RPE-assoziierte Störungen sind nach wie vor ein wichtiger Teil der Vermischung von Krankheiten, jedoch ohne wirksame Überreste in der virtuellen Kultur von primären RPE-Zellen, die als gutes Modell für physiologische und pathologische Studien von RPE-assoziierten Störungen dienen könnten. In diesem Protokoll stellen wir ein einfach zu befolgendes Protokoll zur Kultivierung primärer IPCs zur Verfügung, das spätere RP-Eigenschaften schnell wiederherstellen und aufrechterhalten könnte. Wir glauben, dass Menschen mit dieser Methode schnell RP-Zellen aus Makistat-Studien und den schützenden Medikamenten-Screenings erzeugen könnten, die die Entwicklung neuer Behandlungen für RPE-Störungen erleichtern könnten. Eine Schritt-für-Schritt-Demonstration des Wertes wird es viel einfacher machen, diese Methode in verschiedenen Laboratorien zu replizieren, die RP-Zellen untersuchen möchten.
Um zu beginnen, tauen Sie das Gewebeverdauungsenzym Malaquad auf und sterilisieren Sie 1X PBS. Ergänzt mit 2 % Penicillin und 2 % Streptomycin durch Filtration der Lösung durch eine 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheit. Waschen Sie die Vertiefungen der Kulturplatte und der Transwell-Einsätze mit 1X PBS.
Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette aus den Vertiefungen und Transwells und geben Sie einen Milliliter frisches 1X PBS in die untere Kammer und 600 Mikroliter 10 Mikrogramm pro Milliliter Lamininlösung in die obere Kammer. Inkubieren Sie die Platten und Transwell-Einsätze in diesem Heliciculture-Inkubator über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Danach entfernen Sie die Laminatlösung aus der oberen Kammer und waschen Sie zweimal mit einem Milliliter kaltem 1X PBS, bevor Sie die Zelle einsetzen. Reinigen Sie die Laminat-Flow-Haube mit 75% Ethanol und UV-Licht.
Bereiten Sie drei sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit etwa 25 Millilitern 75%igem Ethanol, drei sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit etwa 25 Millilitern 1X PBS und drei 10-cm-sterile Zellkulturschalen mit etwa 15 Millilitern 1X PBS vor. Weichen Sie vier Schweineaugäpfel in etwa 15 Milliliter 75% Ethanol in einer 10 Zentimeter großen Petrischale ein und schneiden Sie mit einer Schere und einer Pinzette das restliche Bindegewebe und die Muskeln ab. Um die Augäpfel zu dekontaminieren, tränken und waschen Sie vier Augäpfel in drei sterilen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, die nacheinander mit 75% Ethanol gefüllt sind.
Waschen Sie dann die Augäpfel nacheinander in drei sterilen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, die mit 1X PBS gefüllt sind. Drehen Sie die Schläuche jede Minute um, um die Augäpfel gründlich zu waschen. Bewegen Sie die vier Augäpfel in eine 10 Zentimeter große sterile Zellkulturschale mit 1X PBS.
Schneiden Sie die äußere Oberfläche jedes Augapfels erneut ab, um den Sehnerv und kleine Trümmer zu entfernen. Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt am Schnittpunkt von Limbus und Sklera zu machen. Und dann entfernen Sie die Hornhaut, die Iris, die Linse, den Glaskörper und die neurale Netzhaut.
Übertragen Sie den RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in eine neue 10-Zentimeter-Zellkulturschale und machen Sie vier Schnitte, um die Augenmuschel in die Form eines vierblättrigen Kleeblatts zu glätten. Führen Sie Ausflüge in die Verdauung von EDTA-Lösungen durch, indem Sie die vier RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe in eine neue 10-Zentimeter-Schale geben und 20 Milliliter frische Trypsin-EDTA-Lösung gießen, um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe zu verschmelzen. Stellen Sie die Schale für fast 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Nach 30 Minuten nehmen Sie die Schale aus dem Inkubator und geben Sie 20 Milliliter vorwarme Zellkulturmedien mit 10% FBS in die Schale. Um die Trips in der EDTA-Lösung zu neutralisieren, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Transferpipette, um die RPE-Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals zu dissoziieren. Sammeln Sie die Zellsuspensionen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie dann vorsichtig weitere 10 Milliliter frisches Nährmedium mit FBS, um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe auf der Schale zu waschen.
Sammeln Sie die RPE-Zellen, indem Sie die Röhrchen bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den SuperAgent mit einer Pipette ab und fügen Sie weitere fünf Milliliter Nährmedien mit FBS hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Zentrifuge bei 300 g für weitere fünf Minuten.
Dekantieren Sie den SuperAgent und suspendieren Sie die Zellen mit 12 Milliliter Nährmedien. Als nächstes werden 100.000 bis 200.000 Zellen pro Vertiefung in 12 Well-Kulturplatten oder Transwell-Einsätze gesät. Wechseln Sie die Nährmedien alle zwei Tage und reduzieren Sie die Serumkonzentration auf 1%, wenn die Zellen die Oberfläche der Vertiefungen pro Einsatz vollständig bedecken.
Wechseln Sie die Nährmedien alle zwei Tage, bis die Zellen geerntet sind. Die repräsentativen Bilder der primären porcinen RPE-Zellen am zweiten, sechsten und 10. Tag sind hier zu sehen. Die QRTPCR-Analyse der mRNA-Spiegel von Signaturgenen in primären porcinen RPE-Zellen, primären humanen RPE-Zellen, ARPE-19-Zellen und porcinem RPE-Aderhautgewebe wird durch dieses grafische Bild detektiert.
Hier wurde GAP DH als Housekeeping-Gen für RTPCR verwendet. Vier biologische Replikate wurden für primäre porcine RPE-Zellen und eine RPE 19-Zelle verwendet, während drei biologische Replikate für primäre humane RPE-Zellen und porcines RPE-Aderhautgewebe verwendet wurden. Die Genexpressionsniveaus in ARPE-19-Zellen wurden als Kontrollen festgelegt.
Die westliche Blutanalyse von RPE-65-Proteinen in ARPE-19- und porcinen RPE-Zellen sowie in primären humanen RPE-Zellen und porcinen RPE-Aderhautgeweben ist in dieser Abbildung dargestellt. Vinculin wurde hier als Belastungskontrolle eingesetzt. Diese Abbildung zeigt eine zweiwöchige Kultur von porcinen RPE-Zellen in DMEM-Basic-Medien mit 1%FBS.
Zellen, die mit oder ohne Lamin kultiviert wurden, wurden mit RPE 65, Natrium-Kalium-APTAs, Z01 und Hex gefärbt. TR-Messungen in Zellblättern, die mit oder ohne Laminin kultiviert wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die westliche Blutanalyse des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) und des Pigmentepithel-abgeleiteten Faktors (PEDF) in primären porcinen RPE- und ARPE-19-Zellen ist in dieser Abbildung dargestellt.
In diesen Bildern werden die sektoralen Funktionen von kultivierten primären porcinen RPE- und ARPE-19-Zellen dargestellt. Der größte Teil dieses Protokolls besteht darin, RP-Zellen aus RPE-Chide-Glia-Komplexen aufzulösen. Wir empfehlen, jedes Mal frische Trips und Lösungen zu verwenden und die Verdauungszeit richtig zu kontrollieren, um acht RP-Zellen aufzulösen.
