Die Autoren danken der Forschungs Durchflusszytometrie Kern am Cincinnati Children Hospital Research Foundation und Richard Demarco, Sherree Freund und Scott Mordecai aus der Amnis Corporation (Teil der EMD Milllipore) für kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt K08HL088126 und R01HL116352 (TAK) und P30 DK090971 (YZ).

1. Langzeit-In-vitro-Kultur Erythropoese (Ex-vivo-Differenzierung Erythroide Kultur-Protokolls durch Giarratana et al. 8, modifiziert und für Mouse Cells Angepasst) Dies ist ein 3-Schritt-Langzeit-in-vitro Erythropoese-Protokoll. Im ersten Schritt (Tag 0-4) 2 x 10 5 Zellen / ml in Wachstumsmedium Erythroblasten mit Stammzellfaktor (SCF), Interleukin-3 (IL-3), Erythropoietin (Epo) ergänzt platziert. Im zweiten Schritt (Tage 5-6), werden die Zellen mit 2 × 10 5 Zellen resuspendiert / ml und co-kultiviert auf adhärenten Stromazellen (MS5) in frischem Wachstumsmedium nur Erythroblasten mit Epo supplementiert. Im dritten Schritt (Tage 7-9), sind Zellen, die auf einer Schicht von MS-5-Zellen in frischem Wachstumsmedium ohne Erythroblasten Cytokine bis zu Enukleation (1A) kultiviert. Alle Tier Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der zugelassenenCincinnati Children s Hospital Medical Center. <ol><li> Ernte von Knochen und Isolierung von Low-Density-Knochenmarkzellen <ol><li> 2 ml sterile IMDM mit 2% fetales Rinderserum (FBS) in einem 15 ml konischen Röhrchen und auf Eis zu halten. </li><li> Euthanize einen 2-6 Monate alten Wildtyp-Maus C57/BL6 (zusammen mit oder ohne gentechnisch gezielt Maus von Interesse) folgende Institutionen genehmigten Protokoll (z. B. CO 2-Inhalation, gefolgt durch Genickbruch). </li><li> Isolieren Beckenknochen, Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen und beider Beine mit Pinzette und Skalpell, fügen sie dem Röhrchen mit IMDM + 2% FBS und auf Eis zu halten. </li><li> 1 ml IMDM + 2% FBS in einer sterilen Durchflusszytometrie Rohr und bündig Knochen mit einer Pinzette und eine Tuberkulin-Spritze mit einer 25-G x 5/8 &quot;-Nadel. Flush IMDM + 2% FBS durch die Knochen ein paar Mal sanft ( durch Ansaugen von ~ 500 &amp;mgr; l aus der Zellsuspension und erneut Spülen durch den Knochen) und Sammeln der Knochenmarkzellen in den Strom-cytometry Rohr. Flushing ist beendet, wenn die Knochen weiß erscheinen. </li><li> Filterzellensuspension durch ein 40 &amp;mgr; m-Zellsieb Satz auf einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschzelle Sieb mit IMDM + 2% FBS und mit dem gleichen Medium einzustellen Endvolumen der Zellsuspension in 5 ml. </li><li> Bereiten niedriger Dichte Knochenmarkzellen (LDBM) durch Dichtegradientenzentrifugation: sorgfältig die Schicht 5 ml Zellsuspension auf 5 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium 1,083 g / ml in einen 15-ml-Tube und Spin bei 750 g für 25 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Bremse / niedriger Beschleunigung. </li><li> Überstand (alles bis zu der 2-ml-Marke des 15-ml-Tube, um Buffy-Coat erwerben) in ein neues 15-ml-Tube und führen Sie eine weitere Wäsche mit IMDM + 2% FBS bei 525 g für 5 min bei RT. </li><li> Überstand wird abgesaugt und lysieren die verbleibenden roten Blutzellen (RBC) durch Suspendieren des Pellets in 3 ml RBC-Lyse-Puffer für 5 min bei RT. Wenn eine größere Reinheit der Erythroblasten istin der letzten Stufe (zB für biochemische Untersuchungen) erforderlich ist, zu reinigen LDBM Zellen weiter bei diesem Schritt Lin neg Zellen durch magnetische Trennung. </li></ol></li><li> Ex vivo erythroide Differenzierung Kultur Protokoll ab LDBM oder Lin neg Zellen (Fig. 1A) <ol><li> 7 hinzuzufügen ml IMDM + 2% FBS, Schleudern bei 525 × g für 5 min bei RT und Resuspendieren der pelletierten Zellen in 2 ml Erythroblasten-Wachstumsmedium (EGM), bestehend aus: ein. StemPro-34-Medium, das b. 2,6% StemPro-34-Medium zu ergänzen, c. 20% BIT-9500, d. 900 ng / ml Eisensulfat, E. 90 ng / ml Eisennitrat, f. 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin g. 10 &amp;supmin; &amp;sup6; M Hydrocortison h. und frisch zuge Zytokine: i) 100 ng / ml SCF, ii) 5 ng / ml IL-3, und iii) 3 IU / ml Epo. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler oder manuell an ein Mikroskop mit einem Saumocytometer. </li><li> Platte in einer 6-Well-Zellkulturplatte in einer Konzentration von 5 x 10 5 Zellen / Vertiefung auf ein Endvolumen von 2,5 ml in EGM (2 x 10 5 LDBM Zellen / ml) und Inkubation bei 37 ° C (dies wird als als Tag der Kultur # 0). </li><li> Änderungsmedium durch Absaugen 1,5 ml des Überstandes, Schleudern bei 525 × g für 5 min bei RT, resuspendiert in 1,5 ml frisches Medium, das alle 3 Zytokine und Zugabe täglich zurück in die Vertiefungen an den Tagen Nr. 2, 3, 4, zu optimieren Proliferationsphase. Am Tag 3, entfernen Sie alle Zellen zählen und aufgeteilt in entsprechende Anzahl von Brunnen, um gut zu Zellkonzentrationen von ~ 2 x 10 5 Zellen / ml zu erhalten. Aufrechterhaltung bei 37 C / 5% CO 2 °. </li><li> Am Tag 4 Platte MS5 Zellen (Maus-Stroma-Zelllinie) in die Vertiefungen einer neuen Zellkultur-6-Well-Platte. Die MS5 Zellkulturmedium wird α-MEM mit 20% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Am Tag 5 zählen Anzahl derZellen (jetzt deutlich in Erythroblasten angereichert) in jede Vertiefung der ursprünglichen Kulturplatte mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler oder manuell bei einem Mikroskop mit einer Zählkammer. </li><li> Heben Sie alle Zellen aus jeder Vertiefung und Transfer zum 15-ml konische Röhrchen, drehen bei 525 xg unten für 5 min bei RT, absaugen Überstand und Pellets lösen sich mit frischen EGM, die nur Epo (3 IU / ml) zu einer Konzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml. </li><li> Absaugen des Überstandes von den Brunnen, wo MS-5-Zellen wurden am Tag zuvor (zu 70-80% Konfluenz bei der Co-Kultur gezielte) plattiert und fügen Sie die erythroiden Zellen in diesen Brunnen in EGM, die nur Epo (wenn auch nicht das Medium ihrer Wahl, MS-5-Zellen überleben auch in EGM über mehrere Tage). </li><li> Ändern Zugabe von frischem Medium EPA am Tag # 6. </li><li> Ändern Medium an Tag # 7, mit EGM ohne Zusatz von Zytokinen. An den Tagen 7 bis 9, Prüfmuster für Enukleation mit Durchflusszytometrie nach Färbung mit anti-TER119 und Syto 16-Tages-und proceed der Färbung Proben für Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (wie in Abschnitt 3 beschrieben). Hinweis:. Vor der Beschichtung und an Tag 2, 4, 6, und 7 der Kultur, überwachen kultivierten Zellen für Erythroblast Bereicherung und Differenzierung mit Durchflusszytometrie durch die Beurteilung Oberflächenmarker CD44 und TER119 vs Größe (FSC) 9 Alternativ CD71, TER119 und FSC kann auch 10, 11 werden. </li></ol></li></ol> 2. Schneller Enukleation Assay, Nach dem Protokoll von Yoshida et al. Änderungen mit 12 (Abbildung 1B) <ol><li> Stress-Erythropoese Induktion und Stroma Zellpräparat zur in-vitro-Kultur Erythropoese <ol><li> Anesthetize einen 2-6 Monate alten Wildtyp-Maus C57/BL6 pro IACUC Richtlinien (zB mit Isofluran Lösung). Stellen Sie sicher, dass die Maus wurde ausreichend durch Prüfung auf Abwesenheit von reflexive Reaktionen auf eine sanfte Hinterpfote Prise und betäubtnormale Atmung während der Prozedur. Verwenden Tierarzt Augensalbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. </li><li> Stress ausgelöst werden Erythropoese über Schwanz Blutungen auf ein Gesamtvolumen von 500 ul. Verwendung eines Insulin-Spritze gleichen Volumen physiologischer Kochsalzlösung intraperitoneal Flüssigkeitszufuhr von dem Tier (Tier halten in Trendelenburg-Position vor der Injektion und Injektion in den Unterleib, um nicht innere Organe zu beschädigen) sicherzustellen. </li><li> Die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder wie Motorsteuerung durch das Tier angedeutet beginnen, um den Käfig zu bewegen und in der Lage zu stehen und zu gehen, ohne zu fallen. Die Phlebotomized Maus in einem Käfig ohne andere Mäuse platziert. </li><li> Nach 2 Tagen wurde die Platte MS-5-Zellen in Vertiefungen einer 24-well-Zellkulturplatte. Inkubieren MS-5-Zellen bei 37 ° C / 5% CO 2 in Zellmedium MS5 (a-MEM mit 20% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) mit dem Ziel, 70-80 sein % konfluent in Plattenvertiefungen nach 48 Stunden. </li></ol></li><li> Ernte der Milz und Verarbeitung von Splenozyten <ol><li> Vier Tage (96 Stunden) nach Stress Erythropoese Induktion, einschläfern vorher durch IACUC genehmigten Protokoll (zB CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte) blutete Maus. </li><li> Ernte Milz und steckte es in einen 15-ml konischen Röhrchen enthält IMDM 2% FBS und auf Eis zu halten. </li><li> Zurück im Labor, in der Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen, invertieren Milz haltige Rohr auf einem 40-um-Zellsieb auf einem 50-ml-Tube eingestellt. Crush Milz mit dem Kolben einer 5-ml-Plastikspritze. </li><li> Waschzelle Sieb mit IMDM + 2% FBS und mit dem gleichen Medium, Einstellen des Endvolumens der Zellsuspension in 5 ml. </li><li> Vorsichtig Schicht die 5 ml Suspension Splenozyten auf 5 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium 1,083 g / ml in einen 15-ml-Tube und Spin bei 750 g für 25 min bei RT ohne Bremse / low Beschleunigung. </li><li> ÜberweisungÜberstand (Lösung auf etwa 2-ml-Marke des 15-ml-Tube, um Buffy-Coat erwerben) in ein neues 15-ml-Tube und führen Sie eine weitere Wäsche mit IMDM + 2% FBS bei 525 g für 5 min bei RT . </li><li> Überstand wird abgesaugt und die Lyse der roten Blutzellen durch Suspendieren des Pellets in 3 ml RBC-Lyse-Puffer für 5 min bei RT. </li><li> 7 ml IMDM + 2% FBS zu den Zellen zu waschen und zu verdünnen und neutralisieren die RBC-Lyse-Puffer und Schleudern bei 525 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand wird abgesaugt und pelletiert Zellen aussetzen in 2 ml Erythroblast Wachstumsmedium (EGM). </li></ol></li><li> Kultur der isolierten niedriger Dichte Splenozyten in Erythroblasten angereichert, auf Kunststoff (erste Stufe des schnellen in vitro Erythropoese Kultur) <ol><li> Zählen von Zellen an einem automatisierten Zellzähler oder manuell mit einem Hämozytometer. Übliche Anzahl von Zellen pro Milz isoliert in dieser Phase ist ~ 15 x 10 6. </li><li> Suspend-Zellen weiter in EGM, die die Zytokine (bei final Konzentrationen): SCF 50 ng / ml IL-3 5 ng / ml, und Epo 2 U / ml. </li><li> Platte 1-5 x 10 6 Zellen in einem Endvolumen von 1 ml / well (gleiche Anzahl von Zellen pro Vertiefung je Gesamtzahl der Zellen) einer 24-Well-Zellkultur-Platte und Inkubation O / N bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li> Kultur von Erythroblasten auf MS5 Zellen (zweite Stufe des schnellen in vitro Erythropoese Kultur <ol><li> Absaugen des Überstandes aus dem Kunststoff gut und heben die Zellen (in Erythroblasten hochangereichertes) durch Zugabe von 2 ml kaltem 10 mM EDTA in PBS für 5 min auf Eis zu jeder Vertiefung. </li><li> Setzen Zellen in frische Röhrchen, einmal in EGM waschen (ohne Zytokine) und resuspendieren in der gleichen. </li><li> Platte 5 × 10 5 -1 × 10 6 Zellen in einer 1-2 ml Volumen jeder Zelle MS5 beschichteten Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wenn pharmakologische Inhibitoren werden in dem Experiment verwendet, fügen Sie sie in geeigneten Konzentrationen jetzt. </li><li> Inkubation für 6 bis 8 h (Zeit geführtmikroskopische Beobachtung von etwa 30% -40% Enukleation in der unbehandelten Probe WT). Die Bindung von Erythroblasten zu MS-5-Zellen beschleunigt die Enukleation. </li><li> Heben Zellen aus jeder Vertiefung durch Zugabe von 2 ml kaltem PBS + 10 mM EDTA, 5 min auf Eis. Zusammen mit den Erythroblasten, wird MS-5-Zellen auch gesammelt werden, aber diese können später leicht während Durchflusszytometrieanalyse FSC hallo TER119 ausgeschlossen werden - Zellen. </li><li> In diesem Stadium können die Zellen fixiert und gefärbt werden, zur Analyse durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie. </li></ol></li></ol> 3. Färbung der Erythroblasten für die Lokalisierung von intrazellulären Proteinen oder Lipid Rafts Während Enukleation von Multi-spektrale Imaging Durchflusszytometrie <ol><li> Waschen der Zellen in PBS, Spin 525 × g für 5 min bei RT und Absaugen des Überstandes. </li><li> Fix Zellen durch Resuspendieren Zellpellets in 500 &amp;mgr; l 3,7% Formaldehyd in PBS für 15 min (Fixierungszeit je nach anti variierengen, die geprüft wird) und Pipettieren sanft. </li><li> Übertragen auf 1,5-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Spin auf einer Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, Stand absaugen und führen Sie eine Wasch durch Zugabe von 500 ul PBS in jedes Röhrchen und Pipettieren sanft. </li><li> Spin auf einer Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und halten Röhrchen auf Eis für mindestens 15 min. Permeabilisierung Schritte 3,6-3,9 sollte schnell und effizient durchgeführt werden und nach Spinn / Aspiration bei RT Zellpellets sofort wieder auf Eis gelegt werden, um für die Zellen, um besser ihre Integrität behalten. </li><li> Nehmen Aceton-Lösungen aus -20 ° C Gefrierschrank und setzen auf Eis. Durchdringbar Zellen durch Resuspendieren Zellpellets zuerst in 500 ul eiskaltem 50% igem Aceton (1:1 mit dH 2 O) und Pipettieren schonend. </li><li> Spin auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und resuspendieren Zellpellets in 500 ul60; eiskaltem 100% Aceton durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Spin auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und resuspendieren Zellpellets noch einmal in 500 ul eiskaltem 50% Aceton durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Spin auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, Stand absaugen und waschen die Zellen einmal in kaltem FACS-Puffer (PBS + 0,5% BSA) durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Bereiten Kennzeichnung Cocktail mit Antikörpern oder Marker für die Moleküle von Interesse: 0.1 U/100 ul AF488-Phalloidin für F-Actin-Färbung und ein μl/100 ul TER119-PECy7 für erythroiden Zellfärbung. Alternative oder zusätzliche Färbung kann auch mit AF-488-Anti-β-Tubulin-Antikörper (1:50), AF-594-konjugierten Choleratoxin-Untereinheit B der Lipidflöße kenn (1:200), anti-pMRLC (Ser19) durchgeführt werden Primäre Antikörper für das phosphorylierte Myosin regulatorische leichte Kette (1:50), gefolgt von anti-Kaninchen-AF-488-konjugierten sekundären Antikörper (1:400) und anti-γ-rohrlin primären Kaninchen-Antikörper (1:100), gefolgt von anti-Kaninchen-AF-555-konjugierten sekundären Antikörper (1:300). </li><li> Nach der Überstand Aspiration, resuspendieren Zellpellets in 100 ul des Markers Cocktail, Pipetten sanft und Inkubation für 30 min bei RT. </li><li> Bereiten FACS-Puffer mit 2,5 uM der Kernfärbung DRAQ5. </li><li> Waschen der Zellen in FACS-Puffer, Spin-down auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und resuspendieren in 60 ul FACS-Puffer mit DRAQ5. </li><li> Proben laufen auf der Abbildungs ​​Durchflusszytometer mindestens 10.000 Ereignisse pro Experiment sammeln, kompensieren die Rohdaten, wie zuvor veröffentlicht 13, und wie in Fig. 2 gezeigt Ergebnisse analysieren, unter Verwendung der Analyse-Software spezifische Abbildungs ​​Durchflusszytometer. </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+distribution+and+function+during+the+maturation+and+enucleation+of+mammalian+erythroblasts.">Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts.</a> J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).</li><li>Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+trafficking+plays+a+novel+role+in+erythroblast+enucleation.">Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation.</a> Blood. 116, 3331-3340 (2010).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Konstantinidis, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+cytoskeletal+requirements+in+erythroblast+enucleation.">Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation.</a> Blood. 119, 6118-6127 (2012).</li><li>Giarratana, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells.">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li><li>Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).</li><li>Kalfa, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Rac2+GTPases+are+necessary+for+early+erythropoietic+expansion+in+the+bone+marrow+but+not+in+the+spleen.">Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen.</a> Haematologica. 95, 27-35 (2010).</li><li>Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine-dependent+engulfment+by+macrophages+of+nuclei+from+erythroid+precursor+cells.">Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells.</a> Nature. 437, 754-758 (2005).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

In den letzten Jahren das Studium der Erythroblasten Enukleation zunehmend an Dynamik gewonnen, da ist der Schritt in die Erythropoese in vitro-Kulturen, die am schwierigsten ist es, effizient, um erfolgreiche, groß angelegte Produktion von roten Blutzellen ex vivo zu erreichen reproduzieren. Bis vor kurzem war die Untersuchung von Erythroblasten Enukleation verwendet hauptsächlich Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie Methoden. Fluoreszenzmikroskopieverfahren, wenn auch hilfreich bei der E...

Terminalen Differenzierung innerhalb der erythroiden Abstammungslinie in Säugern schließt mit der drastisch Prozess der Enukleation, durch die der orthochromatischen Erythroblasten treibt seine Membran umhüllten Kern (pyrenocyte) 1, Erzeugen eines Retikulozyten-2. Der genaue Mechanismus dieses Prozesses, der auch der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für eine erfolgreiche, große Produktion von roten Blutzellen in vitro, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Die Lokalisierung von Schlüsselproteinen und Strukturen innerhalb enucleating Erythroblasten beruht auf der Verwendung von Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie 3-5. Dieser langwierige Prozess führt typischerweise zur Festlegung einer begrenzten Anzahl von Ereignissen Enukleation und erlaubt nicht immer sinn statistischen Analyse. Aufbauend auf ein Verfahren zur Identifizierung Erythroblast zuvor von McGrath et al. 6 beschrieben, haben wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung und Untersuchung Enukleation Veranstaltungen von Multi-Spectral Ima entwickeltGing Durchflusszytometrie (Multi High-Speed-Cell-Imaging in Flow, eine Methode, die Fluoreszenzmikroskopie mit Durchflusszytometrie kombiniert) 7, die eine ausreichende Anzahl von Beobachtungen liefern können, um Messungen zu erhalten und statistische Analysen. Hier beschreiben wir zwei ersten in vitro Erythropoese Kultur, um Erythroblasten synchronisieren und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erfassung Enukleation bei der Auswertung verwendeten Methoden. Dann beschreiben wir im Detail die Färbung von Erythroblasten nach Fixierung und Permeabilisierung, um die Lokalisierung der intrazellulären Proteinen oder Lipid-Rafts während Enukleation durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie studieren. Die Proben werden auf einer Bild Durchflusszytometer laufen und die gesammelten Zellen angemessen zu orthochromatischen Erythroblasten gated 6 identifizieren. Orthochromatischen Erythroblasten werden dann auf der Basis des Seitenverhältnisses untersucht, wie im Hell ima gemessenGing, gegen deren Wert für den Parameter Delta Zentroid XY TER119-DNA, die als Abstand zwischen den Mittelpunkten der Bereiche für TER119 und DNA angefärbt bzw. definiert ist. Die Population von Zellen mit niedrigen Seitenverhältnis und hohe Delta-Schwerpunkts XY Ter119/DNA ist hoch in enucleating Zellen angereichert. Mit Wildtyp (WT) Erythroblasten gegenüber Erythroblasten mit Mx-Cre vermittelte bedingte Löschung Rac1 auf Rac2 - / - oder kombiniert Rac2 - / -; RAC3 - / - genetischen Hintergrund und das neue Analyse-Protokoll des multispektralen Bildgebung Durchflusszytometrie, haben wir vor kurzem gezeigt, dass Enukleation ähnelt asymmetrische Zellteilung und die Bildung einer Actomyosin Ring teilweise durch Rac GTPasen geregelt ist wichtig für die Enukleation Progression 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

Erythropoese bei Säugetieren schließt mit der dramatischen Prozess der Entkernung, die in Retikulozyten-Bildung führt. Der Mechanismus der Enukleation ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Ein gemeinsames Problem, das bei der Untersuchung der Lokalisation von Schlüsselproteinen und Strukturen innerhalb enucleating Erythroblasten durch Mikroskopie ist die Schwierigkeit, eine ausreichende Anzahl von Zellen, die eine Enukleation beobachten. Wir haben eine neue Analyse-Protokoll mit Multi High-Speed-Cell-Imaging in Strom (Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie), eine Methode, die Immunfluoreszenz-Mikroskopie kombiniert mit Durchflusszytometrie, um effizient eine erhebliche Anzahl von enucleating Ereignisse zu identifizieren entwickelt, die erlaubt zu erhalten, Messungen und statistische Analysen. Wir beschreiben hier zunächst zwei in-vitro-Kultur, um die Erythropoese verwendet, um Maus Erythroblasten synchronisieren und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erfassung Enukleation bei th Methodene Zeit der Auswertung. Dann beschreiben wir im Detail die Färbung von Erythroblasten nach Fixierung und Permeabilisierung, um die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen oder Lipidflößen in Enukleation durch multispektrale Abbildungs ​​Durchflusszytometrie studieren. Neben Größe und DNA/Ter119 Färbung, die verwendet werden, um die orthochromatischen Erythroblasten zu identifizieren, nutzen wir die Parameter &quot;Seitenverhältnis&quot; einer Zelle, in der Hellfeld-Kanal, der in der Anerkennung des langgestreckten Zellen und &quot;delta Schwerpunkt XY Ter119/Draq5 hilft &quot;ermöglicht, daß die Identifizierung der zellulären Ereignisse, bei denen das Zentrum der TER119-Färbung (naszierenden Retikulozyten) weit von der Mitte der DRAQ5 Färbung (Kern zogen Extrusion), was auf eine Zelle, die enucleate. Die Teilmenge der orthochromatischen Erythroblasten Bevölkerung mit qualitativ Delta Schwerpunkt und niedrigem Aspektverhältnis ist sehr in enucleating Zellen angereichert.

Zunächst werden die Zellen auf der Basis ihrer Hellseitenverhältnis (das Verhältnis der Länge der kleineren gegen ihre Hauptachse) und ihre Hellbereich (Durch ihrer Größe) analysiert. Ereignisse mit einem Hellbereich-Wert niedriger als 20 und mehr als 200 sind meist Trümmer und Zellaggregate sind, und werden aus der Analyse (2A) ausgeschlossen. Einzelne Zellen (Gate &quot;R1&quot;) sind dann basierend auf ihren Wert für den Parameter Gradient RMS, die Schärfe des Bildes zeigt analysiert. Gate &...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung einer Bevölkerung von orthochromatischen Erythroblasten enucleating durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie, die eine Visualisierung der Erythroblasten Enukleation Prozess.

Identifizierung einer Subpopulation Murine Erythroblast Enriched in Enucleating Veranstaltungen durch multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Aufrufe.  University of Cincinnati College of Medicine.  Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung einer Bevölkerung von orthochromatischen Erythroblasten enucleating durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie, die eine Visualisierung der Erythroblasten Enukleation Prozess. 

Serie: Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Forschung

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Messung der Endoreduplikation durch Durchflusszytometrie von isolierten Knolle Protoplasten

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Hochdurchsatz-Messung von Dictyostelium Discoideum Macropinocytosis von Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...