Unsere Forschung konzentriert sich auf die Leukämie, insbesondere auf myelodysplastische Syndrome oder myelodysplastische Neoplasien. Es handelt sich um eine Stammzellerkrankung, die aus hämatopoetischen Stammzellen hervorgeht. Es betrifft verschiedene Blutzelllinien, insbesondere die erythroide Linie, die für die Produktion von Herzblutzellen verantwortlich ist.
Eine Störung dieser Linie kann zu einer Anämie führen, die häufig bei MDS-Patienten auftritt. Die Pipeline, die wir in diesem Artikel vorstellen, ermöglicht eine robuste und vereinfachte Methode zur Bewertung der menschlichen Erythroblasteneffizienz in vitro nach Genmodifikation oder medikamentöser Behandlung. Hämatopoetische Stammzellen sind von der Geburt bis zum letzten Moment unseres Lebens vorhanden.
Es gibt kein mehrwertiges Gewebe in unserem Organismus, in dem täglich Billionen von Zellen produziert werden. Es gibt noch so viele Dinge zu verstehen, daher werden wir diese erstaunlichen Zellen in gesunden Aminogeweben weiter untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf Proteostase und RNA-Biologie liegt. Tauen Sie zunächst 100.000 CD34+UCB-Zellen auf, indem Sie das Fläschchen 30 Sekunden lang in ein auf 37 Grad Celsius eingestelltes Wasserbad tauchen.
Geben Sie einen Milliliter Auftaumedium tropfenweise in die Durchstechflasche und resuspendieren Sie die Zellen dann vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren. Übertragen Sie die resuspendierte Zellsuspension Tropfen für Tropfen in fünf Milliliter Auftaumedium. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer mit DNAse. Nachdem Sie die Zellen erneut zentrifugiert haben, resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Stimulationsmedium. Übertragen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in eine 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte vier bis sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Anschließend werden die Zellen in fluoreszenzaktivierten Zellsortierröhrchen gesammelt und mit einem Milliliter Stammzellmedium aufgefüllt. Nach dem Auftauen des Virus wird das Stimulationsmedium mit dem erforderlichen Volumen versehen, um eine Infektionsmehrheit von 30 zu erreichen. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in virushaltigen Medien mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro 100 Mikroliter Virus und überführen Sie sie in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte.
Geben Sie PBS in die leeren Vertiefungen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie dann das gesamte Volumen der Zellsuspension aus der Vertiefung der 96-Well-Platte in FACS-Röhrchen mit einem Milliliter Stammzellmedium. Waschen Sie die Vertiefung und die Pipettenspitze mit Stammzellmedium, um zwei Milliliter Stammzellmedium in das FACS-Röhrchen zu geben.
Nach dem Zentrifugieren des FACS-Röhrchens wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in zwei Millilitern Expansionsmedium resuspendiert. Übertragen Sie die Suspension in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen. Übertragen Sie zunächst das gesamte Volumen der CD34+-Zellen, die mit dem EGFP-Reporter transduziert wurden, in ein separates FACS-Röhrchen.
Bei 320 g acht Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 100 Mikrolitern FACS-Puffer. Geben Sie fünf Mikroliter CD34-Antikörper pro Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Anschließend werden die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer, der DAPI enthält, resuspendiert und acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem Sie die Zellen in 200 Mikrolitern DAPI-haltigem FACS-Puffer resuspendiert haben, filtrieren Sie die Zellsuspension vor der Sortierung durch ein 40-Mikrometer-Sieb. Fügen Sie als Nächstes 0,5 Mikroliter CD34-Antikörper zu einem Tropfen Kügelchen in 100 Mikrolitern PBS hinzu.
Inkubieren Sie die Mischung im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Fügen Sie dann einen Milliliter PBS zu der Mischung hinzu. Acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern PBS. Als nächstes geben Sie GFP-negative und GFP-positive Leukämiezellen in ein FACS-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer.
Nach dem Zentrifugieren der Zellen werden 100.000 GFP-negative Zellen und 100.000 GFP-positive Zellen in jeweils 500 Mikrolitern FACS-Puffer resuspendiert. Filtrieren Sie die Zellsuspension vor der Sortierung durch ein 40-Mikrometer-Sieb. Sammeln Sie dann die sortierten Zellen in Stammzellmedium.
Die Zellen werden acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern erythroiden Differenzierungsmedien. Geben Sie nun einen Milliliter der resuspendierten Zellen in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
Füllen Sie alle äußeren Vertiefungen mit PBS. Um das Medium aufzufrischen, stellen Sie sicher, dass sich die Zellen am Boden der Platte abgesetzt haben. Lehnen Sie die Platte vorsichtig an und entfernen Sie 500 Mikroliter Medium.
Fügen Sie dann 500 Mikroliter 2X Zytokin-Erythroid-Differenzierungsmedium hinzu, um die Platte aufzufrischen. Übertragen Sie die Zellen am sechsten Tag auf eine 12-Well-Platte und geben Sie einen Milliliter Medium in jede Vertiefung, um ein endgültiges Volumen von zwei Millilitern zu erreichen. Sammeln Sie 200 Mikroliter Zellen aus jeder Vertiefung der 12-Well-Platte.
Ersetzen Sie das entfernte Volumen durch 250 Mikroliter 2X erythroides Differenzierungsmedium. Geben Sie einen Milliliter FACS-Puffer in jedes Sammelröhrchen. Nach dem Zentrifugieren der Röhrchen werden die pelletierten Zellen in 100 Mikrolitern FACS-Puffer resuspendiert.
Geben Sie je einen Mikroliter CD71-, CD34- und CD235a-Antikörper in die Röhrchen. Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer, der DAPI enthält. Die Röhrchen werden acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern FACS-Puffer mit DAPI. Legen Sie DAPI im Vergleich zu Side Scatter oder SSC fest, um tote Zellen auszuschließen. Legen Sie die SSC-Höhe im Vergleich zum SSC-Bereich fest, um Aggregate auszuschließen und einzelne Zellen auszuwählen.
Legen Sie die Streufläche nach vorne im Vergleich zum SSCA fest, um Ablagerungen basierend auf der Größe zu entfernen. Legen Sie CD235a gegen CD71 fest. Legen Sie CD34 im Vergleich zu SSCA fest.
Run beads GFP-positive Zellen und DAPI-gefärbte Zellen. Kompensieren Sie die Messwerte und wenden Sie die Kompensation auf die Zytometereinstellungen an. CD34-positive Zellen aus Nabelschnurblut zeigten einen Anstieg der Annexin-V-positiven apoptotischen Zellen von 14,4 % am vierten Tag auf 34,2 % am 17. Tag.
Das Balkendiagramm zeigt einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes der Annexin V-positiven Zellen bis zum Tag 17 auf etwa 40 %
