Agradecemos a L. Brockmann pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por NIH 1R01EB030352 e UL1 TR001873.

Todos os procedimentos com animais foram realizados com aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolos AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) em camundongos fêmeas BALB/c ou CF57BL/6 com 6-8 semanas de idade, pesando entre 20-25 g. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Este protocolo é estruturado em torno dos "dias pós-ativação" das células T murinas, e a produção viral começa no Dia -2. O retrovírus pode ser armazenado a -80 °C após a produção inicial e, para uso futuro deste protocolo, pode-se iniciar com a etapa 2, isolamento e ativação de células T no Dia 0.
1. Produção de vetor retroviral
NOTA: Os produtos virais tornaram-se defeituosos de replicação pela separação dos genes de embalagem em dois plasmídeos separados (ver Tabela de Materiais), reduzindo consideravelmente a probabilidade de eventos de recombinação e produção inadvertida de vírus competente em replicação.
<ol><li>Preparar células Phoenix Eco um dia antes da transfecção (procedimento Dia -2).<ol><li>Placa aproximadamente 1 x 107 células em placa tratada com CT de 15 cm ou frasco de cultura T150, utilizando 30 mL de meio de cultura (meio de cultura Phoenix Eco, conforme detalhado na Tabela 1).</li>
		<li>Incubar durante a noite a 37 °C. Após 18-24 h, as células devem ser aproximadamente 70% confluentes e uniformemente distribuídas para garantir um alto rendimento viral sem crescimento excessivo. NOTA: Para obter os melhores resultados, use células com uma passagem baixa e passe-as no dia anterior ao plaqueamento para a produção viral. Não permita que as células Phoenix Eco cresçam demais durante a cultura de rotina.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar a mistura de transfecção contendo os reagentes de lipofecção e intensificador, pCL-Eco (Gag/Pol) e plasmídeo de expressão de pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) em meios de soro reduzido (ver Tabela de Materiais) (procedimento Dia -1). NOTA: A co-transfecção deve ser realizada na proporção de 1:1 de pMSCV e pCL-Eco.<ol><li>Preparar o tubo A: Diluir 105 μL do reagente de transfecção em 3,75 mL de meio de soro reduzido por placa de 15 cm e misturar completamente por vórtice ou pipetagem para cima e para baixo.</li>
		<li>Preparar o tubo B: diluir o plasmídeo de expressão de pMSCV (21 μg) e pCL-Eco (21 μg) com 90 μL de reagente intensificador em 3,75 mL de meio de soro reduzido por placa de 15 cm. Misture bem pipetando para cima e para baixo. NOTA: Se gerar vários produtos virais, configure uma mistura mestre contendo pCL-Eco e o reagente intensificador.</li>
		<li>Adicione o tubo A ao tubo B e misture bem por pipetagem. Incubar por 10-20 min à temperatura ambiente, resultando em um volume total de aproximadamente 7,5 mL.</li>
		<li>Remover cuidadosamente 10 mL de meio de cultura celular da(s) placa(s) Phoenix Eco e adicionar todo o volume da mistura de transfecção ao meio restante, inclinando a placa e pipetando gota a gota. Células de retorno para uma incubadora de 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Trocar a mídia em células Phoenix Eco transfectadas 16-20 h pós-transfecção (procedimento Dia 0).<ol><li>Meio de células T murino pré-aquecido e β-mercaptoetanol (2-ME, ver Tabela de Materiais) (colheita viral mTCM, conforme listado na Tabela 1) a 37 °C usando água ou banho de contas.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o meio de cultura Phoenix Eco inclinando a placa e colocando a ponta da pipeta no canto inferior, usando um vácuo, se possível. Evite secar demais as células.</li>
		<li>Adicione suavemente o meio de colheita mTCM-viral aquecido ao lado da placa inclinada pipetando 30 mL na configuração mais lenta. Células de retorno para uma incubadora de 37 °C. NOTA: Esta etapa pode fazer com que as células Phoenix Eco se desprenda da placa e reduzam os títulos virais. A mídia pré-aquecida e a pipetagem suave minimizarão a interrupção.</li>
	</ol></li>
	<li>Colher o sobrenadante viral 48 h pós-transfecção (procedimento Dia 1).<ol><li>Recolher o sobrenadante viral e filtrá-lo através de filtros PVDF de 0,45 μm (ver Tabela de Materiais) para remover células e detritos. Aliquot e congelar o vírus a -80 °C ou prosseguir diretamente para o Dia 1 da etapa 3 se estiver usando vírus novo.</li>
		<li>Determinar o título viral (unidades de transdução/mL) por citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente9. Esta etapa é opcional.<ol><li>Determinar o título viral por transdução em pequena escala de 1 x 105 células T murinas ativadas em placas de 96 poços tratadas com cultura de tecidos (TC) não tratadas com TC, pré-revestidas com retronectina (ver Tabela de Materiais) e carregadas com diluições seriadas triplas de sobrenadante retroviral em um volume final de 100 μL de meio de colheita viral mTCM. NOTA: Consulte as etapas 2 e 3 abaixo para obter instruções detalhadas sobre isolamento, ativação e transdução de células T.</li>
			<li>Determinar a expressão da superfície do CAR 4-5 dias após a transdução por citometria de fluxo.</li>
			<li>Calcular o título viral de acordo com a fórmula10: (N x F x D)/V, onde N é o número de células transduzidas, F é a frequência de células CAR-positivas, D é o fator de diluição e V é o volume de transdução em mL para obter unidades de transdução (UT)/mL. NOTA: O título viral pode diminuir após o congelamento/descongelamento; portanto, o título viral é idealmente determinado no vírus congelado e subsequentemente descongelado.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolamento de células T murinas
<ol><li>Isolar e ativar células T murinas (procedimento Dia 0). NOTA: Estas etapas podem ser realizadas à temperatura ambiente (TR) ou 4 °C e devem ser realizadas em um ambiente estéril.<ol><li>Colher o(s) baço(s) da cepa de camundongo de interesse (por exemplo, Balb/c, C57BL/6) conforme descrito anteriormente11 e obter uma suspensão unicelular por dissociação mecânica.</li>
		<li>Usando a parte de trás de uma seringa estéril, esmague o(s) baço(s) através de um filtro de células de 70-100 μm em um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Após deixar a seringa de lado, lave o filtro com 5 mL de tampão de isolamento de células T (solução salina tamponada com fosfato, PBS, suplementado com soro fetal bovino a 2%, FBS).</li>
		<li>Repita a etapa de trituração e lave o filtro novamente com 5 mL de tampão de isolamento de células T. Levar o volume final para 50 mL com tampão de isolamento de células T.</li>
		<li>Conte as células vivas usando um hemocitômetro manual ou um contador automático de células diluindo na proporção de 1:20 e, em seguida, misturando a 1:1 com azul de tripano.</li>
		<li>Pellet as células por centrifugação por 10 min a 450 x g, a 4 °C (ou RT), e ressuspender os espleenócitos a 1 x 108/mL se usar o kit de isolamento de células T recomendado (ver Tabela de Materiais). NOTA: Os espleenócitos podem ser re-esticados através de um filtro de 40-70 μm nesta fase para remover aglomerados.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolar células T CD3+ por seleção negativa seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Após a separação magnética, transferir o isolado para um tubo cônico de 15 mL e realizar uma contagem final de células vivas.</li>
	<li>Pastilhar as células T isoladas por centrifugação por 10 min a 450 x g, a 4 °C (ou RT), e ressuspendê-las a 1 x 106/mL em meio de ativação mTCM (Tabela 1).</li>
	<li>Ativar células T adicionando esferas magnéticas murinas revestidas com anticorpos monoclonais anti-CD3/anti-CD28 (ver Tabela de Materiais) na proporção de 25 μL/1 x 106 células T e 100 U/mL IL-2.</li>
	<li>Coloque as células numa incubadora a 37 °C e deixe-as durante a noite. NOTA: Devido ao pequeno tamanho das células T, uma contagem de células T vivas mais precisa pode ser obtida diluindo-se em uma proporção de 1:10-1:20 e misturando-se a 1:1 com azul de tripano para contagem manual usando um hemocitômetro. A pureza pode ser determinada por citometria de fluxo pela coloração das células com um anticorpo αCD3 conjugado fluorescentemente. Cada baço produzirá entre 7-10 x 106 células T, dependendo da idade e cepa do camundongo.</li>
</ol>3. Transdução de células T murinas
<ol><li>Preparar placas para transdução (procedimento Dia 0).<ol><li>Pré-revestir placas estéreis de 24 poços não tratadas com 0,5 mL de reagente intensificador de transdução de fibronectina humana (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 20-40 μg/mL, diluindo-o em PBS estéril e armazenando a 4 °C durante a noite. NOTA: Esta etapa também pode ser realizada no Dia 1 revestindo-se placas de 24 poços não tratadas com o reagente de transdução e incubando-as à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar transdução de células T (procedimento Dia 1).<ol><li>Prepare a placa pré-revestida para transdução. Remova o reagente de transdução de cada poço da placa pré-revestida de 24 poços e bloqueie com um volume equivalente de PBS filtrado estéril + albumina de soro bovino (BSA) a 2% (0,5 mL) por 30 min na RT.</li>
		<li>Lavar uma vez com 0,5-1 mL de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar 0,5-1 mL de retrovírus puro da etapa 1 ou diluído com base no título viral a cada poço pré-revestido e centrifugar por 90 min a 2.000 x g e 32 °C.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de células T activadas a cada poço carregado com vírus e centrifugar durante 10 minutos a 450 x g e 32 °C. Retornar as células para uma incubadora de 37 °C durante a noite.</li>
	<li>24 h após a transdução, remova 1-1,5 mL de meio de cultura celular e substitua-o por 1-1,5 mL de mTCM-completo e 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 humanas recombinantes (ver Tabela de Materiais). Células de retorno para uma incubadora de 37 °C (procedimento do dia 2). NOTA: Durante a cultura ex vivo , 10 ng/mL de citocinas devem ser adicionados à cultura a cada 48 h, e as células T não devem ser diluídas além de 1 x 106/mL.</li>
	<li>48 h após a transdução, transferir as células da placa de transdução para uma placa fresca de 24 ou 6 poços e retornar as células para uma incubadora de 37 °C (procedimento do Dia 3). NOTA: A viabilidade das células T pode melhorar transferindo células em 24 h a 2 dias após a transdução, dependendo da viabilidade inicial das células T e do título viral.</li>
	<li>De-bead as células T e confirmar a expressão CAR (procedimento Dia 5-6).<ol><li>Ressuspenda completamente as células para dissociar as células T ativadas das esferas revestidas com αCD3/CD28 (ver Tabela de Materiais) e coloque a suspensão celular em um ímã por 30 s. Transferir a suspensão celular para o recipiente de cultura ex vivo desejado e devolvê-la a uma incubadora a 37 °C. NOTA: As células T podem ser cultivadas em frascos de cultura ou placas de cultura de poço profundo. Recomenda-se plaquear um mínimo de 5 x 106 células T em 30 mL de meio mTCM-completo por poço em um poço profundo de uma placa de formato de 6 poços (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Determinar a expressão do CAR por citometria de fluxo8. Nota: A expressão de GFP-CAR foi determinada por incubação com 100 ng/mL de GFP purificada. A incorporação de um epítopo N-terminal facilitará a detecção de construções alternativas do CAR.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar cultura ex vivo de células CAR-T (procedimento Dia 7-10).<ol><li>Durante o cultivo ex vivo , manter as células removendo 50% do meio de cultura e substituindo-o por mTCM-completo fresco + 2x 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 a cada 48 h. NOTA: As células CAR-T murinas estão prontas para uso em aplicações a jusante 7 dias após a ativação e não devem ser criopreservadas devido à baixa viabilidade pós-descongelamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protocolo simplificado para geração de células CAR-T de camundongo em modelos singênicos

<ol>
	<li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy.">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li><li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies.">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li><li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment.">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li><li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine.">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).</li><li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression.">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li><li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. 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R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus.">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li><li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response.">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li><li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers.">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li><li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function.">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li><li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy:+Challenges+and+ways+forward.">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702 (2020).</li><li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy.">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li><li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics.">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li><li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells.">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).</li><li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8++T+lymphocytes.">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li></ol>

Não foram declarados conflitos de interesse.

Este protocolo descreve as etapas e reagentes necessários para a transdução retroviral de células T murinas para gerar células CAR-T para estudos in vivo . A otimização das condições de transdução retroviral alcança uma expressão robusta de CAR sem a necessidade de concentração viral por ultracentrifugação ou reagentes adicionais. No entanto, há múltiplas modificações que podem ser aplicadas a essa metodologia.
Enquanto este protocolo descreve a geração de exemp...

Terapias com células T que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) revolucionaram o campo da imunoterapia do câncer, aproveitando o poder do sistema imune adaptativo para atingir e eliminar especificamente células cancerosas antígeno-positivas1. Embora o sucesso das terapias com células CAR-T visando malignidades de células B tenha sido clinicamente validado, estudos pré-clínicos realizados em modelos animais permanecem vitais para o desenvolvimento de novos CARs direcionados a tumores sólidos. No entanto, a eficácia clínica limitada tem sido demonstrada em indicações de tumores sólidos até o momento, e está se tornando cada vez mais evidente que modelos pré-clínicos individuais não predizem com precisão a farmacodinâmica e a eficácia clínica de um medicamento vivo 2,3. Portanto, os pesquisadores começaram a expandir o estudo pré-clínico de produtos de células CAR-T para incluir avaliações paralelas em modelos de xenoenxerto e singênicos de cânceres humanos e murinos, respectivamente.
Ao contrário dos modelos de xenoenxerto, em que tumores humanos e células T são enxertadas em camundongos imunodeficientes, os modelos singênicos permitem o exame das respostas das células CAR-T no contexto de um sistema imunológico funcional. Especificamente, camundongos imunocompetentes portadores de tumores singênicos fornecem um sistema para estudar a interação entre células T transferidas adotivamente e meios contexto-específicos - incluindo macrófagos associados a tumores (TAMs) e células T reguladoras (Tregs) conhecidas por suprimir a função de células T no microambiente tumoral (TME)4,5,6. Além disso, os modelos singênicos oferecem uma plataforma adicional para avaliar a toxicidade no alvo, fora do tumor e a interação de células CAR-T com fatores do hospedeiro que podem levar a toxicidades adicionais, incluindo a síndrome de liberação de citocinas7.
Apesar dessas vantagens, o número de estudos singênicos com células CAR-T permanece limitado. Notadamente, modelos singênicos requerem engenharia autóloga de células CAR-T da mesma linhagem de camundongos e, portanto, apresentam um desafio adicional devido à falta de metodologia para transdução eficiente de células T murinas e expansão ex vivo 2,8. Este protocolo descreve os métodos para alcançar a expressão estável do CAR através da produção de vetores retrovirais e transdução otimizada de células T. Um esquema de todo o processo é mostrado na Figura 1. O uso desta abordagem demonstra a transdução retroviral eficiente de células CAR-T murinas e a obtenção de alta expressão de CAR sem a necessidade de concentração viral através da ultracentrifugação. Estratégias para alterar a antigenespecificidade do construto CAR são discutidas, além da co-expressão de transgenes adicionais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm TC treated cell culture dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>130183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C, 6-8 week old&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-321-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet&#160;</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse T cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Rex6</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>80240M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-15&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-7</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-453-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD4 BV605</td>
			<td>BD</td>
			<td>563151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD44 APC&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD62L PE-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 60-0621-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD8 APC-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 25-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2 with Prime 95B camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31-985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Eco cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG.2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV_PGK_GFP28z</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified sfGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin (&#39;transduction reagent&#39;)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of murine chimeric antigen receptor (car)-t cells

Terapias celulares projetadas utilizando células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) têm alcançado notável eficácia em indivíduos com neoplasias hematológicas e estão atualmente em desenvolvimento para o tratamento de diversos tumores sólidos. Até o momento, a avaliação preliminar de novos produtos de células CAR-T tem ocorrido predominantemente em modelos tumorais de xenoenxerto usando camundongos imunodeficientes. Esta abordagem é escolhida para facilitar o enxerto bem-sucedido de células CAR-T humanas no ambiente experimental. No entanto, modelos singênicos de camundongos, nos quais tumores e células CAR-T são derivados da mesma linhagem de camundongos, permitem a avaliação de novas tecnologias CAR no contexto de um sistema imunológico funcional e microambiente tumoral abrangente (TME). O protocolo aqui descrito visa agilizar o processo de geração de células CAR-T em camundongos, apresentando métodos padronizados para transdução retroviral e cultura ex vivo de células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outros construtos do CAR além dos utilizados neste estudo para permitir a avaliação rotineira de novas tecnologias do CAR em sistemas imunocompetentes.

O protocolo aqui descrito visa padronizar o processo de transdução de células T murinas para a geração de células CAR-T de camundongo. A Figura 1 fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas. O processo começa com a produção de vetores retrovirais via co-transfecção de componentes virais em células Phoenix Eco. A Figura 2 fornece uma imagem da densidade ideal de células Phoenix Eco no dia da transfecção. As células T isoladas ...

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Autor em destaque: Melhorando a função das células CAR-T em modelos de tumores singênicos 

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Nossa pesquisa explora combinações eficazes de bactérias projetadas e células T CAR para o tratamento de tumores sólidos. É importante para nós estudar como essas duas terapias celulares funcionam dentro do contexto de um sistema imunológico completo usando modelos singênicos de câncer de ovário. O estudo da função das células T CAR em modelos tumorais singênicos tem sido limitado pela falta de protocolos padronizados para a geração de células T CAR murinas.As células T murinas são particularmente difíceis de transduzir em cultura ex vivo usando métodos tradicionais. Desenvolvemos este protocolo para agilizar a produção de células T CAR murinas para possibilitar o estudo em modelos singênicos que fornecem contexto importante para avaliar a atividade de novas tecnologias CAR.

efficient-generation-of-murine-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

2.9K visualizações.  Columbia University. Nossa pesquisa explora combinações eficazes de bactérias projetadas e células T CAR para o tratamento de tumores sólidos. É importante para nós estudar como essas duas terapias celulares funcionam dentro do contexto de um sistema imunológico completo usando modelos singênicos de câncer de ovário. O estudo da função das células T CAR em modelos tumorais singênicos tem sido limitado pela falta de protocolos padronizados para a geração de células T CAR murinas.As célula...

Vídeo: Autor em destaque: Melhorando a função das células CAR-T em modelos de tumores singênicos 

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Bioengenharia

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and cell-matrix interactions. Due to this complexity, recapitulation of lung development in vitro to promote differentiation of stem cells to lung epithelial cells has been challenging. In this protocol, decellularized lung scaffolds are used to mimic the 3-dimensional environment of the lung and generate stem cell-derived airway epithelial cells. Mouse embryonic stem cell are first differentiated to the endoderm lineage using an embryoid body (EB) culture method with activin A. Endoderm cells are then seeded onto decellularized scaffolds and cultured at air-liquid interface for up to 21 days. This technique promotes differentiation of seeded cells to functional airway epithelial cells (ciliated cells, club cells, and basal cells) without additional growth factor supplementation. This culture setup is defined, serum-free, inexpensive, and reproducible. Although there is limited contamination from non-lung endoderm lineages in culture, this protocol only generates airway epithelial populations and does not give rise to alveolar epithelial cells. Airway epithelia generated with this protocol can be used to study cell-matrix interactions during lung organogenesis and for disease modeling or drug-discovery platforms of airway-related pathologies such as cystic fibrosis.

This protocol efficiently directs mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm to mature airway epithelial cells. This differentiation technique uses 3-dimensional decellularized lung scaffolds to direct lung lineage specification, in a defined, serum-free culture setting.

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately burdensome to those living in low- and middle-income countries (LMICs), where the majority of deadly exposures to rabies occur. Different drug delivery strategies have been explored to condense vaccine regimens to a single injection by encapsulating antigens into polymeric particles. However, harsh stressors during the encapsulation process can cause denaturation of the encapsulated antigen. This article describes a method for encapsulating the rabies virus (RABV) antigen into polymeric microparticles that exhibit tunable pulsatile release. This method, termed Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), generates microparticles using soft lithography to create inverse polydimethylsiloxane (PDMS) molds from a multi-photon, 3D-printed master mold. Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) films are then compression-molded into the PDMS molds to generate open-faced cylinders that are filled with concentrated RABV using a piezoelectric dispensing robot. These microstructures are then sealed by heating the top of the particles, allowing the material to flow and form a continuous, nonporous polymeric barrier. Post-fabrication, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specific to the detection of intact trimeric rabies virus glycoprotein is used to confirm the high recovery of immunogenic antigen from the microparticles.

This method describes the encapsulation of the rabies antigen into biodegradable polymeric microparticles with structural and material properties that enable pulsatile release after a predetermined delay. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assessment of the antigen retrieved from the particle core confirms the presence of intact trimeric rabies virus glycoprotein through particle fabrication.

Fabricação de Micropartículas Poliméricas Pulsáteis Encapsulando o Antígeno Rábico

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately ...

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cells. These modified cells have shown remarkable clinical responses in patients with hematologic malignancies. However, the high cost of producing these therapies and conducting extensive quality control assessments has limited their accessibility to a broader range of patients. To address this issue, many academic institutions are exploring the feasibility of in-house manufacturing of genetically modified cells, while adhering to guidelines set by national and international regulatory agencies.
Manufacturing genetically modified T cell products on a large scale presents several challenges, particularly in terms of the institution's production capabilities and the need to meet infusion quantity requirements. One major challenge involves producing large-scale viral vectors under Good Manufacturing Practice (GMP) guidelines, which is often outsourced to external companies. Additionally, simplifying the T cell transduction process can help minimize variability between production batches, reduce costs, and facilitate personnel training. In this study, we outline a streamlined process for lentiviral transduction of primary human T cells with a fluorescent marker as the gene of interest. The entire process adheres to GMP-compliant standards and is implemented within our academic institution.

This protocol outlines the process of transducing primary human T cells with a gene of interest, ensuring compatibility with Good Manufacturing Practice (GMP) standards.

Um procedimento compatível com GMP para a geração de células T modificadas por genes

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...