Wir danken L. Brockmann für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch NIH 1R01EB030352 und UL1 TR001873 unterstützt.

Alle Tierbehandlungen wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, Protokolle AC-AABQ5551 und AC-AAAZ4470) mit 6-8 Wochen alten weiblichen BALB/c- oder CF57BL/6-Mäusen mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g durchgeführt. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Dieses Protokoll ist um die "Tage nach der Aktivierung" der murinen T-Zellen herum strukturiert, und die Virusproduktion beginnt am Tag -2. Das Retrovirus kann nach der ersten Produktion bei -80 °C gelagert werden, und für die zukünftige Verwendung dieses Protokolls kann man mit Schritt 2, der Isolierung und Aktivierung von T-Zellen am Tag 0, beginnen.
1. Retrovirale Vektorproduktion
ANMERKUNG: Die viralen Produkte wurden durch die Trennung der Verpackungsgene in zwei separate Plasmide replikationsfehlerhaft gemacht (siehe Materialtabelle), wodurch die Wahrscheinlichkeit von Rekombinationsereignissen und der unbeabsichtigten Produktion von replikationskompetenten Viren erheblich reduziert wurde.
<ol><li>Bereiten Sie die Phoenix Eco-Zellen einen Tag vor der Transfektion vor (Tag-2-Verfahren).<ol><li>Etwa 1 x 107 Zellen werden in eine 15 cm TC-behandelte Platte oder einen T150-Kulturkolben gegeben, wobei 30 ml Nährmedium (Phoenix Eco-Nährmedium, wie in Tabelle 1 beschrieben) verwendet werden.</li>
		<li>Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Nach 18-24 h sollten die Zellen zu ca. 70% konfluent und gleichmäßig verteilt sein, um eine hohe Virusausbeute ohne Überwucherung zu gewährleisten. HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie Zellen mit einer niedrigen Passage und lassen Sie sie am Tag vor der Beschichtung für die Virusproduktion durch. Achten Sie darauf, dass Phoenix Eco-Zellen während der Routinekultur nicht überwuchern.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Transfektionsmischung mit den Lipofektions- und Enhancer-Reagenzien pCL-Eco (Gag/Pol) und pMSCV-Expressionsplasmid (pMSCV_PGK_mGFP28z) wird in reduzierten Serummedien hergestellt (siehe Materialtabelle) (Tag-1-Verfahren). HINWEIS: Die Co-Transfektion sollte in einem Verhältnis von 1:1 von pMSCV und pCL-Eco durchgeführt werden.<ol><li>Röhrchen A vorbereiten: Verdünnen Sie 105 μl des Transfektionsreagenzes in 3,75 ml reduziertem Serummedium pro 15-cm-Platte und mischen Sie es gründlich durch Auf- und Abpipettieren.</li>
		<li>Röhrchen B vorbereiten: pMSCV-Expressionsplasmid (21 μg) und pCL-Eco (21 μg) mit 90 μl Enhancer-Reagenz in 3,75 ml reduziertes Serummedium pro 15-cm-Platte verdünnen. Durch Auf- und Abpipettieren gut mischen. HINWEIS: Wenn Sie mehrere virale Produkte erzeugen, richten Sie einen Mastermix ein, der pCL-Eco und das Enhancer-Reagenz enthält.</li>
		<li>Fügen Sie Röhrchen A zu Röhrchen B hinzu und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. 10-20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, was ein Gesamtvolumen von ca. 7,5 ml ergibt.</li>
		<li>Entnehmen Sie vorsichtig 10 ml Zellkulturmedien von der/den Phoenix Eco-Platte(n) und geben Sie das gesamte Volumen der Transfektionsmischung zu den verbleibenden Medien, indem Sie die Platte kippen und tropfenweise pipettieren. Die Zellen werden wieder in einen 37 °C warmen Inkubator gegeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Wechseln Sie das Medium auf transfizierten Phoenix Eco-Zellen 16-20 Stunden nach der Transfektion (Tag-0-Verfahren).<ol><li>Serum und β-Mercaptoethanol (2-ME, siehe Materialtabelle) freies murines T-Zell-Medium (mTCM-virale Ernte, wie in Tabelle 1 aufgeführt) in einem Wasser- oder Kügelchenbad auf 37 °C vorwärmen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Phoenix Eco Nährmedium vorsichtig, indem Sie die Platte kippen und die Pipettenspitze an der unteren Ecke platzieren, wenn möglich mit einem Vakuum. Vermeiden Sie ein Übertrocknen der Zellen.</li>
		<li>Geben Sie das erwärmte mTCM-virale Erntemedium vorsichtig an die Seite der geneigten Platte, indem Sie 30 ml auf der langsamsten Stufe pipettieren. Die Zellen werden wieder in einen 37 °C warmen Inkubator gegeben. HINWEIS: Dieser Schritt kann dazu führen, dass sich Phoenix Eco-Zellen von der Platte lösen und die Virustiter reduzieren. Vorgewärmte Medien und schonendes Pipettieren minimieren Unterbrechungen.</li>
	</ol></li>
	<li>Entnehmen Sie den viralen Überstand 48 Stunden nach der Transfektion (Tag-1-Verfahren).<ol><li>Entnehmen Sie den viralen Überstand und filtern Sie ihn durch 0,45 μm PVDF-Filter (siehe Materialtabelle), um Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Aliquotieren und frieren Sie das Virus bei -80 °C ein oder fahren Sie direkt mit Tag 1 von Schritt 3 fort, wenn Sie frisches Virus verwenden.</li>
		<li>Bestimmen Sie den Virustiter (transduzierende Einheiten/ml) durch Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben9. Dieser Schritt ist optional.<ol><li>Bestimmung des Virustiters durch Transduktion von 1 x 105 aktivierten murinen T-Zellen in mit Nicht-Gewebekulturen (TC) behandelten 96-Well-Platten, die mit Retronektin vorbeschichtet (siehe Materialtabelle) und mit dreifachen seriellen Verdünnungen retroviralen Überstandes in einem Endvolumen von 100 μl mTCM-viralem Erntemedium beladen wurden. HINWEIS: In Schritt 2 und Schritt 3 unten finden Sie detaillierte Anweisungen zur Isolierung, Aktivierung und Transduktion von T-Zellen.</li>
			<li>Bestimmung der CAR-Oberflächenexpression 4-5 Tage nach der Transduktion mittels Durchflusszytometrie.</li>
			<li>Berechnen Sie den Virustiter gemäß der Formel10: (N x F x D)/V, wobei N die Anzahl der transduzierten Zellen, F die Häufigkeit der CAR-positiven Zellen, D der Verdünnungsfaktor und V das Transduktionsvolumen in ml ist, um Transduktionseinheiten (TU)/ml zu erhalten. HINWEIS: Der Virustiter kann beim Einfrieren/Auftauen abnehmen; Daher wird der Virustiter idealerweise an gefrorenen und anschließend aufgetauten Viren bestimmt.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolierung von murinen T-Zellen
<ol><li>Isolierung und Aktivierung von murinen T-Zellen (Tag-0-Verfahren). HINWEIS: Diese Schritte können bei Raumtemperatur (RT) oder 4 °C durchgeführt werden und sollten in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden.<ol><li>Man erntet die Milz(en) von dem interessierenden Mausstamm (z. B. Balb/c, C57BL/6), wie zuvorbeschrieben 11 und erhält eine einzellige Suspension durch mechanische Dissoziation.</li>
		<li>Zerkleinern Sie die Milz(en) mit der Rückseite einer sterilen Spritze durch ein 70-100-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Nachdem Sie die Spritze beiseite gelegt haben, waschen Sie das Sieb mit 5 ml T-Zell-Isolationspuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS, ergänzt mit 2 % fötalem Kälberserum, FBS).</li>
		<li>Wiederholen Sie den Maischeschritt und waschen Sie das Sieb erneut mit 5 ml T-Zell-Isolationspuffer. Bringen Sie das Endvolumen mit T-Zell-Isolationspuffer auf 50 ml.</li>
		<li>Zählen Sie lebende Zellen mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler, indem Sie sie im Verhältnis 1:20 verdünnen und dann im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau mischen.</li>
		<li>Die Zellen werden 10 Minuten lang bei 450 x g bei 450 °C (oder RT) zentrifugiert, und die Milzzellen werden bei 1 x 108/ml resuspendiert, wenn das empfohlene T-Zell-Isolierungskit verwendet wird (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Spleenozyten können in diesem Stadium durch ein 40-70 μm großes Sieb erneut eingesiebt werden, um Klumpen zu entfernen.</li>
	</ol></li>
	<li>CD3+ T-Zellen durch Negativselektion gemäß den Anweisungen des Herstellers isolieren (siehe Materialtabelle). Nach der magnetischen Trennung wird das Isolat in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und eine endgültige Lebendzellzählung durchgeführt.</li>
	<li>Die isolierten T-Zellen werden durch Zentrifugation für 10 min bei 450 x g bei 4 °C (oder RT) pelletiert und bei 1 x 106/ml in mTCM-Aktivierungsmedium resuspendiert (Tabelle 1).</li>
	<li>Aktivierung von T-Zellen durch Zugabe von murinen monoklonalen antiklonalen Antikörper-beschichteten Magnetkügelchen (siehe Materialtabelle) in einem Verhältnis von 25 μl/1 x 106 T-Zellen und 100 U/ml IL-2.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen bei 37 °C in einen Inkubator und lassen Sie sie über Nacht stehen. HINWEIS: Aufgrund der geringen Größe von T-Zellen kann eine genauere Anzahl lebender T-Zellen erreicht werden, indem sie im Verhältnis 1:10-1:20 verdünnt und im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau für die manuelle Zählung mit einem Hämozytometer gemischt wird. Die Reinheit kann durch Durchflusszytometrie bestimmt werden, indem Zellen mit einem fluoreszenzkonjugierten αCD3-Antikörper gefärbt werden. Jede Milz liefert je nach Alter und Stamm der Maus zwischen 7-10 x10 6 T-Zellen.</li>
</ol>3. Transduktion von murinen T-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie die Platten für die Transduktion vor (Tag-0-Verfahren).<ol><li>Unbehandelte sterile 24-Well-Platten mit 0,5 ml humanem Fibronektin-Transduktionsverstärker-Reagenz (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 20-40 μg/ml in sterilem PBS vorbeschichten und über Nacht bei 4 °C lagern. HINWEIS: Dieser Schritt kann auch an Tag 1 durchgeführt werden, indem unbehandelte 24-Well-Platten mit dem Transduktionsreagenz beschichtet und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchführung der T-Zell-Transduktion (Tag-1-Verfahren).<ol><li>Bereiten Sie die vorbeschichtete Platte für die Transduktion vor. Entfernen Sie das Transduktionsreagenz aus jeder Vertiefung der vorbeschichteten 24-Well-Platte und blockieren Sie es mit einem äquivalenten Volumen sterilfiltriertem PBS + 2 % Rinderserumalbumin (BSA) (0,5 ml) für 30 Minuten bei RT.</li>
		<li>Einmal mit 0,5-1 ml PBS waschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie 0,5-1 ml reines Retrovirus aus Schritt 1 oder verdünnt auf der Grundlage des Virustiters in jede vorbeschichtete Vertiefung und zentrifugieren Sie 90 Minuten lang bei 2.000 x g und 32 °C.</li>
	<li>1 ml aktivierte T-Zellen in jede viral beladene Vertiefung geben und 10 Minuten bei 450 x g und 32 °C zentrifugieren. Die Zellen werden über Nacht in einen 37 °C warmen Inkubator zurückgebracht.</li>
	<li>24 Stunden nach der Transduktion 1-1,5 ml des Zellkulturmediums entfernen und durch 1-1,5 ml mTCM-complete und 10 ng/ml rekombinantes humanes IL-7 und IL-15 ersetzen (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden wieder in einen 37 °C heißen Inkubator gegeben (Tag-2-Verfahren). HINWEIS: Während der Ex-vivo-Kultur müssen alle 48 Stunden 10 ng/ml Zytokine in die Kultur gegeben werden, und T-Zellen sollten nicht über 1 x 106/ml hinaus verdünnt werden.</li>
	<li>48 Stunden nach der Transduktion werden die Zellen von der Transduktionsplatte in eine frische 24-Well- oder 6-Well-Platte überführt und die Zellen in einen 37 °C-Inkubator zurückgeführt (Tag-3-Verfahren). HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der T-Zellen kann sich verbessern, indem die Zellen 24 Stunden bis 2 Tage nach der Transduktion übertragen werden, abhängig von der anfänglichen T-Zell-Lebensfähigkeit und dem Virustiter.</li>
	<li>Entschlüsseln Sie die T-Zellen und bestätigen Sie die CAR-Expression (Verfahren an Tag 5-6).<ol><li>Die Zellen werden gründlich resuspendiert, um aktivierte T-Zellen von den αCD3/CD28-beschichteten Kügelchen zu trennen (siehe Materialtabelle) und die Zellsuspension 30 s lang auf einem Magneten platziert. Die Zellsuspension wird in das gewünschte Ex-vivo-Kulturgefäß überführt und in einen 37 °C heißen Inkubator zurückgeführt. HINWEIS: T-Zellen können in Kulturflaschen oder Deep-Well-Kulturplatten kultiviert werden. Es wird empfohlen, mindestens 5 x 10 6-T-Zellen in 30 ml mTCM-vollständigem Medium pro Well in einem tiefen Well einer 6-Well-Formatplatte zu beschichten (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Bestimmung der CAR-Expression mittels Durchflusszytometrie8. HINWEIS: DIE GFP-CAR-Expression wurde durch Inkubation mit 100 ng/ml gereinigtem GFP bestimmt. Der Einbau eines N-terminalen Epitop-Tags wird die Detektion alternativer CAR-Konstrukte erleichtern.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchführung einer Ex-vivo-Kultur von CAR-T-Zellen (Verfahren an Tag 7-10).<ol><li>Während der Ex-vivo-Kultur werden die Zellen erhalten, indem 50 % des Kulturmediums entfernt und alle 48 h durch frisches mTCM-complete + 2x 10 ng/ml IL-7 und IL-15 ersetzt werden. HINWEIS: Murine CAR-T-Zellen sind 7 Tage nach der Aktivierung für den Einsatz in Downstream-Anwendungen bereit und sollten aufgrund schlechter Lebensfähigkeit nach dem Auftauen nicht kryokonserviert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

Optimiertes Protokoll für die Generierung von CAR-T-Zellen der Maus in syngenen Modellen

<ol>
	<li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy.">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li><li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies.">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li><li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment.">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li><li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine.">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).</li><li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression.">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li><li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. 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R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus.">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li><li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response.">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li><li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers.">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li><li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function.">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li><li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy:+Challenges+and+ways+forward.">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702 (2020).</li><li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy.">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li><li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics.">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li><li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells.">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).</li><li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8++T+lymphocytes.">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li></ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte deklariert.

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Reagenzien, die für die retrovirale Transduktion von murinen T-Zellen zur Generierung von CAR-T-Zellen für In-vivo-Studien erforderlich sind. Durch die Optimierung der retroviralen Transduktionsbedingungen wird eine robuste CAR-Expression erreicht, ohne dass eine Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation oder zusätzliche Reagenzien erforderlich ist. Es gibt jedoch mehrere Modifikationen, die auf diese Methodik angewendet werden können.
<p class="jove_conten...

Adoptive T-Zell-Therapien, die chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, haben das Gebiet der Krebsimmuntherapie revolutioniert, indem sie die Kraft des adaptiven Immunsystems nutzen, um antigenpositive Krebszellen spezifisch anzuvisieren und zu eliminieren1. Während der Erfolg von CAR-T-Zelltherapien, die auf maligne B-Zell-Erkrankungen abzielen, klinisch validiert wurde, sind präklinische Studien, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, für die Entwicklung neuer CARs, die auf solide Tumore abzielen, nach wie vor von entscheidender Bedeutung. Bisher konnte jedoch nur eine begrenzte klinische Wirksamkeit bei soliden Tumorindikationen nachgewiesen werden, und es wird immer deutlicher, dass einzelne präklinische Modelle die Pharmakodynamik und klinische Wirksamkeit eines lebenden Arzneimittels nicht genau vorhersagen 2,3. Daher haben die Forscher begonnen, die präklinische Studie mit CAR-T-Zellprodukten zu erweitern, um parallele Bewertungen in Xenotransplantat- und syngenen Modellen von menschlichen bzw. murinen Krebserkrankungen einzubeziehen.
Im Gegensatz zu Xenograft-Modellen, bei denen menschliche Tumore und T-Zellen in immundefiziente Mäuse transplantiert werden, ermöglichen syngene Modelle die Untersuchung von CAR-T-Zellantworten im Kontext eines funktionierenden Immunsystems. Insbesondere bieten immunkompetente Mäuse mit syngenen Tumoren ein System zur Untersuchung der Interaktion zwischen adoptiv übertragenen T-Zellen und kontextspezifischen Milieus - einschließlich tumorassoziierter Makrophagen (TAMs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs), von denen bekannt ist, dass sie die T-Zell-Funktion in der Tumormikroumgebung (TME) unterdrücken4,5,6. Darüber hinaus bieten syngene Modelle eine zusätzliche Plattform zur Bewertung der On-Target- und Off-Tumor-Toxizität und der Interaktion von CAR-T-Zellen mit Wirtsfaktoren, die zu zusätzlichen Toxizitäten führen können, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms7.
Trotz dieser Vorteile ist die Anzahl der syngenen CAR-T-Zellstudien nach wie vor begrenzt. Insbesondere erfordern syngene Modelle ein autologes Engineering von CAR-T-Zellen aus demselben Mausstamm und stellen daher eine zusätzliche Herausforderung dar, da es keine Methodik für eine effiziente murine T-Zell-Transduktion und ex vivo Expansion gibt 2,8. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, um eine stabile CAR-Expression durch die Produktion retroviraler Vektoren und eine optimierte T-Zell-Transduktion zu erreichen. Ein Schema des gesamten Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung dieses Ansatzes demonstriert eine effiziente retrovirale Transduktion von murinen CAR-T-Zellen und das Erreichen einer hohen CAR-Expression ohne die Notwendigkeit einer Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation. Neben der Co-Expression weiterer Transgene werden auch Strategien zur Veränderung der Antigenspezifität des CAR-Konstrukts diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm TC treated cell culture dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>130183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C, 6-8 week old&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-321-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet&#160;</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse T cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Rex6</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>80240M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-15&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-7</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-453-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD4 BV605</td>
			<td>BD</td>
			<td>563151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD44 APC&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD62L PE-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 60-0621-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD8 APC-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 25-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2 with Prime 95B camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31-985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Eco cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG.2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV_PGK_GFP28z</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified sfGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin (&#39;transduction reagent&#39;)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of murine chimeric antigen receptor (car)-t cells

Technisch hergestellte Zelltherapien, die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen verwenden, haben eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei Personen mit hämatologischen Malignomen erreicht und befinden sich derzeit in der Entwicklung für die Behandlung verschiedener solider Tumoren. Bisher erfolgte die vorläufige Evaluierung neuartiger CAR-T-Zellprodukte überwiegend in Xenograft-Tumormodellen mit immundefizienten Mäusen. Dieser Ansatz wurde gewählt, um die erfolgreiche Transplantation von humanen CAR-T-Zellen in der experimentellen Umgebung zu erleichtern. Syngene Mausmodelle, in denen Tumore und CAR-T-Zellen vom selben Mausstamm abstammen, erlauben jedoch die Evaluierung neuer CAR-Technologien im Kontext eines funktionierenden Immunsystems und einer umfassenden Tumormikroumgebung (TME). Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der Generierung von CAR-T-Zellen in der Maus zu rationalisieren, indem standardisierte Methoden für die retrovirale Transduktion und die ex vivo T-Zellkultur vorgestellt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können auf andere CAR-Konstrukte als die in dieser Studie verwendeten angewendet werden, um eine routinemäßige Evaluierung neuer CAR-Technologien in immunkompetenten Systemen zu ermöglichen.

Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der murinen T-Zell-Transduktion für die Generierung von CAR-T-Zellen der Maus zu standardisieren. Abbildung 1 enthält eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte. Der Prozess beginnt mit der Produktion retroviraler Vektoren durch Co-Transfektion von viralen Komponenten in Phoenix Eco-Zellen. Abbildung 2 zeigt die optimale Dichte der Phoenix Eco-Zellen am Tag der Transfektion. Isoli...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing CAR-T Cell Function in Syngeneic Tumor Models at JoVE.com

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der CAR-T-Zellfunktion in syngenen Tumormodellen 

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Unsere Forschung erforscht effektive Kombinationen von gentechnisch veränderten Bakterien und CAR-T-Zellen für die Behandlung solider Tumore. Für uns ist es wichtig, die Funktionsweise dieser beiden Zelltherapien im Kontext eines vollständigen Immunsystems anhand syngener Modelle von Eierstockkrebs zu untersuchen. Die Untersuchung der Funktion von CAR-T-Zellen in syngenen Tumormodellen wurde durch das Fehlen standardisierter Protokolle zur Generierung von murinen CAR-T-Zellen eingeschränkt.Murine T-Zellen lassen sich mit herkömmlichen Methoden nur schwer ex vivo in Kultur transduzieren. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um die Produktion von murinen CAR-T-Zellen zu rationalisieren, um Studien in syngenen Modellen zu ermöglichen, die einen wichtigen Kontext für die Bewertung der Aktivität neuer CAR-Technologien bieten.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

2.5K Aufrufe.  Columbia University. Unsere Forschung erforscht effektive Kombinationen von gentechnisch veränderten Bakterien und CAR-T-Zellen für die Behandlung solider Tumore. Für uns ist es wichtig, die Funktionsweise dieser beiden Zelltherapien im Kontext eines vollständigen Immunsystems anhand syngener Modelle von Eierstockkrebs zu untersuchen. Die Untersuchung der Funktion von CAR-T-Zellen in syngenen Tumormodellen wurde durch das Fehlen standardisierter Protokolle zur Generierung von murinen CAR-T-Zellen eingeschrän...

Serie: Autor im Rampenlicht: Verbesserung der CAR-T-Zellfunktion in syngenen Tumormodellen 

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Forschung

Biotechnik

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and cell-matrix interactions. Due to this complexity, recapitulation of lung development in vitro to promote differentiation of stem cells to lung epithelial cells has been challenging. In this protocol, decellularized lung scaffolds are used to mimic the 3-dimensional environment of the lung and generate stem cell-derived airway epithelial cells. Mouse embryonic stem cell are first differentiated to the endoderm lineage using an embryoid body (EB) culture method with activin A. Endoderm cells are then seeded onto decellularized scaffolds and cultured at air-liquid interface for up to 21 days. This technique promotes differentiation of seeded cells to functional airway epithelial cells (ciliated cells, club cells, and basal cells) without additional growth factor supplementation. This culture setup is defined, serum-free, inexpensive, and reproducible. Although there is limited contamination from non-lung endoderm lineages in culture, this protocol only generates airway epithelial populations and does not give rise to alveolar epithelial cells. Airway epithelia generated with this protocol can be used to study cell-matrix interactions during lung organogenesis and for disease modeling or drug-discovery platforms of airway-related pathologies such as cystic fibrosis.

This protocol efficiently directs mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm to mature airway epithelial cells. This differentiation technique uses 3-dimensional decellularized lung scaffolds to direct lung lineage specification, in a defined, serum-free culture setting.

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately burdensome to those living in low- and middle-income countries (LMICs), where the majority of deadly exposures to rabies occur. Different drug delivery strategies have been explored to condense vaccine regimens to a single injection by encapsulating antigens into polymeric particles. However, harsh stressors during the encapsulation process can cause denaturation of the encapsulated antigen. This article describes a method for encapsulating the rabies virus (RABV) antigen into polymeric microparticles that exhibit tunable pulsatile release. This method, termed Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), generates microparticles using soft lithography to create inverse polydimethylsiloxane (PDMS) molds from a multi-photon, 3D-printed master mold. Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) films are then compression-molded into the PDMS molds to generate open-faced cylinders that are filled with concentrated RABV using a piezoelectric dispensing robot. These microstructures are then sealed by heating the top of the particles, allowing the material to flow and form a continuous, nonporous polymeric barrier. Post-fabrication, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specific to the detection of intact trimeric rabies virus glycoprotein is used to confirm the high recovery of immunogenic antigen from the microparticles.

This method describes the encapsulation of the rabies antigen into biodegradable polymeric microparticles with structural and material properties that enable pulsatile release after a predetermined delay. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assessment of the antigen retrieved from the particle core confirms the presence of intact trimeric rabies virus glycoprotein through particle fabrication.

Herstellung pulsatiler polymerer Mikropartikel, die das Tollwutantigen verkapseln

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately ...

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cells. These modified cells have shown remarkable clinical responses in patients with hematologic malignancies. However, the high cost of producing these therapies and conducting extensive quality control assessments has limited their accessibility to a broader range of patients. To address this issue, many academic institutions are exploring the feasibility of in-house manufacturing of genetically modified cells, while adhering to guidelines set by national and international regulatory agencies.
Manufacturing genetically modified T cell products on a large scale presents several challenges, particularly in terms of the institution's production capabilities and the need to meet infusion quantity requirements. One major challenge involves producing large-scale viral vectors under Good Manufacturing Practice (GMP) guidelines, which is often outsourced to external companies. Additionally, simplifying the T cell transduction process can help minimize variability between production batches, reduce costs, and facilitate personnel training. In this study, we outline a streamlined process for lentiviral transduction of primary human T cells with a fluorescent marker as the gene of interest. The entire process adheres to GMP-compliant standards and is implemented within our academic institution.

This protocol outlines the process of transducing primary human T cells with a gene of interest, ensuring compatibility with Good Manufacturing Practice (GMP) standards.

Ein GMP-konformes Verfahren zur Erzeugung genmodifizierter T-Zellen

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...