Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (R03NS131908) und dem Verteidigungsministerium im Rahmen des Multiple Sclerosis Research Program unter der Fördernummer W81XWH-22-1-0517 unterstützt. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium unterstützt. Diese Studie wurde auch von Startup-Fonds der East Carolina University unterstützt.

Alle Eingriffe mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit den experimentellen Richtlinien durchgeführt, die vom East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden. In dieser Studie wurden weibliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6J im Alter von 8-10 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). EAE wurde nach zuvor veröffentlichten Berichteninduziert 12,13,14.
1. Serum-Entnahme
<ol><li>Die Versuchsmaus wird durch CO2 -Erstickung oder Isofluran-Überdosierung zum erforderlichen Zeitpunkt (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) nach Induktion von EAE über MOG35-55-Immunisierung eingeschläfert. HINWEIS: Die Gesamtzahl der Mäuse und die Zeitpunkte für die Serumentnahme können je nach Experiment variieren.</li>
	<li>Nachdem das Fehlen von Vitalparametern durch Einklemmen der Zehen oder des Schwanzes bestätigt wurde, legen Sie die Maus in eine dorsale Liegeposition auf ein Präpariertablett und befestigen Sie die Gliedmaßen mit Stecknadeln oder Klebeband in Position. Richten Sie den Mauskörper auf die LED-Lichtquelle aus (siehe Materialtabelle), um den Brustkorb des Tieres zu beleuchten.</li>
	<li>Besprühen Sie das Mausfell mit 70%igem Ethanol und machen Sie mit der Dissektorschere einen Mittellinienschnitt von 3-4 cm entlang des Bauches vom Becken bis zum Xiphoid, wobei Sie darauf achten, Organe und größere Gefäße zu vermeiden (Abbildung 1A-C). Um den Eingriff zu erleichtern, greifen Sie mit der Pinzette die Haut über den Xiphoid-Prozess.</li>
	<li>Schneiden Sie das Zwerchfell seitlich durch und schneiden Sie dann den Brustkorb an beiden Seitenkanten mit der Federschere nach vorne, bis Sie vor dem Brustbein an der Mittellinie aufhören (Abbildung 1D). Falten Sie die Rippenklappe, die über dem Mauskopf erstellt wurde, um das Herz freizulegen (Abbildung 1E). HINWEIS: Das Durchtrennen des Brustbeins sollte vermieden werden, da dies die an den Knochen angrenzenden Hauptbrustarterien schädigt und das Volumen des Blutes, das entnommen werden kann, verringert.</li>
	<li>Führen Sie eine 25-G-Nadel, die mit einer 1-ml-Spritze verbunden ist, in den linken Ventrikel ein und sammeln Sie das Blut, indem Sie den Kolben vorsichtig zurückziehen (Abbildung 1F). Um die Nadelpunktion zu erleichtern, stützen Sie das Herz vorsichtig gegen eine Pinzette. HINWEIS: Wenn das Blut nicht sofort in die Spritze eindringt, sollte die Nadel langsam gedreht und ein anderer Winkel getestet werden. Es sollten jedoch Anstrengungen unternommen werden, um die Nadel beim ersten Versuch richtig zu platzieren, um unnötige Löcher im Herzen zu vermeiden, aus denen Blut austreten kann.</li>
	<li>Füllen Sie das Blut in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und lassen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen. Entfernen Sie das Gerinnsel durch Zentrifugation bei 2000 × g für 20 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand, der die Serumfraktion darstellt, und lagern Sie Einweg-Aliquots in Kryoröhrchen bei -80 °C für zukünftige Tests.</li>
</ol>2. ELISA-Assay
<ol><li>Resuspendieren Sie das lyophilisierte MOG35-55-Peptid (siehe Materialtabelle) in Wasser, um eine Brühe von 10 mg/ml zu erhalten. Verdünnen Sie vor Beginn des Experiments den Stamm auf 10 μg/ml in Beschichtungspuffer (siehe Materialtabelle) und pipettieren Sie 100 μl/Vertiefung der endgültigen Lösung in eine 96-Well-Platte. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebefolie, um eine Verdunstung zu vermeiden, und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4 °C. HINWEIS: Für jede Probe sollten mindestens 2 Wells berechnet werden, und 2 zusätzliche Wells sollten ebenfalls für eine Blindkontrolle einbezogen werden.</li>
	<li>Parallel dazu wird die gleiche Anzahl von Vertiefungen mit 100 μl/Vertiefung Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet, das in Beschichtungspuffer bei einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst ist. Diese zusätzlichen Wells dienen als Hintergrundsteuerelemente. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Kontrollvertiefungen mit BSA zu beschichten, da die Beschichtungs- und Blockierungspuffer unterschiedliche Zusammensetzungen haben. Bitte beachten Sie, dass andere enzephalitogene Peptide (wie PLP139-151 oder MBP84-104) als irrelevante Antigene als Alternative zu BSA verwendet werden können.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte am nächsten Tag 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, die mit 0,05 % Tween 20 (PBS-T) ergänzt wird. Anschließend werden 100 μl/Vertiefung einer Blockierungslösung aus 3 % BSA in PBS (ohne Tween 20) zugegeben und die Platte 1 h lang bei 37 °C in einem Hybridisierungsofen inkubiert.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung PBS-T. Verdünnen Sie jede Serumprobe 1:100 in Blockierungslösung und geben Sie 100 μl/Well in MOG35-55- und BSA-beschichtete Wells. Geben Sie das gleiche Volumen der Blockierungslösung in die Vertiefungen, die als Leerproben gekennzeichnet sind. Inkubieren Sie die Platte verschlossen für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln (250 U/min).</li>
	<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung PBS-T. Verdünnen Sie den HRP-konjugierten Sekundärantikörper (1:2000, siehe Materialtabelle) in einer Lösung aus 0,2 % BSA in PBS-T und geben Sie 100 μl/Well in alle Wells. Inkubieren Sie die Platte verschlossen für 1 h bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln (250 U/min).</li>
	<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung PBS-T. Geben Sie 100 μl/Vertiefung 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat (siehe Materialtabelle) in alle Vertiefungen und inkubieren Sie 1-5 Minuten lang im Dunkeln, wobei Sie die Entwicklung einer blauen Farbe überwachen.<ol><li>Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 μl/Vertiefung Stopplösung hinzufügen (siehe Materialtabelle) und messen Sie die optische Dichte (OD) in jeder Vertiefung mit einem Plattenlesegerät, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist. HINWEIS: Das TMB-Substrat sollte 30-60 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert werden, bevor es in die Vertiefungen gegeben wird.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Datenanalyse
<ol><li>Füllen Sie eine Excel-Tabelle mit den von der Platte gelesenen OD-Werten aus. Mittelwert der OD-Werte, die aus doppelten Vertiefungen (sowohl MOG35-55 als auch BSA-beschichtet) für jede Probe erhalten wurden.</li>
	<li>Subtrahieren Sie für jede Probe den Mittelwert der BSA-beschichteten Vertiefungen von dem der mit MOG35 bis 55 beschichteten Vertiefungen. Die resultierenden hintergrundkorrigierten Werte sind proportional zur Konzentration von Anti-MOG35-55-Antikörpern in den verschiedenen Serumproben. HINWEIS: Leere Vertiefungen sollten zu korrigierten Werten um 0 führen.</li>
	<li>Wenden Sie einen nicht-parametrischen statistischen Test an, z. B. den Mann-Whitney-U-Test, um die durchschnittlichen OD-Werte zwischen zwei experimentellen Bedingungen zu vergleichen. Fügen Sie mindestens 3 unabhängige Stichproben für jede Bedingung hinzu.</li>
</ol>

Untersuchung der humoralen Reaktion bei der autoimmunen Demyelinisierung

<ol>
	<li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li><li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions.">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li><li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis.">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis.">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li><li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li><li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+multiple+sclerosis:+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies.">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li><li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis.">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li><li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li><li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology.">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li><li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease.">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis.">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation.">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li><li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).</li><li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam.">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Hier wurde über ein einfaches und effizientes ELISA-basiertes Protokoll berichtet, um die humorale Reaktion in einem relevanten Tiermodell der MS-Pathologie genau zu quantifizieren. Diese Methode wurde kürzlich eingesetzt, um die neuartige Rolle des Ataxin-1-Proteins bei der Kontrolle der Serumspiegel von Autoantikörpern im MOG35-55/C57BL6J EAE-Paradigma12 zu beschreiben. In diesem Zusammenhang sollten eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, um mit dieser Methode konsistente und biologi...

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die durch fokale Infiltration von Immunzellen in das Hirnparenchym, den Abbau von Myelinscheiden, die Axone umhüllen, die Gliaaktivierung und neuronalen Verlust gekennzeichnetist 1. Zusätzlich zu der gut etablierten Rolle pathogener T-Zellen haben mehrere Beweise die Beteiligung von B-Zellen an der Vermittlung der Autoimmunantwort gegen das ZNS hervorgehoben. B-Zellen durchlaufen im MS-Gehirn eine klonale Expansion, und Antikörper gegen Myelinkomponenten wurden in demyelinisierten Läsionen nachgewiesen 2,3. Die selektive Aktivierung von peripheren B-Zellen zu Beginn der Erkrankung wurde kürzlich dokumentiert, was auf eine mögliche Rolle dieses Immunzellkompartiments bei der Krankheitsauslösung hindeutet4. Der Erfolg von B-Zell-depletierenden Therapien wie monoklonalen Anti-CD20-Antikörpern bestätigt den mechanistischen Zusammenhang zwischen einer aberranten B-Zell-Funktion und der autoimmunen Demyelinisierung 5,6. Aus molekularer Sicht können B-Zellen über die Präsentation von Autoantigenen, die entzündungsfördernde Zytokinsekretion und die autoreaktive Antikörperproduktion zu Krankheiten beitragen.
Es wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um spezifische Merkmale des komplexen MS-Phänotyps zu rekapitulieren. Unter ihnen ist die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) das am weitesten verbreitete In-vivo-Paradigma und beruht auf der Immunisierung von Versuchstieren mit kurzen Peptiden, die von Myelinproteinen wie dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) und dem Myelin-Basisprotein (MBP) abgeleitet sind7. EAE-immunisierte Tiere entwickeln eine demyelinisierende Pathologie, die der MS in vielen Aspekten ähnelt, einschließlich einer robusten humoralen Reaktion gegen das enzephalitogene Peptid8. Aus diesem Grund haben EAE-Studien maßgeblich dazu beigetragen, die Funktion von B-Zellen und Autoantikörpern im Rahmen von Krankheiten zu entschlüsseln. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass MOG-spezifische Antikörper, die von MS-Patienten isoliert wurden, den klinischen Verlauf in EAE-Modellen verschlimmern können9. Insbesondere wurde gezeigt, dass der Prolinrest an Position 42 in humanem MOG entscheidend für die Bestimmung der Autoantikörper-Pathogenitätist 10. In jüngerer Zeit wurde festgestellt, dass MOG-spezifische Autoantikörper die Krankheit nicht nur fördern, indem sie den Myelinverlust vermitteln, sondern auch die Reaktivierung autoreaktiver T-Zellen im ZNS verstärken11. 
Unter Berücksichtigung der Bedeutung von Antikörperreaktionen bei der ZNS-Autoimmunität wird in diesem Artikel ein ELISA-basiertes Protokoll zur effizienten Messung der Serumspiegel von autoreaktiven Antikörpern in C57BL/6J-Mäusen vorgestellt, die mit dem MOG35-55-Peptid immunisiert wurden. Im ersten Teil des Protokolls wird die Methode zur Serumgewinnung mittels intrakardialer Punktion beschrieben. Anschließend werden die Verfahren zur Einrichtung des ELISA-Assays und zur Erfassung der Daten detailliert beschrieben. Zuletzt wird die Datenanalyse und -interpretation diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N301</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive seals</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J female mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-500-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S111022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA coating buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421701</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Analysis spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1030-05</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AMPSILED21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-377-575&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MOG35-55 peptide</td>
			<td>EZBiolab</td>
			<td>cp7203</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-12-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>445-0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of autoreactive antibodies in mice upon experimental autoimmune encephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Krankheitsmodell, das die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose (MS) auf histopathologischer und molekularer Ebene rekapituliert. EAE wird durch Immunisierung von Versuchstieren durch subkutane Injektion von kurzen Myelinpeptiden zusammen mit spezifischen Adjuvantien induziert, um die Immunantwort zu verstärken. Wie das menschliche Gegenstück entwickeln EAE-Mäuse demyelinisierende Läsionen, die Infiltration von Immunzellen in das Zentralnervensystem (ZNS), die Aktivierung von Gliazellen und neuronale Verletzungen. Eine konsistente Evidenz unterstützt auch eine mechanistische Rolle der B-Zell-Dysfunktion in der Ätiologie von MS und EAE. B-Zellen können sowohl als Antigen-präsentierende Zellen als auch als primäre Quelle für entzündungsfördernde Zytokine und Autoantikörper dienen. Bei der EAE werden Antikörper gegen die Myelinpeptide gebildet, die zur Induktion der Krankheit eingesetzt wurden. Es wurde gezeigt, dass solche Autoantikörper entweder den Myelinverlust oder die pathogene Reaktivierung von T-Zellen im ZNS vermitteln. Dieser Artikel beschreibt ein effizientes ELISA-basiertes Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von C57BL/6J-Mäusen, die mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein 35-55 (MOG35-55)-Peptid immunisiert wurden. Die vorgeschlagene Methode dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Spezifität und das Ausmaß der aberranten humoralen Reaktion im Zusammenhang mit der autoimmunen Demyelinisierung zu untersuchen.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by focal infiltration of immune cells into the brain parenchyma, breakdown of myelin sheaths wrapping axons, glia activation, and neuronal loss1. In addition to the well-established role of pathogenic T cells, multiple lines of evidence have highlighted the involvement of B cells in mediating the autoimmune response against the CNS. B cells undergo clonal expansion in the MS brain and antibodies against myelin components have been detected within demyelinated lesions2,3. The selective activation of peripheral B cells at disease onset has been recently documented, suggesting a putative role for this immune cell compartment in disease initiation as well4. The success of B cell-depleting therapies such as anti-CD20 monoclonal antibodies further corroborates the mechanistic connection between aberrant B cell functioning and autoimmune demyelination5,6. From a molecular standpoint, B cells can contribute to disease via autoantigen presentation, pro-inflammatory cytokine secretion, and autoreactive antibody production.
Multiple animal models have been developed to recapitulate specific features of the complex MS phenotype. Among them, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used in vivo paradigm and relies on the immunization of experimental animals with short peptides derived from myelin proteins such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP)7. EAE immunized animals develop a demyelinating pathology that resembles MS in many aspects, including a robust humoral response against the encephalitogenic peptide8. For this reason, EAE studies have been instrumental in dissecting the function of B cells and autoantibodies in the context of disease. For instance, it was demonstrated that MOG-specific antibodies isolated from MS patients can aggravate the clinical course in EAE models9. Notably, the proline residue at position 42 in human MOG was shown to be critical for determining autoantibody pathogenicity10. More recently, MOG-specific autoantibodies have been found to promote disease not only by mediating myelin loss but also via boosting the reactivation of autoreactive T cells within the CNS11. 
Considering the importance of antibody responses in CNS autoimmunity, this article presents an ELISA-based protocol to efficiently measure the serum levels of autoreactive antibodies in C57BL/6J mice EAE immunized with MOG35-55 peptide. In the first part of the protocol, the method to collect serum via intracardiac puncture will be described. Subsequently, the procedures to set up the ELISA assay and acquire the data will be detailed. Lastly, data analysis and interpretation will be discussed.

Autor im Rampenlicht: Neuartiger Assay zur Untersuchung von B-Zell-Antworten in der Multiple-Sklerose-Forschung

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

So the focus of our laboratory is to understand the molecular basis of multiple sclerosis, a immune disease of the central nervous system that is characterized by demyelination, neuroinflammation, and axonal injury. So this protocol represent an economical and flexible alternatives to commercial kits. Our can be easily adjusted to test B-cell antibody responses against different EEA peptides.My lab is devoted to further understanding the connection between neuroinflammation and neurodegeneration in chronic neurological diseases such as multiple sclerosis.

Um die Robustheit des vorliegenden ELISA-Assays zu demonstrieren, wurde die Methode an Serumproben getestet, die aus einer Kohorte von weiblichen C57BL/6J-Mäusen 20 Tage nach der Immunisierung (dpi) mit 100 μg MOG35-55-Peptid in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) nach einem validierten EAE-Induktionsprotokollisoliert wurden 12,13,14. Die Tiere erhielten außerdem an Tag 0 und 2 400 ng Pertussis-Toxin. Als Negativkontrollen d...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

Der Schwerpunkt unseres Labors liegt daher auf dem Verständnis der molekularen Grundlagen der Multiplen Sklerose, einer Immunerkrankung des zentralen Nervensystems, die durch Demyelinisierung, Neuroinflammation und axonale Schädigung gekennzeichnet ist. Dieses Protokoll stellt somit eine kostengünstige und flexible Alternative zu kommerziellen Kits dar. Unsere können leicht angepasst werden, um B-Zell-Antikörperantworten gegen verschiedene EEA-Peptide zu testen.Mein Labor widmet sich dem besseren Verständnis des Zusammenhangs zwischen Neuroinflammation und Neurodegeneration bei chronischen neurologischen Erkrankungen wie Multipler Sklerose.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

499 Aufrufe.  East Carolina University. Der Schwerpunkt unseres Labors liegt daher auf dem Verständnis der molekularen Grundlagen der Multiplen Sklerose, einer Immunerkrankung des zentralen Nervensystems, die durch Demyelinisierung, Neuroinflammation und axonale Schädigung gekennzeichnet ist. Dieses Protokoll stellt somit eine kostengünstige und flexible Alternative zu kommerziellen Kits dar. Unsere können leicht angepasst werden, um B-Zell-Antikörperantworten gegen verschiedene EEA-Peptide zu testen.Mein Labor widmet s...

Serie: Autor im Rampenlicht: Neuartiger Assay zur Untersuchung von B-Zell-Antworten in der Multiple-Sklerose-Forschung

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

Forschung

Immunologie und Infektion

Serum Collection via Intracardiac Puncture in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Immunized Mice

Serumgewinnung durch intrakardiale Punktion bei experimentellen Mäusen mit Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) Immunisierung

Quantification of Autoantibodies in the Serum of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Immunized Mice Using ELISA

Begin by re-suspending the lyophilized MOG 35 55 peptide in water. Dilute the peptide stock to 10 micrograms per milliliter in coating buffer before the experiment. Now pipette 100 microliters of the final solution into wells of a 96 well plate.Simultaneously coat an equal number of wells with 100 microliters of BSA dissolved in coating buffer. Seal the plate with an adhesive film to prevent evaporation and incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, perform three washes of the plate with 200 microliters of PBS supplemented with 0.5%tween 20.Subsequently add 100 microliters per well of a blocking solution composed of 3%BSA in PBS. Incubate the sealed plate for one hour at 37 degrees Celsius in a hybridization oven. After incubation, wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST.Dilute each serum sample obtained from the blood of EAE immunized mice in blocking solution and add 100 microliters per well to both MOG 35 55 and BSA coated wells. Add the same volume of blocking solution to designated blank wells. Incubate the sealed plate for two hours at room temperature with constant shaking.After incubation, remove the plate from the incubator and rinse the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Dilute the HRP conjugated secondary antibody in a solution consisting of 0.2%BSA in PBST and add 100 microliters to each well. Incubate the sealed plate for one hour at room temperature maintaining constant shaking.Wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Add 100 microliters of three, three prime, five, five prime tetramethyl benzidine substrate to each well. Incubate in the dark for one to five minutes monitoring the development of a blue color.Add 100 microliters of stop solution to each well. Then use a plate reader set at a wavelength of 450 nanometers to measure the optical density in each well. The optical density values of the EAE samples were significantly higher than the control samples indicating a robust immunoglobulin G response against the MOG peptide.