Makalenin eleştirel incelemesi için L. Brockmann'a teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH 1R01EB030352 ve UL1 TR001873 tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (Columbia Üniversitesi, AC-AABQ5551 ve AC-AAAZ4470 protokolleri) onayı ile 20-25 g ağırlığındaki 6-8 haftalık dişi BALB/c veya CF57BL/6 fareler kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Bu protokol, murin T hücrelerinin 'aktivasyonundan sonraki günler' etrafında yapılandırılmıştır ve viral üretim -2. günde başlar. Retrovirüs, ilk üretimden sonra -80 ° C'de saklanabilir ve bu protokolün gelecekteki kullanımı için, 0. günde 2. adım, T hücresi izolasyonu ve aktivasyonu ile başlanabilir.
1. Retroviral vektör üretimi
NOT: Viral ürünler, paketleme genlerinin iki ayrı plazmide ayrılmasıyla replikasyon kusurlu hale getirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu), rekombinasyon olayları olasılığını ve replikasyona yetkin virüsün yanlışlıkla üretilmesini büyük ölçüde azaltır.
<ol><li>Transfeksiyondan bir gün önce Phoenix Eco hücrelerini hazırlayın (Gün -2 prosedürü).<ol><li>30 mL kültür ortamı (Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi Phoenix Eco kültür ortamı) kullanarak, 15 cm TC ile muamele edilmiş bir plaka veya T150 kültür şişesinde yaklaşık 1 x10 7 hücre plakalayın.</li>
		<li>Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. 18-24 saat sonra, aşırı büyüme olmadan yüksek bir viral verim sağlamak için hücreler yaklaşık% 70 birleşik olmalı ve düzgün bir şekilde dağılmalıdır. NOT: En iyi sonuçlar için, düşük geçişli hücreler kullanın ve viral üretim için kaplamadan bir gün önce bunları geçirin. Phoenix Eco hücrelerinin rutin kültür sırasında aşırı büyümesine izin vermeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>İndirgenmiş serum ortamında lipofeksiyon ve arttırıcı reaktifler, pCL-Eco (Gag / Pol) ve pMSCV ekspresyon plazmidini (pMSCV_PGK_mGFP28z) içeren transfeksiyon karışımını hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) (Gün -1 prosedürü). NOT: Ko-transfeksiyon, pMSCV ve pCL-Eco'nun 1:1 oranında gerçekleştirilmelidir.<ol><li>Tüp A'yı Hazırlayın: 105 μL transfeksiyon reaktifini 15 cm'lik plaka başına 3.75 mL indirgenmiş serum ortamında seyreltin ve yukarı ve aşağı girdap veya pipetleme ile iyice karıştırın.</li>
		<li>Tüp B'yi hazırlayın: pMSCV ekspresyon plazmidini (21 μg) ve pCL-Eco'yu (21 μg) 90 μL arttırıcı reaktif ile 15 cm'lik plaka başına 3.75 mL indirgenmiş serum ortamına seyreltin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. NOT: Birden fazla viral ürün oluşturuyorsanız, pCL-Eco ve arttırıcı reaktif içeren bir ana karışım oluşturun.</li>
		<li>Tüp A'yı Tüp B'ye ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10-20 dakika inkübe edin, toplam hacim yaklaşık 7,5 mL'dir.</li>
		<li>Phoenix Eco plakasından/plakalarından 10 mL hücre kültürü ortamını dikkatlice çıkarın ve plakayı eğerek ve damla damla pipetleyerek transfeksiyon karışımının tüm hacmini kalan ortama ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfekte edilmiş Phoenix Eco hücrelerindeki ortamı, transfeksiyondan 16-20 saat sonra değiştirin (Gün 0 prosedürü).<ol><li>Bir su veya boncuk banyosu kullanarak serum ve β-merkaptoetanol (2-ME, Malzeme Tablosuna bakınız) içermeyen murin T hücresi ortamını ( Tablo 1'de listelendiği gibi mTCM-viral hasat) 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.</li>
		<li>Plakayı eğerek ve pipet ucunu alt köşeye yerleştirerek, mümkünse bir vakum kullanarak Phoenix Eco kültür ortamını dikkatlice çıkarın. Hücreleri aşırı kurutmaktan kaçının.</li>
		<li>Isıtılmış mTCM-viral hasat ortamını, en yavaş ayarda 30 mL pipetleyerek eğimli plakanın yan tarafına yavaşça ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun. NOT: Bu adım, Phoenix Eco hücrelerinin plakadan ayrılmasına ve viral titreleri azaltmasına neden olabilir. Önceden ısıtılmış ortam ve hassas pipetleme, bozulmayı en aza indirir.</li>
	</ol></li>
	<li>Viral süpernatanı transfeksiyondan 48 saat sonra hasat edin (1. gün prosedürü).<ol><li>Viral süpernatanı toplayın ve hücreleri ve kalıntıları gidermek için 0.45 μm PVDF filtrelerinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) süzün. Virüsü alın ve -80 °C'de dondurun veya taze virüs kullanıyorsanız doğrudan 3. adımın 1. gününe geçin.</li>
		<li>Daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrisi ile viral titreyi (dönüştürücü birimler / mL) belirleyin9. Bu adım isteğe bağlıdır.<ol><li>Doku kültürü (TC) ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakalarda 1 x 105 aktif murin T hücrelerinin küçük ölçekli transdüksiyonu ile viral titreyi belirleyin, retronektin ile önceden kaplanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu) ve 100 μL mTCM-viral hasat ortamının nihai hacminde retroviral süpernatantın üç kat seri dilüsyonları ile yüklenmiştir. NOT: T hücresi izolasyonu, aktivasyonu ve transdüksiyonu hakkında ayrıntılı talimatlar için aşağıdaki 2. ve 3. adımlara bakın.</li>
			<li>Akış sitometrisi ile transdüksiyondan 4-5 gün sonra CAR yüzey ekspresyonunu belirleyin.</li>
			<li>Viral titreyiformül 10'a göre hesaplayın: (N x F x D) / V, burada N dönüştürülen hücre sayısıdır, F, CAR pozitif hücrelerin frekansıdır, D seyreltme faktörüdür ve V, dönüştürücü birimler (TU) / mL elde etmek için mL cinsinden iletim hacmidir. NOT: Viral titre donma/çözülme üzerine azalabilir; Bu nedenle, viral titre ideal olarak donmuş ve daha sonra çözülmüş virüs üzerinde belirlenir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Murin T hücresi izolasyonu
<ol><li>Murin T hücrelerini izole edin ve aktive edin (Gün 0 prosedürü). NOT: Bu adımlar oda sıcaklığında (RT) veya 4 °C'de gerçekleştirilebilir ve steril bir ortamda gerçekleştirilmelidir.<ol><li>Dalak (lar) daha önce tarif edildiği gibi ilgilenilen fare suşundan (örneğin, Balb / c, C57BL / 6)hasat edin 11 ve mekanik ayrışma yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edin.</li>
		<li>Steril bir şırınganın arkasını kullanarak, dalakları 70-100 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik konik bir tüpe ezin.</li>
		<li>Şırıngayı bir kenara koyduktan sonra, süzgeci 5 mL T hücresi izolasyon tamponu (fosfat tamponlu salin, PBS,% 2 fetal sığır serumu, FBS ile desteklenmiş) ile yıkayın.</li>
		<li>Ezme adımını tekrarlayın ve süzgeci 5 mL T hücre izolasyon tamponu ile bir kez daha yıkayın. T hücresi izolasyon tamponu ile son hacmi 50 mL'ye getirin.</li>
		<li>Manuel hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri 1:20 oranında seyrelterek ve ardından 1:1'de tripan mavisi ile karıştırarak sayın.</li>
		<li>Hücreleri 450 x g'da, 4 °C'de (veya RT'de) 10 dakika santrifüjleme ile pelet yapın ve önerilen T hücresi izolasyon kitini kullanıyorsanız spleenositleri 1 x 108 / mL'de yeniden süspanse edin (bkz. NOT: Spleenositler, kümeleri çıkarmak için bu aşamada 40-70 μm'lik bir süzgeçten tekrar süzülebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>CD3+ T hücrelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek negatif seçimle izole edin (bkz. Malzeme Tablosu). Manyetik ayırmadan sonra, izolatı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve son bir canlı hücre sayımı yapın.</li>
	<li>İzole edilmiş T hücrelerini 450 x g'da, 4 ° C'de (veya RT'de) 10 dakika santrifüjleme ile pelet haline getirin ve mTCM aktivasyon ortamında 1 x 106 / mL'de yeniden süspanse edin (Tablo 1).</li>
	<li>25 μL / 1 x 106 T hücre ve 100 U / mL IL-2 oranında murin anti-CD3 / anti-CD28 monoklonal antikor kaplı manyetik boncuklar (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek T hücrelerini aktive edin.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca bırakın. NOT: T hücrelerinin küçük boyutu nedeniyle, bir hemositometre kullanılarak manuel sayım için 1:10-1:20 oranında seyreltilerek ve 1:1'de tripan mavisi ile karıştırılarak daha doğru bir canlı T hücresi sayımı elde edilebilir. Saflık, hücrelerin floresan konjuge αCD3 antikoru ile boyanmasıyla akış sitometrisi ile belirlenebilir. Her dalak, farenin yaşına ve türüne bağlı olarak 7-10 x 106 T hücre verecektir.</li>
</ol>3. Murin T hücresi transdüksiyonu
<ol><li>Transdüksiyon için plakaları hazırlayın (Gün 0 prosedürü).<ol><li>İşlem görmemiş steril 24 oyuklu plakaları 0.5 mL insan fibronektin transdüksiyon arttırıcı reaktif (Malzeme Tablosuna bakınız) ile steril PBS içinde seyrelterek 20-40 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda önceden kaplayın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın. NOT: Bu adım, işlem görmemiş 24 oyuklu plakaların transdüksiyon reaktifi ile kaplanması ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilmesiyle 1. günde de gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>T hücresi transdüksiyonu gerçekleştirin (1. gün prosedürü).<ol><li>Önceden kaplanmış plakayı transdüksiyon için hazırlayın. Transdüksiyon reaktifini önceden kaplanmış 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundan çıkarın ve RT'de 30 dakika boyunca eşdeğer hacimde steril filtrelenmiş PBS +% 2 sığır serum albümini (BSA) (0.5 mL) ile bloke edin.</li>
		<li>0.5-1 mL PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>1. adımdan itibaren 0.5-1 mL saf retrovirüs ekleyin veya önceden kaplanmış her bir kuyucuğa viral titreye göre seyreltilmiş ve 2.000 x g ve 32 ° C'de 90 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Viral olarak yüklenen her kuyuya 1 mL aktif T hücresi ekleyin ve 450 x g ve 32 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun.</li>
	<li>Transdüksiyondan 24 saat sonra, 1-1.5 mL hücre kültürü ortamını çıkarın ve 1-1.5 mL mTCM-tam ve 10 ng / mL rekombinant insan IL-7 ve IL-15 ile değiştirin (bkz. Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun (2. gün prosedürü). NOT: Ex vivo kültür sırasında, kültüre her 48 saatte bir 10 ng/mL sitokin eklenmeli ve T hücreleri 1 x 106/mL'nin üzerinde seyreltilmemelidir.</li>
	<li>Transdüksiyondan 48 saat sonra, hücreleri transdüksiyon plakasından yeni bir 24 oyuklu veya 6 oyuklu plakaya aktarın ve hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun (3. Gün prosedürü). NOT: T hücresi canlılığı, T hücresi canlılığına ve viral titreye bağlı olarak, transdüksiyondan 24 saat ila 2 gün sonra hücrelerin aktarılmasıyla iyileşebilir.</li>
	<li>T hücrelerini ayırın ve CAR ekspresyonunu onaylayın (Gün 5-6 prosedürü).<ol><li>Aktive edilmiş T hücrelerini αCD3/CD28 kaplı boncuklardan ayırmak için hücreleri iyice yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hücre süspansiyonunu 30 saniye boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu istenen ex vivo kültür kabına aktarın ve 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun. NOT: T hücreleri, kültür şişelerinde veya derin kuyu kültür plakalarında kültürlenebilir. 6 oyuklu formatlı bir plakanın derin bir kuyusunda oyuk başına 30 mL mTCM-tam ortamda en az 5 x 106 T hücrenin kaplanması önerilir (bkz.</li>
		<li>Akış sitometrisi ile CAR ekspresyonunu belirleyin8. NOT: GFP-CAR ekspresyonu, 100 ng/mL saflaştırılmış GFP ile inkübasyon ile belirlendi. Bir N-terminal epitop etiketinin dahil edilmesi, alternatif CAR yapılarının tespitini kolaylaştıracaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T hücrelerinin ex vivo kültürünü gerçekleştirin (7-10. gün prosedürü).<ol><li>Ex vivo kültür sırasında, kültür ortamının% 50'sini çıkararak ve her 48 saatte bir taze mTCM-tam + 2x 10 ng / mL IL-7 ve IL-15 ile değiştirerek hücreleri koruyun. NOT: Murin CAR-T hücreleri, aktivasyondan 7 gün sonra aşağı akış uygulamalarında kullanıma hazırdır ve çözülme sonrası zayıf canlılık nedeniyle dondurularak saklanmamalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Sinjeneik Modellerde Fare CAR-T Hücre Üretimi için Kolaylaştırılmış Protokol

<ol>
	<li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy.">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li><li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies.">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li><li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment.">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li><li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine.">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).</li><li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression.">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li><li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+new+roads+for+cars.">Paving new roads for cars.</a> Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).</li><li>Giavridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell-induced+cytokine+release+syndrome+is+mediated+by+macrophages+and+abated+by+il-1+blockade.">CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade.</a> Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).</li><li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression.">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).</li><li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus.">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li><li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells.">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299 (2021).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.">Lab Animal Research.</a> Sterile Tissue Harvest. , (2023).</li><li>Giordano-Attianese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+designed+chimeric+antigen+receptor+provides+a+small-molecule+safety+switch+for+t-cell+therapy.">A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy.</a> Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).</li><li>Kuhn, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response.">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li><li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers.">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li><li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function.">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li><li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy:+Challenges+and+ways+forward.">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702 (2020).</li><li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy.">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li><li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics.">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li><li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells.">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).</li><li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8++T+lymphocytes.">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan edilmedi.

Bu protokol, in vivo çalışmalar için CAR-T hücreleri üretmek üzere murin T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu için gerekli adımları ve reaktifleri açıklar. Retroviral transdüksiyon koşullarının optimize edilmesi, ultrasantrifüjleme veya ek reaktifler yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan sağlam CAR ekspresyonu sağlar. Ancak, bu metodolojiye uygulanabilecek birden fazla değişiklik vardır.
Bu protokol, GFP'ye özgü bir CAR'ın örnek oluşumunu aç?...

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR'lar) eksprese eden evlat edinen T hücresi tedavileri, antijen pozitif kanser hücrelerini spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için adaptif bağışıklık sisteminin gücünden yararlanarak kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır1. B hücreli maligniteleri hedef alan CAR-T hücre tedavilerinin başarısı klinik olarak doğrulanmış olsa da, hayvan modellerinde gerçekleştirilen klinik öncesi çalışmalar, katı tümörleri hedefleyen yeni CAR'ların geliştirilmesi için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar katı tümör endikasyonlarında sınırlı klinik etkinlik gösterilmiştir ve bireysel klinik öncesi modellerin canlı bir ilacın farmakodinamiğini ve klinik etkinliğini doğru bir şekilde tahmin etmediği giderek daha belirgin hale gelmektedir 2,3. Bu nedenle, araştırmacılar, CAR-T hücre ürünlerinin klinik öncesi çalışmasını, sırasıyla insan ve fare kanserlerinin ksenogreft ve sinjeneik modellerinde paralel değerlendirmeleri içerecek şekilde genişletmeye başladılar.
İnsan tümörlerinin ve T hücrelerinin immün yetmezliği olan farelere aşılandığı ksenogreft modellerinin aksine, sinjeneik modeller, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi bağlamında CAR-T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar. Spesifik olarak, sinjeneik tümörler taşıyan bağışıklığa yetkin fareler, tümör mikroçevresinde (TME) T hücresi fonksiyonunu baskıladığı bilinen tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar) ve düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) dahil olmak üzere, evlat edinilmiş olarak transfer edilen T hücreleri ile bağlama özgü ortamlar arasındaki etkileşimi incelemek için bir sistem sağlar4,5,6. Ayrıca, sinjeneik modeller, sitokin salınım sendromu7 dahil olmak üzere ek toksisitelere yol açabilecek konakçı faktörlerle hedefte, tümör dışı toksisiteyi ve CAR-T hücre etkileşimini değerlendirmek için ek bir platform sunar.
Bu avantajlara rağmen, sinjeneik CAR-T hücre çalışmalarının sayısı sınırlı kalmaktadır. Özellikle, sinjeneik modeller, aynı fare suşundan CAR-T hücrelerinin otolog mühendisliğini gerektirir ve bu nedenle, verimli murin T hücresi transdüksiyonu ve ex vivo genişleme için metodoloji eksikliği nedeniyle ek bir zorluk sunar 2,8. Bu protokol, retroviral vektörlerin üretimi ve optimize edilmiş T hücresi transdüksiyonu yoluyla kararlı CAR ekspresyonu elde etme yöntemlerini özetlemektedir. Tüm sürecin bir şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu yaklaşımın kullanımı, murin CAR-T hücrelerinin verimli retroviral transdüksiyonunu ve ultrasantrifüjleme yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan yüksek CAR ekspresyonunun elde edildiğini göstermektedir. CAR yapısının antijen özgüllüğünü değiştirme stratejileri, ek transgenlerin birlikte ekspresyonuna ek olarak tartışılmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm TC treated cell culture dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>130183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C, 6-8 week old&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-321-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet&#160;</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse T cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Rex6</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>80240M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-15&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-7</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-453-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD4 BV605</td>
			<td>BD</td>
			<td>563151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD44 APC&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD62L PE-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 60-0621-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD8 APC-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 25-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2 with Prime 95B camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31-985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Eco cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG.2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV_PGK_GFP28z</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified sfGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin (&#39;transduction reagent&#39;)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of murine chimeric antigen receptor (car)-t cells

Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerini kullanan tasarlanmış hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan bireylerde dikkate değer bir etkinlik elde etmiştir ve şu anda çeşitli katı tümörlerin tedavisi için geliştirilmektedir. Şimdiye kadar, yeni CAR-T hücre ürünlerinin ön değerlendirmesi, ağırlıklı olarak immün yetmezliği olan fareler kullanılarak ksenogreft tümör modellerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, deney ortamında insan CAR-T hücrelerinin başarılı bir şekilde aşılanmasını kolaylaştırmak için seçilmiştir. Bununla birlikte, tümörlerin ve CAR-T hücrelerinin aynı fare suşundan türetildiği sinjeneik fare modelleri, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi ve kapsamlı tümör mikroçevresi (TME) bağlamında yeni CAR teknolojilerinin değerlendirilmesine izin verir. Burada açıklanan protokol, retroviral transdüksiyon ve ex vivo T hücre kültürü için standartlaştırılmış yöntemler sunarak fare CAR-T hücre üretimi sürecini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bağışıklığı yeterli sistemlerde yeni CAR teknolojilerinin rutin olarak değerlendirilmesini sağlamak için bu çalışmada kullanılanların ötesinde diğer CAR yapılarına da uygulanabilir.

Adoptive T cell therapies expressing chimeric antigen receptors (CARs) have revolutionized the field of cancer immunotherapy by harnessing the power of the adaptive immune system to specifically target and eliminate antigen-positive cancer cells1. While the success of CAR-T cell therapies targeting B cell malignancies has been clinically validated, preclinical studies performed in animal models remain vital for the development of new CARs targeting solid tumors. However, limited clinical efficacy has been demonstrated in solid tumor indications thus far, and it is becoming increasingly apparent that individual preclinical models do not accurately predict the pharmacodynamics and clinical efficacy of a living medicine2,3. Therefore, investigators have begun to expand the preclinical study of CAR-T cell products to include parallel assessments in xenograft and syngeneic models of human and murine cancers, respectively.
Unlike xenograft models, where human tumors and T cells are engrafted into immunodeficient mice, syngeneic models enable the examination of CAR-T cell responses in the context of a functional immune system. Specifically, immune-competent mice bearing syngeneic tumors provide a system to study the interaction between adoptively transferred T cells and context-specific milieus - including tumor-associated macrophages (TAMs) and regulatory T cells (Tregs) known to suppress T cell function in the tumor microenvironment (TME)4,5,6. Moreover, syngeneic models offer an additional platform to assess on-target, off-tumor toxicity, and CAR-T cell interaction with host factors that may lead to additional toxicities, including cytokine release syndrome7.
Despite these advantages, the number of syngeneic CAR-T cell studies remains limited. Notably, syngeneic models require autologous engineering of CAR-T cells from the same mouse strain and thus present an additional challenge due to the lack of methodology for efficient murine T cell transduction and ex vivo expansion2,8. This protocol outlines the methods to achieve stable CAR expression through the production of retroviral vectors and optimized T cell transduction. A schematic of the entire process is shown in Figure 1. The use of this approach demonstrates efficient retroviral transduction of murine CAR-T cells and the achievement of high CAR expression without the need for viral concentration through ultracentrifugation. Strategies to change the antigen-specificity of the CAR construct are discussed in addition to the co-expression of additional transgenes.

Yazar Spotlight: Sinjeneik Tümör Modellerinde CAR-T Hücre Fonksiyonunun Geliştirilmesi 

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Burada açıklanan protokol, fare CAR-T hücrelerinin üretilmesi için murin T hücresi transdüksiyon sürecini standartlaştırmayı amaçlamaktadır. Şekil 1 , ilgili adımların ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Süreç, viral bileşenlerin Phoenix Eco hücrelerine birlikte transfeksiyonu yoluyla retroviral vektörlerin üretilmesiyle başlar. Şekil 2 , transfeksiyon gününde Phoenix Eco hücrelerinin optimal yoğunluğunun bir görünt...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing CAR-T Cell Function in Syngeneic Tumor Models at JoVE.com

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Araştırmamız, katı tümör tedavisi için tasarlanmış bakteri ve CAR T hücrelerinin etkili kombinasyonlarını araştırıyor. Bu iki hücre tedavisinin, yumurtalık kanserinin sinjeneik modellerini kullanarak tam bir bağışıklık sistemi bağlamında nasıl çalıştığını incelemek bizim için önemlidir. Sinjeneik tümör modellerinde CAR T hücrelerinin işlevinin incelenmesi, murin CAR T hücreleri üretmek için standartlaştırılmış protokollerin olmaması nedeniyle sınırlandırılmıştır.Murin T hücrelerinin, geleneksel yöntemler kullanılarak ex vivo kültürde transdüksiyonu özellikle zordur. Bu protokolü, yeni CAR teknolojilerinin aktivitesini değerlendirmek için önemli bağlam sağlayan sinjeneik modellerde çalışmayı mümkün kılmak için murin CAR T-hücrelerinin üretimini kolaylaştırmak için geliştirdik.

efficient-generation-of-murine-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

2.4K Görüntüleme.  Columbia University. Araştırmamız, katı tümör tedavisi için tasarlanmış bakteri ve CAR T hücrelerinin etkili kombinasyonlarını araştırıyor. Bu iki hücre tedavisinin, yumurtalık kanserinin sinjeneik modellerini kullanarak tam bir bağışıklık sistemi bağlamında nasıl çalıştığını incelemek bizim için önemlidir. Sinjeneik tümör modellerinde CAR T hücrelerinin işlevinin incelenmesi, murin CAR T hücreleri üretmek için standartlaştırılmış protokollerin olmaması nedeniyle sı...

Video: Yazar Spotlight: Sinjeneik Tümör Modellerinde CAR-T Hücre Fonksiyonunun Geliştirilmesi 

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological malignancies and are presently undergoing development for the treatment of diverse solid tumors. So far, the preliminary evaluation of novel CAR-T cell products has predominantly taken place in xenograft tumor models using immunodeficient mice. This approach is chosen to facilitate the successful engraftment of human CAR-T cells in the experimental setting. However, syngeneic mouse models, in which tumors and CAR-T cells are derived from the same mouse strain, allow evaluation of new CAR technologies in the context of a functional immune system and comprehensive tumor microenvironment (TME). The protocol described here aims to streamline the process of mouse CAR-T cell generation by presenting standardized methods for retroviral transduction and ex vivo T cell culture. The methods described in this protocol can be applied to other CAR constructs beyond the ones used in this study to enable routine evaluation of new CAR technologies in immune-competent systems.

This protocol streamlines retroviral vector production and murine T cell transduction, facilitating the efficient generation of mouse CAR-T cells.