Diese Arbeit wurde vom NIH Grants 068.625, NSF Zuschüsse 1.063.188 und Center der Physik von lebenden Zellen 0822613. Besonderer Dank geht an Dr. Marina Marjanovic in Beckman Institute for Advanced Science and Technology für das Geschenk von Kaninchenaugen unterstützt.

Ethik-Erklärung: Die Hornhaut Gewebe von Kaninchen wurde in Übereinstimmung mit der Universität von Illinois Institutional Animal Care und Verwenden Richtlinien gesammelt. 1. TIRFM-Setup HINWEIS: Tragen Laser-Schutzbrille die ganze Zeit. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle in der Liste der Materialien aufgeführt notwendigen optischen Komponenten sind verfügbar und bereit für die Ausrichtung. Falls erforderlich, verwenden Ersatz mit gleichwertigen Funktionen von anderen Unternehmen. Stellen Sie sicher, dass Spiegel und Linsen sollten Antireflexbeschichtungen (AR) passend zum Laser im Einsatz haben. </li><li> Stellen Sie die Höhen aller optischen Komponenten auf die Höhe des Zentrums des Mikroskops zurück Port. </li><li> Montieren Sie den Laser, Laser-Shutter und ND-Filter (n). ND-Filter, um die Laserleistung so gering wie möglich zu dämpfen, nach unten, während die Balken sichtbar. Ziehen Sie die Schrauben mit entsprechenden Sechskantschlüssel. </li><li> Planen Sie ein Strahlengang und markieren Sie es mit Klebeband oder Markierung auf der optischen Tisch (dotTed blauen Linien in Abbildung 1). Der Einfachheit halber halten gerade Wege entlang der Linien von Löchern auf der optischen Tisch. </li><li> Ort Spiegel M1 (Abbildung 1) an der ersten rechten Winkel dran. Legen Sie die beiden Blenden entlang der zweiten geraden Abschnitt der geplanten Strahlengang. Einzustellen sowohl die Position und die Neigung des M1, so dass die Laser geht durch die Iris. </li><li> Ort Spiegel M2 (Abbildung 1) an der zweiten rechten Winkel dran. Legen Sie das 10X Beam Expander (L1 L2 &amp;, Abbildung 1) entlang der dritten geraden Abschnitt des Pfades. Seine Neigung einzustellen, so dass die Strahlaufweitung parallel zu sowohl der optischen Tabelle und der geplanten Strahlengang ist. <ol><li> Einzustellen M1 und M2 iterativ so dass die Laser geht geradlinig durch die Zentren der beiden Linsen der Strahlaufweiter. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Strahlprofil des aufgeweiteten Strahl ist nicht-begrenzten Gauß. </li></ol></li><li> Stellen Sie M1, um den Strahl auf L1 zentrieren (FiGüre 1) und M2, um den Strahl auf L2 (1) iterativ zu zentrieren. Eine schlechte Strahlprofil bedeutet in der Regel der Laser abgeschnitten; verwenden Sie ein Stück weißes Papier, um den Strahl nach der Strahlaufweitung zu blockieren, um die Strahlprofil mit den Augen zu überprüfen. Für hochgenaue Analyse, verwenden Sie einen optischen Strahl Profiler. </li><li> Den Abstand zwischen L1 und L2, so daß der Strahl kollimiert. Wiederholen Sie Schritt 1.8 und 1.9, wenn nötig. HINWEIS: Wenn die Strahlgröße nicht mit der Entfernung ändern, ist der Strahl gebündelten genug für eine TIRFM-Setup. Um die Strahlkollimation weiter zu verbessern, könnte Werkzeuge wie Scheren-Interferometer verwendet werden. Eine typische Strahlgröße nach der Expansion ist ~ 20 mm. </li><li> Shutter des Lasers. Schrauben Sie den Mikroskopobjektiv und schrauben in einer Leuchtstoffausrichtungsziel. Ort Spiegel M3 und M4 (1), um den expandierten Strahl in den Mikroskopöffnung und auf den dichroitischen Spiegel in dem Revolverkopf zu leiten. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl springt ter dichroitische und gegen die Decke. </li><li> Passen M3, um die hellste Teil des Lichtstrahls auf dem Leucht Target Center und M4, um die Strahlneigung einstellen vertikal zu werden. </li><li> Shutter des Lasers und schrauben das Ziel wieder ein. Wenn die Ausrichtung im vorherigen Schritt ist getan und sollte es eine symmetrische Ort Verlassen des Ziel sein. Feinabstimmung der Neigungen von M3 und M4, die Laserleistung und Strahlprofil aus dem Ziel zu optimieren. </li><li> Montieren Sie eine EM-CCD Kamera mit dem Mikroskop und schließen Sie die Kamera an einen Computer. Starten der Software für die Kamera. </li><li> Montieren Sie eine Leuchtstoffprobe (Lösung von Fluorophore) auf dem Mikroskop. Schauen Sie sich die hell fluoreszierende Fleck auf der Kamera. Überprüfen Sie, dass der Spot nicht auf dem Bildschirm verschieben, wenn der Fokus geändert wird. </li><li> Platzieren Sie die TIR-Linse (L3, 1) auf der XYZ-Stufe in einem Abstand von der hinteren Brennebene des Objektivs, die gleich der Brennweite der L3 (~ 30 cm) ist. Stellen Sie die Position der L3so dass die Laser geht durch das Zentrum der Linse. </li><li> Übersetzen L3 entlang des Strahlengangs um die Strahlkollimation einzustellen. Sicherstellen, dass der Strahl immer noch auf dem Bildschirm zentriert und in der Form symmetrisch. HINWEIS: Die Beleuchtungsbereich an den Probenebene steigt mit abnehmender TIR-Linse Brennweite. In der Regel verwenden die kleinste Brennweite, am Set-up passen. </li><li> Übersetzen L3 senkrecht zum Strahlengang, um den Strahl von dem Ziel zu kippen. Halten der Übersetzung des TIR-Linse derart, daß TIR erreicht. Eine Probe von fluoreszierenden Kügelchen beobachten durch die EM-CCD-Kamera, und die Feinabstimmung L3 gute SNR zu erhalten. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Optische Konfiguration für Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM). 2. FIONA auf Cy3-DNA <ol><li> Cschlanke Objektträgern und Deckgläsern: Spülen Objektträgern und Deckgläsern mit ddH2O und Isopropanol und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas; Legen Sie die Folien und Deckgläser in der Plasmareiniger für 5 min unter Argon-Plasma. </li><li> Konstrukt Probenkammern (wie in Figur 2 skizziert). <ol><li> Legen Sie ein Gewebe auf der Bank und dann legte ein Stück Papier Linse auf der Oberseite des Gewebes. Legen Sie die Folie auf der Linse Papier. Stellen Sie sicher, dass der sauberen Seite der Folie nach oben zeigt. </li><li> Gelten zwei Streifen von doppelseitigem Klebeband auf die Folie entlang der Längskanten, wobei ein Spalt von 3-5 mm in der Mitte. Legen Sie die gereinigten Deckglas der Folie. Stellen Sie sicher, dass die saubere Seite des Deckglases wird die Folie gegenüber. </li><li> Verwenden Sie eine Pipettenspitze nach unten über das doppelseitige Klebeband drücken. Verwenden Sie einen Rasierer, um überschüssige Band aus der Folie zu entfernen, so dass das Band nur noch unter dem Deckglas. HINWEIS: Die offenen Enden der Kammer offen gelassen und dienen als Einlass und auslassen. Das Kammervolumen beträgt mehrere Mikroliter. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Skizze einer typischen Probenkammer (a) Draufsicht. (B) Seitenansicht von rechts; (C) Seitenansicht von vorne. <ol start="3"><li> Immobilisierung von Cy3-DNA auf den inneren Oberflächen der Probenkammern. <ol><li> Bereiten T-50-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Vorbereitung BSA-Biotin in T-50 in einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Vorbereitung T50-BSA-Puffer durch Lösen von BSA in T-50 in einer Endkonzentration von 10 mg / ml. </li><li> Planen 0,5 mg / ml Neutravidin in T50-BSA-Puffer. Vorbereitung biotinylierten Cy3 markierter DNA (Cy3-DNA) in T50-BSA in einer Endkonzentration von 5-10 pM. </li><li> Je 10 ul BSA-Biotin (1 mg / ml) in die Probenkammer. Warten Sie 5 min. </li><li&gt; Waschen Sie die Kammer mit 40 ul T50-BSA. Je 10 ul Neutravidin (0,5 mg / ml) in die Probenkammer. Inkubation für 5 min. </li><li> Die Kammer mit 40 ul T50-BSA waschen. Je 20 ul Cy3-DNA in die Probenkammer. Inkubation für 5 min und dann waschen die Kammer mit 80 ul T50-BSA. </li></ol></li><li> Bild Cy3-DNA-Einzelmolekülen unter TIRFM. <ol><li> Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen von 1 ul Protocatechuat 3,4-Dioxygenase (PCD, 5 uM), 4 ul Protocatechusäure (PCA, 62,5 mM), 50 ul 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carbonsäure (Trolox, 2 mM in T-50) und 45 ul T50-BSA. </li><li> Pipette in 30 ul Imaging Puffer und warten 8-10 min. </li><li> Montieren Sie die Probe für die Bildgebung auf einem TIRFM, die mit einem grünen Laser (532 nm) ausgestattet ist, eine 100X Ölimmersionsobjektiv (NA 1,45) und eine EM-CCD-Kamera. </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 bis 500 ms und EM Gewinn auf 25 bis 100. Erwerben Sie einen Film der Probe für 1,000 Frames. </li></ol></li><li> Führen FIONA die Analyse der Daten der aufgenommenen Bilder von Cy3-DNA. <ol><li> Bestimmen Sie die effektive Pixelgröße (dh Umrechnungsfaktor von Pixel zu Nanometer) durch Division der physikalischen Pixelgröße (gelesen aus dem Datenblatt des EMCCD-Kamera) durch die Gesamtvergrößerung (die Vergrößerung des Mikroskopobjektivs multipliziert mit irgendwelche zusätzlichen Vergrößerung). </li><li> Bestimmung der Umwandlungsfaktor von Pixelintensitäten zu Nummern durch Dividieren CCD-Empfindlichkeit (dh Elektronen pro A / D-Zählung aus dem Datenblatt der CCD-Kamera gelesen) von der Elektronenvervielfacher (EM) Zunahme während der Bildaufnahme verwendet Photon. </li><li> Kompilieren und ausführen FIONA.pro für FIONA-Analyse. Verwenden Sie diese IDL-Programm, das erworbene Bild zu importieren, die Eingabe der effektiven Pixelgröße (aus Schritt 2.5.1) und dem Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) und um Punkte für FIONA Analyse wählen. HINWEIS: Am Ende, das Program mit Ausgabe der Anpassungsergebnisse mit 2D Gauß-Funktionen, sowie Gesamtphotonenzahlen und Lokalisierungsgenauigkeit. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse und 4c-4d gezeigt. </li><li> Kompilieren und ausführen phcount.pro zu Photonenzahl zu charakterisieren. Verwenden Sie diese IDL-Programm, um die durchschnittliche Anzahl der Photonen, die von einem Fluorophor vor Photobleaching emittiert wird, um das erfasste Bild und die Eingabe der Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) zu importieren. HINWEIS: Das Programm wird dann automatisch zu erkennen fluoreszierende Flecken (manuelle Auswahl ist eine Option) berechnen Photonen als Funktion der Rahmennummer und geben die Spuren von Photonen. <ol><li> Verwerfen schlechte Spuren und geben Rahmen Bereiche after photo für Basislinienkorrektur. Am Ende wird das Programm Ausgabe eine Liste der Gesamtphotonenzahlen für alle Flecken nicht verworfen. Dann zeichnen Sie die Verteilung der Photonenzahlen und passen die Verteilungtion mit einem exponentiellen Abfall, um die durchschnittliche Photonenzahl zu erhalten. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse gezeigt und Fakten 4e-4f. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Angewandte FIONA zu Motor (zB Myosin auf Aktin) Dynamik auf der Nanometerskala zu quantifizieren <ol><li> Polymerisieren Aktin (dh vorzubereiten F-Actin) einen Tag vor FIONA Experiment. <ol><li> Rekonstituieren G-Aktin (Monomer) und Biotin G-Aktin (Monomer) bis 10 mg / allgemeiner Actin-Puffer ml. Rühren, um sicherzustellen, dass beide vollständig gelöst und halten sowohl auf Eis. </li><li> Mischungs 10 ul G-Aktin (Monomer) mit 1,7 ul Biotin-G-Aktin in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l eiskaltem Puffer Aktin-Polymerisation. </li><li> Wird die Mischung über Nacht bei 4 ° C (F-Aktin) gebildet und fügen ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 1 ml. </li><li> Speichern der Aktin-Filamente (F-Actin) bei 4 ° C für die spätere Verwendung in den Experimenten. HINWEIS: Filamente zerfallen und über die Zeit zu verkürzen, kann jedoch für mindestens zwei Wochen verwendet werden. </li></ol></li><li> Probe vorbereiten für die Bildgebung. <ol><li> Machen Sie eine Probenkammer (in Protokoll 2.1 und 2.2 beschrieben). Pipette in 20 ul biotinyliertes BSA 1 mg / ml in ddH 2 O. Inkubation für 10 min. Spülen Sie mit 30 ul ddH 2 O. HINWEIS: Dies blockiert die Glasoberfläche und legt Biotin für die Bindung der Aktin-Filamente. Biotinylierten Poly-L-Lysin - Polyethylenglykol (PLL-PEG) konnte die gleiche Funktion erfüllen. </li><li> Pipette in 0,5 mg / ml Neutravidin. Inkubation für 2 min und dann waschen die Kammer mit 30 ul M5 Puffer. </li><li> Pipette in die hergestellte F-Actin-25-fach verdünnt in allgemeiner Actin-Puffer auf eine Endkonzentration ~ 0,004 mg / ml. Warten Sie 10 min, spülen Sie die Kammer mit 30 ul Puffer. </li><li> Verdünnen Myosin Va mit FLAG-Tags 30-fach in M5 Puffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) in einer Endkonzentration of 250 nM. Mischen Sie 1 ul Myosin mit 1 ul Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 um, von Anti-Flag-Antikörper und Qdot705 konjugiert mit der Qdot705 Antikörperkonjugation Kit nach der Anleitung des Herstellers). Fügen Sie in 8 ul M5 bis zu 10 ul zu füllen. Pipette auf und ab, um gut zu mischen. Inkubation für 10 Minuten auf Eis. ANMERKUNG: Dies ergibt ein Gemisch aus 1 bis 4 Motor Quantenpunkte bei ~ 25 nM Konzentration Myosin. </li></ol></li><li> Bildgebung des Myosin-Aktin zu Fuß auf. <ol><li> Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen 84 ul BSA-M5 (M5 Puffer mit 1 mg / ml BSA), 1 ul ATP (50 uM in ddH 2 O), 2 ul DTT (500 mM in ddH 2 O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 ul PCA, 1 ul Myosin-qdot nach 2,5 nM Konzentration Myosin, und 1 ul BME verdünnt weitere 10-fache. </li><li> Pipette in 20 ul Imaging-Puffer, um die Kammer zu probieren und Inkubation für 8-10 min. </li><li> Bild der Probe auf TIRF-Mikroskop bei 30 ms Belichtungs. Erwerben mindestens 1.000 Frames. Stellen Sie die Lautstärke von Myosin-qdot in Schritt 3.3.1, wenn nötig. </li></ol></li><li> Führen Sie die Datenanalyse und finden Sie die Schrittgröße von Myosin Walking. <ol><li> Öffnen Sie die Videodatei in ImageJ 17 und schneiden Sie das Video um einen beweglichen Ort. Ernte eine ausreichend große Fläche, die der Spot nie innerhalb von 20 Pixel der Kante bekommt, und stellen Sie sicher, dass keine anderen Stellen im Video. Sicherzustellen, daß dieser Punkt in einem linearen Weg bewegt. </li><li> Verfolgen Sie die Stelle durch das Video zu x und y-Koordinaten durch die Zeit, in Pixel, durch die Anwendung FIONA Analyse (Schritt 2.5.3), um jede und jeden Frame des Videos. </li><li> Konvertieren Pixel Nanometern, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. </li><li> Berechnen Verschiebung von der ersten Position als eine Funktion der Zeit. </li><li> Laufen t-Test auf die Verschiebung, die Schritte des Myosin Walking erhalten. HINWEIS: Die für t-Test (step_t_test.zip) versehen Programm wird in IDL und con codiertbesteht aus 14 Unterprogramme im Ordner. <ol><li> Öffnen Sie alle Unterprogramme in IDL und alles übersetzen zweimal. Dann führen Sie mtltyanalysis_ttest.pro und wählen Sie eine Textdatei nur die Entfernungsdaten in einer einzigen Spalte enthält. Ein Ausgang Excel-Datei erzeugt, mit dem Rohdaten, die Passform und die Schrittweite. </li></ol></li><li> Löschen Sie alle Null-Werte aus der Schrittweite Spalte. Zeichnen Sie die Verteilung der Schrittweiten mit Origin oder MATLAB. Setzen Sie einen Gaußschen auf das Histogramm. HINWEIS: Schrittweite von Null-Werte müssen gelöscht werden, da ein Schritt von Null bedeutet, dass kein Schritt des vorherigen Rahmens gemacht. Der Beschlag gibt einen Peak bei etwa 36 nm (wie in 5 gezeigt). </li></ol></li></ol> 4. Dick Probenvorbereitung für FIONA <ol><li> Bereiten Quantenpunkte in Sol-Gel verkapselt. <ol><li> Mischungs 4,5 ml TMOS, 1 ml ddH 2 O und 100 ul HCl (120 mM). Beschallen die Mischung auf Eis für 30 min in der Ultraschall-Reiniger spin der Liste der Materialien ecified (Frequenz = 40 kHz, = Heizung aus). Mischen Sie die Lösung alle 10 min. </li><li> 1,5 ul verdünnte Qdot605 in 1,5 ml HEPES (50 mM, pH 7,2). Mischungslösung mit 1,5 ml TMOS aus dem vorherigen Schritt. </li><li> Gießen Sie die Mischung in eine Glasbodenschale. Glas verschließen Bodenschale mit Parafilm und bei 4 ° C für 1. 5 Stunden. </li><li> 2 ml 1% BME in PBS an die Probenschale und bei Raumtemperatur für 30 Minuten vor der Bilderzeugung. </li></ol></li><li> Bereiten Hornhaut Probe mit Quantenpunkten gefärbt. HINWEIS: Kaninchen-Augen waren Geschenke von Dr. Marina Marjanovic. <ol><li> Trennen Sie die Hornhaut von den Augen und schneiden Sie es in 3 mm x 3 mm große Stücke. </li><li> Verdünnen 1 ul Qdot 605-Streptavidin in 1 ml PBS. Inkubieren Sie die Hornhautgewebe mit 1 nM Qdots Lösung bei 4 ° C für 1 Stunde. Das Gewebe mit PBS waschen. </li><li> Nehmen Sie einen sauberen Glasobjektträger und Deckglas ein # 1.5. Setz 4 Schichten doppelseitigen Klebeband auf dem Glasobjektträger entlang der längeren Seite, einnd Anders 4 Schichten doppelseitiges Klebeband parallel zum vorherigen Band und hinterlassen einen Kanal ca. 1 cm dazwischen. Legen Sie das Gewebe aus dem vorherigen Schritt in der Mitte des Kanals, und decken Sie es mit einem Deckglas. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf den Seiten des Deckglases, um sie auf die Bänder kleben. Befeuchten Sie den Kanal mit 50 ul PBS vor Bildgebung. </li></ol></li><li> Bild Quantenpunkte in Sol-Gel-und Hornhaut. <ol><li> Fiona Bildgebung in dicken Proben, verwenden Sie ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,27 mm, oder ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,28 mm. </li><li> Montieren Sie die Probe auf dem Mikroskop. Einstellen der TIRF-Linse derart, daß sie die Auflicht-Fluoreszenz-Modus erreicht (dh der Laserstrahl tritt aus dem Ziel mit einem Winkel gegenüber dem Deckglas). Legen Sie eine zusätzliche Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X). </li><li> Bewegen der Fokusebene des Objektivs zu einer gewünschten Z-Position (zB&gt; 200 um). Rekord Bilder von immobilenQuantenpunkte in der Probe. </li></ol></li><li> Führen FIONA Analyse, wie in Abschnitt 2.5 dieses Protokolls beschrieben. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

FIONA ist eine Technik, um die Position eines optischen Emitter (organisches Fluorophor oder Quantenpunkt) mit Nanometer-Präzision und zeitlichen Auflösung von bis zu 1 ms 4 bis 8 zu lokalisieren. Wenn genügend Photonen gesammelt werden, ermöglicht diese Technik, um die Position einer fluoreszierenden Emitter viel genauer als die Beugungsgrenze (~ 200 nm) zu bestimmen und somit dieses Verfahren eröffnet eine Möglichkeit, um zu beobachten, was mit herkömmlichen / traditionelle optische Mikroskopie ...

Rund 1882 Ernst Abbe festgestellt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskops sichtbar ist ~ λ / 2NA oder ~ 200 nm (wo λ die Wellenlänge und NA die numerische Apertur) 1,2. Daher würde jedes Objekt kleiner als diese Dimension als beugungsbegrenzten Fleck in einem optischen Mikroskop erscheinen. Jedoch ist es möglich, die Mitte des Flecks, das heißt, die Position des Objekts zu bestimmen, mit einer viel höheren Präzision 3. Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene 4. Die Genauigkeit der Lokalisierung, σ μ (dh die Standardabweichung des Mittelwerts), hängt von der Gesamtzahl der gesammelten Photonen, <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> , Wobei N die Photonenzahl, s die Standardabweichung der Leuchtfleck, adie Pixelgröße der Bilddetektor, und b die Standardabweichung der Hintergrund 3,4. Für einen Fluorophor emittiert ~ 10.000 Photonen können FIONA erreichen ~ 1 nm Präzision 4. Fiona verwendet, um die Position eines stationären Emitter oder ein Bewegen eines (vorausgesetzt Bilder schnell genug gemacht werden) exakt zu bestimmen. FIONA können, um den Rahmen des Films angewendet werden sequentiell und damit verfolgen die Bewegung der Einzelmolekül-4-8. Lichtschutz Reagenzien notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Probe nicht photochemisch. Weiterhin können die fluoreszierenden Objekts selbst beliebig groß sein, kleiner oder größer als die Beugungs Begrenzung- zB kann es aus einer Organelle (~ 1 um) mit vielen fluoreszierenden Proteine ​​auf ihrer Membran dispergiert bestehen. Mit FIONA kann immer noch eine sehr genaue (Nanometer) Durchschnitt der durchschnittlichen Mitte-der-Masse ergeben. Die große Verbesserung in Lokalisierungsgenauigkeit von Fiona ermöglicht die Lösung nanometer-Skala Bewegungen über die Zeit. Dies hat die Mikroskopie in die molekularen Längenskala 4 bis 8 geschoben. Seit ihrer Erfindung haben Varianten von FIONA entwickelt. Zum Beispiel Hellfeld-Bildgebung mit einem-Nanometer-Genauigkeit (bFIONA) 9, eine leichte Variante der FIONA, Bilder und lokalisiert dichte Objekte wie Melanosomen in vivo (dunkle Objekte, die das Pigment Melanin) mit Durchlicht. Darüber hinaus FIONA wurde eingesetzt, um mehrere Farbstoffe zu lösen. Zum Beispiel, Einzelmolekül-hochauflösende Bildgebung mit Photobleaching (Garnelen) 10,11 oder Einzelmolekülhochauflösende Kolokalisation (SHREC) 12 entwickelt worden, um zwei Farbstoffe innerhalb von etwa 10 nm zu lösen. (Beachten Sie, dass dies Auflösung, dh wie genau kann man identische Farbstoffe auseinander zu halten.) Vor kurzem hat FIONA Analyse auf die Lokalisierung bestimmter superauflösende Mikroskopie beigetragen wie stochastische optische RECOnstruction Mikroskopie (STORM) 13-15-und Foto-aktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) 16, in dem temporäre dunklen Fluorophore sind aufgeregt, und dann wird die Fluoreszenz lokalisiert. Durch wiederholtes spannende einem relativ niedrigen Dichte von Farbstoffen (weniger als eine pro beugungsbegrenzten Fleck) und dann das Sammeln der Fluoreszenz, die Analyse jeder von ihnen von Fiona, kann man aufbauen eine hochauflösende Karte. Die Auflösung wird dann einfach durch die Anzahl der Photonen jeder Farbstoff setzt heraus, als auch Dinge wie bei der Akquisition halten die Probe stationär (einschließlich zB der Mikroskoptisch) begrenzt. In diesem Papier, eine Zusammenfassung der FIONA Technik und beschreiben Sie kurz Beispiele von Forschung, die unter Verwendung von FIONA wird berichtet haben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie manDurchführung einer einfachen FIONA Experiment auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, veranschaulicht. Danach wird die Verwendung von Fiona 36 nm Schrittweite eines einzelnen abgeschnittenen Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert, um zu messen, ist dargestellt. Myosin Va ist ein wesentlicher Motor prozessive Protein, das zelluläre Fracht trägt, während Translokation entlang Aktin-Filamente. Hier eine Myosin Va konstruieren stumpf wird verwendet, um Bereiche irrelevant für die Schrittgröße zu entfernen, und mit einem Flag-Tag an den C-Terminus angefügt, um eine einfache Markierung mit Quantenpunkten mit Anti-FLAG-Antikörper funktionalisierten ermöglichen. Dieses Experiment wird unter niedrigen ATP getan, um die Myosin verlangsamen und ermöglichen die Verwendung von Belichtungszeiten lang genug, um eine gute Photonenzahl in jedem Rahmen zu bekommen. Jede ausreichend hell fluoreszierende Markierung könnte in dem folgenden Protokoll ersetzt werden. Schließlich jüngsten Anstrengungen der Verlängerung der Anwendung der FIONA zu dicken Proben berichtet. Als Proof-of-Prinzip wurden Quantenpunkte eingeweichtin Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhaut und dann abgebildet und lokalisiert mit FIONA. Für die Bildgebung, ein 60X Wasser Immersionsobjektiv mit NA = 1,2 wurde verwendet, da dieses Ziel hat eine längere Distanz als bisher verwendete 100X Ölimmersionsobjektiv. Um den Verlust in der Vergrößerung in dem Ziel auszugleichen, wurde ein extra-Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X) in der Emissionspfad eingefügt. Darüber hinaus Auflicht-Fluoreszenz (nicht TIR)-Mikroskopie muss verwendet werden, um tiefe Regionen in den dicken Proben zuzugreifen. Es wird gezeigt, dass die Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gels und im Kaninchenauge Hornhäute (Z&gt; 200 um) können mit 2-3 nm Präzision lokalisiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1083">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:211px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:443px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:211px;">3M</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>~ 75 um thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:211px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:211px;">DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Branson</td>
			<td style="width:211px;">2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:211px;">Chroma</td>
			<td style="width:211px;">49016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Actin polymerization buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Biotin G-actin</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AB07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">G-actin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AKL95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">General actin buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser shutter (with driver)</td>
			<td style="width:211px;">Electro-Optical Products Corp.&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SH-10-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">IDL</td>
			<td style="width:211px;">Exelis Visual Information Solutions</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Neutravidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">PI-31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Coverslip</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:211px;">22X30-1.5</td>
			<td>0.16-0.19 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:211px;">Gold Seal Microslides&#160;</td>
			<td style="width:211px;">30103X1</td>
			<td>0.93-1.05 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:211px;">PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass bottom dish&#160;</td>
			<td style="width:211px;">In Vitro Scientific</td>
			<td style="width:211px;">D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Cy3-DNA oligos</td>
			<td style="width:211px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>5&#39;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#39;Bio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent beads&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">T-7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot 605-streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q10101MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot605&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q21301MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot705</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22021MP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Matlab</td>
			<td style="width:211px;">MathWorks</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical table</td>
			<td style="width:211px;">Newport Corp</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>RS4000 Series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:211px;">Plan Apo VC 60x WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">100X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">PlanApo 100X/1.45 Oil &#8734;/0.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">UPlanApo 60X/1.20W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">IX71/IX70/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Origin</td>
			<td style="width:211px;">OriginLab</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Anti-FLAG antibody</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">F7425-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ATP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BME&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA-biotin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CK</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">C3755</td>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1937</td>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">DTT</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">43815</td>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EGTA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">E3889</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">KCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MgCl2</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">NaCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">03930590</td>
			<td>Protocatechuic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCD</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P8279</td>
			<td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">TMOS</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">341436-25G</td>
			<td>Tetramethyl orthosilicate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Trolox</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">238813</td>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">1&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB1-E02, KM100</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">&#189;&#8221; diameter posts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TR4</td>
			<td>Quantity &#8805; 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">10x beam expander</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BE10M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB2-E02, KM200</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter f = 300 mm lens with mount</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LA1256-A, LMR2</td>
			<td>TIR lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent alignment target&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">VRC2SM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser safety goggles</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ND filter(s)</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical beam profiler</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP209-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Post-mounted iris diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">ID25</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">XYZ translation stage, &#189;&#8221; travel&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">T12XYZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser</td>
			<td style="width:211px;">World Star Technologies&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TECGL-30</td>
			<td>532 nm, 30 mW</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene. Hier eine Zusammenfassung der FIONA Technik wird berichtet, und Beispiele der Forschung, die durchgeführt wurde unter Verwendung Fiona kurz beschrieben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie man auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, gefolgt von der Nutzung von FIONA um die 36 nm Schrittweite von einer einzigen abgeschnitten Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert messen Durchführung einer einfachen FIONA Experiment veranschaulicht. Schließlich jüngsten Bemühungen um die Anwendung FIONA zu dicken Proben erstrecken wird berichtet. Es wird gezeigt, dass mit einem Wasserimmersionsobjektiv und Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhäute (&gt;200 um) Lokalisierungsgenauigkeit von 2-3 nm erreicht werden.

Ein typisches Ziel-Typ TIRFM Aufbau ist in Abbildung 3 dargestellt. Zuerst wurde auf der Oberfläche immobilisierten Cy3-DNA Probe abgebildet. Ein typisches Bild ist in 4a gezeigt. Das Bild wurde mit 0,5 Sekunden Belichtungszeit aufgenommen, mit EM Verstärkung = 50 und CCD-Empfindlichkeit = 12.13 für die Kamera. Die Punktbild-Funktion (PSF) eines Cy3-DNA-Molekül ist in 4b dargestellt (von der durch den Pfeil in Figur 4a angedeutet Stelle), wo die Far...

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Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

17.5K Aufrufe.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben. 

Serie: Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Geboren Normalisierung für Fluoreszenz-Optical Projection Tomographie für ganzem Herzen Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Forschung

Biologie

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz von gelb fluoreszierende Protein Tagged p62 in Aggresome-induzierten Strukturen

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...