungen erleiden Hirnperizyten in der Regel keinen Zelltod. Abbildung 6 veranschaulicht dieses Phänomen, wobei Gelb das Vorhandensein lebenswichtiger Hirnperizyten anzeigt. Die Perizyten des Gehirns zeigen keine Färbung mit PI, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Um weiter zu untersuchen, ob Perizyten nach dem Zelltod an das Mikrogefäßsystem gebunden bleiben, wurden Methoden in einem SAH-Rattenmodell eingesetzt und anschließend eine Bildgebung durc...

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Die Voruntersuchung bestätigt, dass eine Subarachnoidalblutung (SAB) zum Absterben der Hirnperizyten führt. Die Beurteilung der Perizytenkontraktilität nach SAB erfordert eine Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Hirnperizyten. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten gleichzeitig in Hirnschnitten markiert werden können, was die Beobachtung mit einem hochauflösenden konfokalen Mikroskop erleichtert.

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

Unsere Studie zeigte einen signifikanten Anstieg der Todesfälle durch Perizyten. Ausgehend von einem kranken Pferd nach SAB zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Anzahl der niedrig vitalen Parasiten und der nach der SAB verstrichenen Zeit. Die Bildgebung von vitalen und nicht-vitalen Hirnparasiten in Gehirnschnitten nach SAB und den Parasitenisolationstechniken hat die Forschung auf meinem Gebiet vorangetrieben.Derzeit ist es ziemlich schwierig, zwischen toten Parasiten und toten Endothelzellen zu unterscheiden. Unsere Studie zeigt kontraktionsabhängige Apoptose bei Parasiten nach SAB. Wir haben ein sehr zuverlässiges Protokoll entwickelt, das die Fluoreszenzmarkierung sowohl eines funktionellen als auch eines nicht-funktionalen Hirnparasiten in Hirnschnitten ermöglicht, und zwar gleichzeitig.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

702 Aufrufe.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Unsere Studie zeigte einen signifikanten Anstieg der Todesfälle durch Perizyten. Ausgehend von einem kranken Pferd nach SAB zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Anzahl der niedrig vitalen Parasiten und der nach der SAB verstrichenen Zeit. Die Bildgebung von vitalen und nicht-vitalen Hirnparasiten in Gehirnschnitten nach SAB und den Parasitenisolationstechniken hat die Forschung auf meinem Gebiet vorangetrieben.Derzeit ist es ziemlich schwierig, zwischen toten Parasiten u...

Serie: Autor im Rampenlicht: Bildgebung von Perizyten nach Subarachnoidalblutungen bei Nagetieren 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

Forschung

Neurowissenschaften

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

Induktion des murinen Subarachnoidalblutungsmodells und Hirnschnittpräparation für die Fluoreszenzbildgebung

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

Markierung und Färbung von Rattenhirnperizyten für die Fluoreszenzbildgebung

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.