Dieses Protokoll wird einen einfachen und effizienten Weg zur erfolgreichen Isolierung primärer pigmentierter Epithelzellen der Maus skizzieren. Retinale pigmentierte Epithelzellen spielen eine sehr wichtige Rolle, um die Photorezeptorzellen zu erhalten und die normale Funktion der Netzhaut zu gewährleisten. Unser Labor isoliert primäre pigmentierte Epithelzellen der Maus als wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der äußeren Blut-Netzhaut-Barriere und verwandter Krankheiten wie altersbedingter Makuladegeneration.
Um die Mausaugen zu extrahieren, euthanasieren Sie die Maus ethisch nach den von Ihrer Institution zugelassenen Methoden, legen Sie dann die Maus auf eine sterile Unterlage und kernisieren Sie das Auge, indem Sie eine 5/45-Pinzette auf den Orbitalbereich drücken, um Proptose zu induzieren, dann bewegen Sie die Pinzette zum hinteren Teil des Auges und ziehen Sie vorsichtig, um das Auge zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Sehnerv noch intakt ist. Tauchen Sie die Augen mit einer Pinzette in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 5% Povidon-Jod enthält. Inkubieren Sie die Augen bei Raumtemperatur für 2 bis 3 Minuten.
Entfernen Sie die Augen vom Povidonjod und legen Sie sie in eine Petrischale. Während Sie eine sterile Transferpipette verwenden, waschen Sie die Augen mit Hanks' Balanced Saline Solution, bis die orange Farbe des Povidon-Jods verschwunden ist. Dies dauert ungefähr 2 bis 3 Wäschen.
Legen Sie die Augen in eine neue Petrischale und tauchen Sie sie in kalte, vollständige RPE-Zellwachstumsmedien. Von dort aus können Sie mit dem Sezieren unter einem Seziermikroskop beginnen. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pinzette und / oder eine Vannas-Schere, um Bindegewebe in extraokularen Muskeln zu ziehen oder wegzuschneiden.
Die Augen können dann eine Stunde lang in kalten RPE-Zellkulturmedien gehalten werden. Es wird jedoch bevorzugt, nach der Reinigung des Augapfels direkt mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Übertragen Sie die Augen in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das das Enzym A-Lösung enthält, und inkubieren Sie die Augen dann 40 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie die Augen aus der Enzym-A-Lösung und legen Sie sie in ein neues 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das die Enzym-B-Lösung enthält, legen Sie sie dann in einen Inkubator und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Entfernen Sie die Augen von Enzym B und legen Sie sie in eine 60-Millimeter-Petrischale und tauchen Sie sie und vervollständigen Sie RPE-Zellwachstumsmedien, dann inkubieren Sie die Augen bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten. Stellen Sie die Schale unter das Seziermikroskop und beginnen Sie mit dem Sezieren.
Verwenden Sie eine M5S-Pinzette und eine Nadel einer Spritze, um einen Schnitt im Ora Seratta-Abschnitt zu machen. Fassen Sie nun mit zwei Pinzetten den inneren Teil des Einschnitts mit einer Pinzette und greifen Sie die Hornhaut mit der anderen Zange. Beginnen Sie, die Hornhaut langsam von der Netzhaut zu reißen, indem Sie die Hornhaut ziehen.
Achten Sie darauf, in kleinen Schritten zu reißen und die Träne nach unten zu bewegen, während Sie die Hornhaut entfernen. Dadurch wird sichergestellt, dass der RPE größtenteils intakt bleibt und Sie einen saubereren Riss erhalten. Sobald die Hornhaut vollständig abgelöst ist, sollten Sie die Iris und die Linse sehen können.
Entfernen Sie sowohl die Iris als auch die Linse mit einer Pinzette, um die Reinheit der Isolierung zu erhalten. Um die neuronale Netzhaut von der RPE-Schicht zu entfernen, greifen Sie die äußere Schicht der Augenmuschel mit einer Pinzette und positionieren Sie einen Arm einer zweiten Pinzette zwischen der RPE- und der Neuralschicht. Von dort ziehen oder schöpfen Sie die neuronale Netzhaut vorsichtig von der RPE-Schicht weg und werfen Sie dann die neuronale Netzhaut weg.
Verschieben Sie die RPE-Ebene an eine andere Stelle auf der Schale, frei von Ablagerungen. Um die RPE von Aderhaut und Sklera zu trennen, kratzen Sie die Innenseite der Augenmuschel vorsichtig mit einer 5/45-Pinzette ab, um die Trennung der RPE-Zellen sicherzustellen. Die RPE-Zellen erscheinen trüb, wenn sie suspendiert und vollständig RPE-Zellwachstumsmedien sind.
Die Zellen werden mit einer sterilen 3,2-Milliliter-Transferpipette abgesaugt und in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit kompletten RPE-Zellwachstumsmedien überführt. Die Zellen können bei 300g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert werden. Sie können dann den Überstand aussaugen und das Pellet in erwärmten RPE-Zellwachstumsmedien resuspendieren.
Die Zellen auf eine 100-Millimeter-Petrischale legen und bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 inkubieren. Diese Bilder zeigen eine erfolgreiche Isolierung bei Passage 0 und Passage 1, was sich in der Pigmentierung der RPE-Zellen zeigt. Bei Passage 4 werden die Zellen weniger charakteristisch und weisen weniger Pigment auf, zeigen ein spindelartiges Aussehen oder werden mit einer größeren Oberfläche robuster.
Wir validierten die RPE-Zellen mit einem RPE-spezifischen Marker, RPE65 und einem Zytoskelettprotein F-Aktin. Wir überprüften auch auf eine mögliche Kontamination mit Muller-Zellen durch Färbung mit einem Muller-Zell-spezifischen Marker, Vimentin. Dieses Protokoll ist eine vereinfachte Anpassung bestehender Protokolle.
Das Protokoll verwendet Materialien und zugehörige Geräte, die in den meisten Forschungslabors verfügbar sind, was dazu beiträgt, primäre RPE-Zellen der Maus effektiv zu isolieren.
