Name: fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
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Diese Arbeit wurde vom NIH Grants 068.625, NSF Zuschüsse 1.063.188 und Center der Physik von lebenden Zellen 0822613. Besonderer Dank geht an Dr. Marina Marjanovic in Beckman Institute for Advanced Science and Technology für das Geschenk von Kaninchenaugen unterstützt.

Ethik-Erklärung: Die Hornhaut Gewebe von Kaninchen wurde in Übereinstimmung mit der Universität von Illinois Institutional Animal Care und Verwenden Richtlinien gesammelt. 1. TIRFM-Setup HINWEIS: Tragen Laser-Schutzbrille die ganze Zeit. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle in der Liste der Materialien aufgeführt notwendigen optischen Komponenten sind verfügbar und bereit für die Ausrichtung. Falls erforderlich, verwenden Ersatz mit gleichwertigen Funktionen von anderen Unternehmen. Stellen Sie sicher, dass Spiegel und Linsen sollten Antireflexbeschichtungen (AR) passend zum Laser im Einsatz haben. </li><li> Stellen Sie die Höhen aller optischen Komponenten auf die Höhe des Zentrums des Mikroskops zurück Port. </li><li> Montieren Sie den Laser, Laser-Shutter und ND-Filter (n). ND-Filter, um die Laserleistung so gering wie möglich zu dämpfen, nach unten, während die Balken sichtbar. Ziehen Sie die Schrauben mit entsprechenden Sechskantschlüssel. </li><li> Planen Sie ein Strahlengang und markieren Sie es mit Klebeband oder Markierung auf der optischen Tisch (dotTed blauen Linien in Abbildung 1). Der Einfachheit halber halten gerade Wege entlang der Linien von Löchern auf der optischen Tisch. </li><li> Ort Spiegel M1 (Abbildung 1) an der ersten rechten Winkel dran. Legen Sie die beiden Blenden entlang der zweiten geraden Abschnitt der geplanten Strahlengang. Einzustellen sowohl die Position und die Neigung des M1, so dass die Laser geht durch die Iris. </li><li> Ort Spiegel M2 (Abbildung 1) an der zweiten rechten Winkel dran. Legen Sie das 10X Beam Expander (L1 L2 &amp;, Abbildung 1) entlang der dritten geraden Abschnitt des Pfades. Seine Neigung einzustellen, so dass die Strahlaufweitung parallel zu sowohl der optischen Tabelle und der geplanten Strahlengang ist. <ol><li> Einzustellen M1 und M2 iterativ so dass die Laser geht geradlinig durch die Zentren der beiden Linsen der Strahlaufweiter. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Strahlprofil des aufgeweiteten Strahl ist nicht-begrenzten Gauß. </li></ol></li><li> Stellen Sie M1, um den Strahl auf L1 zentrieren (FiGüre 1) und M2, um den Strahl auf L2 (1) iterativ zu zentrieren. Eine schlechte Strahlprofil bedeutet in der Regel der Laser abgeschnitten; verwenden Sie ein Stück weißes Papier, um den Strahl nach der Strahlaufweitung zu blockieren, um die Strahlprofil mit den Augen zu überprüfen. Für hochgenaue Analyse, verwenden Sie einen optischen Strahl Profiler. </li><li> Den Abstand zwischen L1 und L2, so daß der Strahl kollimiert. Wiederholen Sie Schritt 1.8 und 1.9, wenn nötig. HINWEIS: Wenn die Strahlgröße nicht mit der Entfernung ändern, ist der Strahl gebündelten genug für eine TIRFM-Setup. Um die Strahlkollimation weiter zu verbessern, könnte Werkzeuge wie Scheren-Interferometer verwendet werden. Eine typische Strahlgröße nach der Expansion ist ~ 20 mm. </li><li> Shutter des Lasers. Schrauben Sie den Mikroskopobjektiv und schrauben in einer Leuchtstoffausrichtungsziel. Ort Spiegel M3 und M4 (1), um den expandierten Strahl in den Mikroskopöffnung und auf den dichroitischen Spiegel in dem Revolverkopf zu leiten. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl springt ter dichroitische und gegen die Decke. </li><li> Passen M3, um die hellste Teil des Lichtstrahls auf dem Leucht Target Center und M4, um die Strahlneigung einstellen vertikal zu werden. </li><li> Shutter des Lasers und schrauben das Ziel wieder ein. Wenn die Ausrichtung im vorherigen Schritt ist getan und sollte es eine symmetrische Ort Verlassen des Ziel sein. Feinabstimmung der Neigungen von M3 und M4, die Laserleistung und Strahlprofil aus dem Ziel zu optimieren. </li><li> Montieren Sie eine EM-CCD Kamera mit dem Mikroskop und schließen Sie die Kamera an einen Computer. Starten der Software für die Kamera. </li><li> Montieren Sie eine Leuchtstoffprobe (Lösung von Fluorophore) auf dem Mikroskop. Schauen Sie sich die hell fluoreszierende Fleck auf der Kamera. Überprüfen Sie, dass der Spot nicht auf dem Bildschirm verschieben, wenn der Fokus geändert wird. </li><li> Platzieren Sie die TIR-Linse (L3, 1) auf der XYZ-Stufe in einem Abstand von der hinteren Brennebene des Objektivs, die gleich der Brennweite der L3 (~ 30 cm) ist. Stellen Sie die Position der L3so dass die Laser geht durch das Zentrum der Linse. </li><li> Übersetzen L3 entlang des Strahlengangs um die Strahlkollimation einzustellen. Sicherstellen, dass der Strahl immer noch auf dem Bildschirm zentriert und in der Form symmetrisch. HINWEIS: Die Beleuchtungsbereich an den Probenebene steigt mit abnehmender TIR-Linse Brennweite. In der Regel verwenden die kleinste Brennweite, am Set-up passen. </li><li> Übersetzen L3 senkrecht zum Strahlengang, um den Strahl von dem Ziel zu kippen. Halten der Übersetzung des TIR-Linse derart, daß TIR erreicht. Eine Probe von fluoreszierenden Kügelchen beobachten durch die EM-CCD-Kamera, und die Feinabstimmung L3 gute SNR zu erhalten. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Optische Konfiguration für Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM). 2. FIONA auf Cy3-DNA <ol><li> Cschlanke Objektträgern und Deckgläsern: Spülen Objektträgern und Deckgläsern mit ddH2O und Isopropanol und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas; Legen Sie die Folien und Deckgläser in der Plasmareiniger für 5 min unter Argon-Plasma. </li><li> Konstrukt Probenkammern (wie in Figur 2 skizziert). <ol><li> Legen Sie ein Gewebe auf der Bank und dann legte ein Stück Papier Linse auf der Oberseite des Gewebes. Legen Sie die Folie auf der Linse Papier. Stellen Sie sicher, dass der sauberen Seite der Folie nach oben zeigt. </li><li> Gelten zwei Streifen von doppelseitigem Klebeband auf die Folie entlang der Längskanten, wobei ein Spalt von 3-5 mm in der Mitte. Legen Sie die gereinigten Deckglas der Folie. Stellen Sie sicher, dass die saubere Seite des Deckglases wird die Folie gegenüber. </li><li> Verwenden Sie eine Pipettenspitze nach unten über das doppelseitige Klebeband drücken. Verwenden Sie einen Rasierer, um überschüssige Band aus der Folie zu entfernen, so dass das Band nur noch unter dem Deckglas. HINWEIS: Die offenen Enden der Kammer offen gelassen und dienen als Einlass und auslassen. Das Kammervolumen beträgt mehrere Mikroliter. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Skizze einer typischen Probenkammer (a) Draufsicht. (B) Seitenansicht von rechts; (C) Seitenansicht von vorne. <ol start="3"><li> Immobilisierung von Cy3-DNA auf den inneren Oberflächen der Probenkammern. <ol><li> Bereiten T-50-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Vorbereitung BSA-Biotin in T-50 in einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Vorbereitung T50-BSA-Puffer durch Lösen von BSA in T-50 in einer Endkonzentration von 10 mg / ml. </li><li> Planen 0,5 mg / ml Neutravidin in T50-BSA-Puffer. Vorbereitung biotinylierten Cy3 markierter DNA (Cy3-DNA) in T50-BSA in einer Endkonzentration von 5-10 pM. </li><li> Je 10 ul BSA-Biotin (1 mg / ml) in die Probenkammer. Warten Sie 5 min. </li><li&gt; Waschen Sie die Kammer mit 40 ul T50-BSA. Je 10 ul Neutravidin (0,5 mg / ml) in die Probenkammer. Inkubation für 5 min. </li><li> Die Kammer mit 40 ul T50-BSA waschen. Je 20 ul Cy3-DNA in die Probenkammer. Inkubation für 5 min und dann waschen die Kammer mit 80 ul T50-BSA. </li></ol></li><li> Bild Cy3-DNA-Einzelmolekülen unter TIRFM. <ol><li> Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen von 1 ul Protocatechuat 3,4-Dioxygenase (PCD, 5 uM), 4 ul Protocatechusäure (PCA, 62,5 mM), 50 ul 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carbonsäure (Trolox, 2 mM in T-50) und 45 ul T50-BSA. </li><li> Pipette in 30 ul Imaging Puffer und warten 8-10 min. </li><li> Montieren Sie die Probe für die Bildgebung auf einem TIRFM, die mit einem grünen Laser (532 nm) ausgestattet ist, eine 100X Ölimmersionsobjektiv (NA 1,45) und eine EM-CCD-Kamera. </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 bis 500 ms und EM Gewinn auf 25 bis 100. Erwerben Sie einen Film der Probe für 1,000 Frames. </li></ol></li><li> Führen FIONA die Analyse der Daten der aufgenommenen Bilder von Cy3-DNA. <ol><li> Bestimmen Sie die effektive Pixelgröße (dh Umrechnungsfaktor von Pixel zu Nanometer) durch Division der physikalischen Pixelgröße (gelesen aus dem Datenblatt des EMCCD-Kamera) durch die Gesamtvergrößerung (die Vergrößerung des Mikroskopobjektivs multipliziert mit irgendwelche zusätzlichen Vergrößerung). </li><li> Bestimmung der Umwandlungsfaktor von Pixelintensitäten zu Nummern durch Dividieren CCD-Empfindlichkeit (dh Elektronen pro A / D-Zählung aus dem Datenblatt der CCD-Kamera gelesen) von der Elektronenvervielfacher (EM) Zunahme während der Bildaufnahme verwendet Photon. </li><li> Kompilieren und ausführen FIONA.pro für FIONA-Analyse. Verwenden Sie diese IDL-Programm, das erworbene Bild zu importieren, die Eingabe der effektiven Pixelgröße (aus Schritt 2.5.1) und dem Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) und um Punkte für FIONA Analyse wählen. HINWEIS: Am Ende, das Program mit Ausgabe der Anpassungsergebnisse mit 2D Gauß-Funktionen, sowie Gesamtphotonenzahlen und Lokalisierungsgenauigkeit. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse und 4c-4d gezeigt. </li><li> Kompilieren und ausführen phcount.pro zu Photonenzahl zu charakterisieren. Verwenden Sie diese IDL-Programm, um die durchschnittliche Anzahl der Photonen, die von einem Fluorophor vor Photobleaching emittiert wird, um das erfasste Bild und die Eingabe der Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) zu importieren. HINWEIS: Das Programm wird dann automatisch zu erkennen fluoreszierende Flecken (manuelle Auswahl ist eine Option) berechnen Photonen als Funktion der Rahmennummer und geben die Spuren von Photonen. <ol><li> Verwerfen schlechte Spuren und geben Rahmen Bereiche after photo für Basislinienkorrektur. Am Ende wird das Programm Ausgabe eine Liste der Gesamtphotonenzahlen für alle Flecken nicht verworfen. Dann zeichnen Sie die Verteilung der Photonenzahlen und passen die Verteilungtion mit einem exponentiellen Abfall, um die durchschnittliche Photonenzahl zu erhalten. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse gezeigt und Fakten 4e-4f. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Angewandte FIONA zu Motor (zB Myosin auf Aktin) Dynamik auf der Nanometerskala zu quantifizieren <ol><li> Polymerisieren Aktin (dh vorzubereiten F-Actin) einen Tag vor FIONA Experiment. <ol><li> Rekonstituieren G-Aktin (Monomer) und Biotin G-Aktin (Monomer) bis 10 mg / allgemeiner Actin-Puffer ml. Rühren, um sicherzustellen, dass beide vollständig gelöst und halten sowohl auf Eis. </li><li> Mischungs 10 ul G-Aktin (Monomer) mit 1,7 ul Biotin-G-Aktin in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l eiskaltem Puffer Aktin-Polymerisation. </li><li> Wird die Mischung über Nacht bei 4 ° C (F-Aktin) gebildet und fügen ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 1 ml. </li><li> Speichern der Aktin-Filamente (F-Actin) bei 4 ° C für die spätere Verwendung in den Experimenten. HINWEIS: Filamente zerfallen und über die Zeit zu verkürzen, kann jedoch für mindestens zwei Wochen verwendet werden. </li></ol></li><li> Probe vorbereiten für die Bildgebung. <ol><li> Machen Sie eine Probenkammer (in Protokoll 2.1 und 2.2 beschrieben). Pipette in 20 ul biotinyliertes BSA 1 mg / ml in ddH 2 O. Inkubation für 10 min. Spülen Sie mit 30 ul ddH 2 O. HINWEIS: Dies blockiert die Glasoberfläche und legt Biotin für die Bindung der Aktin-Filamente. Biotinylierten Poly-L-Lysin - Polyethylenglykol (PLL-PEG) konnte die gleiche Funktion erfüllen. </li><li> Pipette in 0,5 mg / ml Neutravidin. Inkubation für 2 min und dann waschen die Kammer mit 30 ul M5 Puffer. </li><li> Pipette in die hergestellte F-Actin-25-fach verdünnt in allgemeiner Actin-Puffer auf eine Endkonzentration ~ 0,004 mg / ml. Warten Sie 10 min, spülen Sie die Kammer mit 30 ul Puffer. </li><li> Verdünnen Myosin Va mit FLAG-Tags 30-fach in M5 Puffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) in einer Endkonzentration of 250 nM. Mischen Sie 1 ul Myosin mit 1 ul Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 um, von Anti-Flag-Antikörper und Qdot705 konjugiert mit der Qdot705 Antikörperkonjugation Kit nach der Anleitung des Herstellers). Fügen Sie in 8 ul M5 bis zu 10 ul zu füllen. Pipette auf und ab, um gut zu mischen. Inkubation für 10 Minuten auf Eis. ANMERKUNG: Dies ergibt ein Gemisch aus 1 bis 4 Motor Quantenpunkte bei ~ 25 nM Konzentration Myosin. </li></ol></li><li> Bildgebung des Myosin-Aktin zu Fuß auf. <ol><li> Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen 84 ul BSA-M5 (M5 Puffer mit 1 mg / ml BSA), 1 ul ATP (50 uM in ddH 2 O), 2 ul DTT (500 mM in ddH 2 O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 ul PCA, 1 ul Myosin-qdot nach 2,5 nM Konzentration Myosin, und 1 ul BME verdünnt weitere 10-fache. </li><li> Pipette in 20 ul Imaging-Puffer, um die Kammer zu probieren und Inkubation für 8-10 min. </li><li> Bild der Probe auf TIRF-Mikroskop bei 30 ms Belichtungs. Erwerben mindestens 1.000 Frames. Stellen Sie die Lautstärke von Myosin-qdot in Schritt 3.3.1, wenn nötig. </li></ol></li><li> Führen Sie die Datenanalyse und finden Sie die Schrittgröße von Myosin Walking. <ol><li> Öffnen Sie die Videodatei in ImageJ 17 und schneiden Sie das Video um einen beweglichen Ort. Ernte eine ausreichend große Fläche, die der Spot nie innerhalb von 20 Pixel der Kante bekommt, und stellen Sie sicher, dass keine anderen Stellen im Video. Sicherzustellen, daß dieser Punkt in einem linearen Weg bewegt. </li><li> Verfolgen Sie die Stelle durch das Video zu x und y-Koordinaten durch die Zeit, in Pixel, durch die Anwendung FIONA Analyse (Schritt 2.5.3), um jede und jeden Frame des Videos. </li><li> Konvertieren Pixel Nanometern, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. </li><li> Berechnen Verschiebung von der ersten Position als eine Funktion der Zeit. </li><li> Laufen t-Test auf die Verschiebung, die Schritte des Myosin Walking erhalten. HINWEIS: Die für t-Test (step_t_test.zip) versehen Programm wird in IDL und con codiertbesteht aus 14 Unterprogramme im Ordner. <ol><li> Öffnen Sie alle Unterprogramme in IDL und alles übersetzen zweimal. Dann führen Sie mtltyanalysis_ttest.pro und wählen Sie eine Textdatei nur die Entfernungsdaten in einer einzigen Spalte enthält. Ein Ausgang Excel-Datei erzeugt, mit dem Rohdaten, die Passform und die Schrittweite. </li></ol></li><li> Löschen Sie alle Null-Werte aus der Schrittweite Spalte. Zeichnen Sie die Verteilung der Schrittweiten mit Origin oder MATLAB. Setzen Sie einen Gaußschen auf das Histogramm. HINWEIS: Schrittweite von Null-Werte müssen gelöscht werden, da ein Schritt von Null bedeutet, dass kein Schritt des vorherigen Rahmens gemacht. Der Beschlag gibt einen Peak bei etwa 36 nm (wie in 5 gezeigt). </li></ol></li></ol> 4. Dick Probenvorbereitung für FIONA <ol><li> Bereiten Quantenpunkte in Sol-Gel verkapselt. <ol><li> Mischungs 4,5 ml TMOS, 1 ml ddH 2 O und 100 ul HCl (120 mM). Beschallen die Mischung auf Eis für 30 min in der Ultraschall-Reiniger spin der Liste der Materialien ecified (Frequenz = 40 kHz, = Heizung aus). Mischen Sie die Lösung alle 10 min. </li><li> 1,5 ul verdünnte Qdot605 in 1,5 ml HEPES (50 mM, pH 7,2). Mischungslösung mit 1,5 ml TMOS aus dem vorherigen Schritt. </li><li> Gießen Sie die Mischung in eine Glasbodenschale. Glas verschließen Bodenschale mit Parafilm und bei 4 ° C für 1. 5 Stunden. </li><li> 2 ml 1% BME in PBS an die Probenschale und bei Raumtemperatur für 30 Minuten vor der Bilderzeugung. </li></ol></li><li> Bereiten Hornhaut Probe mit Quantenpunkten gefärbt. HINWEIS: Kaninchen-Augen waren Geschenke von Dr. Marina Marjanovic. <ol><li> Trennen Sie die Hornhaut von den Augen und schneiden Sie es in 3 mm x 3 mm große Stücke. </li><li> Verdünnen 1 ul Qdot 605-Streptavidin in 1 ml PBS. Inkubieren Sie die Hornhautgewebe mit 1 nM Qdots Lösung bei 4 ° C für 1 Stunde. Das Gewebe mit PBS waschen. </li><li> Nehmen Sie einen sauberen Glasobjektträger und Deckglas ein # 1.5. Setz 4 Schichten doppelseitigen Klebeband auf dem Glasobjektträger entlang der längeren Seite, einnd Anders 4 Schichten doppelseitiges Klebeband parallel zum vorherigen Band und hinterlassen einen Kanal ca. 1 cm dazwischen. Legen Sie das Gewebe aus dem vorherigen Schritt in der Mitte des Kanals, und decken Sie es mit einem Deckglas. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf den Seiten des Deckglases, um sie auf die Bänder kleben. Befeuchten Sie den Kanal mit 50 ul PBS vor Bildgebung. </li></ol></li><li> Bild Quantenpunkte in Sol-Gel-und Hornhaut. <ol><li> Fiona Bildgebung in dicken Proben, verwenden Sie ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,27 mm, oder ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,28 mm. </li><li> Montieren Sie die Probe auf dem Mikroskop. Einstellen der TIRF-Linse derart, daß sie die Auflicht-Fluoreszenz-Modus erreicht (dh der Laserstrahl tritt aus dem Ziel mit einem Winkel gegenüber dem Deckglas). Legen Sie eine zusätzliche Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X). </li><li> Bewegen der Fokusebene des Objektivs zu einer gewünschten Z-Position (zB&gt; 200 um). Rekord Bilder von immobilenQuantenpunkte in der Probe. </li></ol></li><li> Führen FIONA Analyse, wie in Abschnitt 2.5 dieses Protokolls beschrieben. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

FIONA ist eine Technik, um die Position eines optischen Emitter (organisches Fluorophor oder Quantenpunkt) mit Nanometer-Präzision und zeitlichen Auflösung von bis zu 1 ms 4 bis 8 zu lokalisieren. Wenn genügend Photonen gesammelt werden, ermöglicht diese Technik, um die Position einer fluoreszierenden Emitter viel genauer als die Beugungsgrenze (~ 200 nm) zu bestimmen und somit dieses Verfahren eröffnet eine Möglichkeit, um zu beobachten, was mit herkömmlichen / traditionelle optische Mikroskopie ...

Rund 1882 Ernst Abbe festgestellt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskops sichtbar ist ~ λ / 2NA oder ~ 200 nm (wo λ die Wellenlänge und NA die numerische Apertur) 1,2. Daher würde jedes Objekt kleiner als diese Dimension als beugungsbegrenzten Fleck in einem optischen Mikroskop erscheinen. Jedoch ist es möglich, die Mitte des Flecks, das heißt, die Position des Objekts zu bestimmen, mit einer viel höheren Präzision 3. Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene 4. Die Genauigkeit der Lokalisierung, σ μ (dh die Standardabweichung des Mittelwerts), hängt von der Gesamtzahl der gesammelten Photonen, <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> , Wobei N die Photonenzahl, s die Standardabweichung der Leuchtfleck, adie Pixelgröße der Bilddetektor, und b die Standardabweichung der Hintergrund 3,4. Für einen Fluorophor emittiert ~ 10.000 Photonen können FIONA erreichen ~ 1 nm Präzision 4. Fiona verwendet, um die Position eines stationären Emitter oder ein Bewegen eines (vorausgesetzt Bilder schnell genug gemacht werden) exakt zu bestimmen. FIONA können, um den Rahmen des Films angewendet werden sequentiell und damit verfolgen die Bewegung der Einzelmolekül-4-8. Lichtschutz Reagenzien notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Probe nicht photochemisch. Weiterhin können die fluoreszierenden Objekts selbst beliebig groß sein, kleiner oder größer als die Beugungs Begrenzung- zB kann es aus einer Organelle (~ 1 um) mit vielen fluoreszierenden Proteine ​​auf ihrer Membran dispergiert bestehen. Mit FIONA kann immer noch eine sehr genaue (Nanometer) Durchschnitt der durchschnittlichen Mitte-der-Masse ergeben. Die große Verbesserung in Lokalisierungsgenauigkeit von Fiona ermöglicht die Lösung nanometer-Skala Bewegungen über die Zeit. Dies hat die Mikroskopie in die molekularen Längenskala 4 bis 8 geschoben. Seit ihrer Erfindung haben Varianten von FIONA entwickelt. Zum Beispiel Hellfeld-Bildgebung mit einem-Nanometer-Genauigkeit (bFIONA) 9, eine leichte Variante der FIONA, Bilder und lokalisiert dichte Objekte wie Melanosomen in vivo (dunkle Objekte, die das Pigment Melanin) mit Durchlicht. Darüber hinaus FIONA wurde eingesetzt, um mehrere Farbstoffe zu lösen. Zum Beispiel, Einzelmolekül-hochauflösende Bildgebung mit Photobleaching (Garnelen) 10,11 oder Einzelmolekülhochauflösende Kolokalisation (SHREC) 12 entwickelt worden, um zwei Farbstoffe innerhalb von etwa 10 nm zu lösen. (Beachten Sie, dass dies Auflösung, dh wie genau kann man identische Farbstoffe auseinander zu halten.) Vor kurzem hat FIONA Analyse auf die Lokalisierung bestimmter superauflösende Mikroskopie beigetragen wie stochastische optische RECOnstruction Mikroskopie (STORM) 13-15-und Foto-aktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) 16, in dem temporäre dunklen Fluorophore sind aufgeregt, und dann wird die Fluoreszenz lokalisiert. Durch wiederholtes spannende einem relativ niedrigen Dichte von Farbstoffen (weniger als eine pro beugungsbegrenzten Fleck) und dann das Sammeln der Fluoreszenz, die Analyse jeder von ihnen von Fiona, kann man aufbauen eine hochauflösende Karte. Die Auflösung wird dann einfach durch die Anzahl der Photonen jeder Farbstoff setzt heraus, als auch Dinge wie bei der Akquisition halten die Probe stationär (einschließlich zB der Mikroskoptisch) begrenzt. In diesem Papier, eine Zusammenfassung der FIONA Technik und beschreiben Sie kurz Beispiele von Forschung, die unter Verwendung von FIONA wird berichtet haben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie manDurchführung einer einfachen FIONA Experiment auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, veranschaulicht. Danach wird die Verwendung von Fiona 36 nm Schrittweite eines einzelnen abgeschnittenen Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert, um zu messen, ist dargestellt. Myosin Va ist ein wesentlicher Motor prozessive Protein, das zelluläre Fracht trägt, während Translokation entlang Aktin-Filamente. Hier eine Myosin Va konstruieren stumpf wird verwendet, um Bereiche irrelevant für die Schrittgröße zu entfernen, und mit einem Flag-Tag an den C-Terminus angefügt, um eine einfache Markierung mit Quantenpunkten mit Anti-FLAG-Antikörper funktionalisierten ermöglichen. Dieses Experiment wird unter niedrigen ATP getan, um die Myosin verlangsamen und ermöglichen die Verwendung von Belichtungszeiten lang genug, um eine gute Photonenzahl in jedem Rahmen zu bekommen. Jede ausreichend hell fluoreszierende Markierung könnte in dem folgenden Protokoll ersetzt werden. Schließlich jüngsten Anstrengungen der Verlängerung der Anwendung der FIONA zu dicken Proben berichtet. Als Proof-of-Prinzip wurden Quantenpunkte eingeweichtin Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhaut und dann abgebildet und lokalisiert mit FIONA. Für die Bildgebung, ein 60X Wasser Immersionsobjektiv mit NA = 1,2 wurde verwendet, da dieses Ziel hat eine längere Distanz als bisher verwendete 100X Ölimmersionsobjektiv. Um den Verlust in der Vergrößerung in dem Ziel auszugleichen, wurde ein extra-Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X) in der Emissionspfad eingefügt. Darüber hinaus Auflicht-Fluoreszenz (nicht TIR)-Mikroskopie muss verwendet werden, um tiefe Regionen in den dicken Proben zuzugreifen. Es wird gezeigt, dass die Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gels und im Kaninchenauge Hornhäute (Z&gt; 200 um) können mit 2-3 nm Präzision lokalisiert werden.

<table><tbody><tr><td>Double-sided tape</td><td>3M</td><td></td><td>~75 &amp;#181;m thick</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>Branson</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>Actin polymerization buffer&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>Biotin G-actin</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>G-actin&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>General actin buffer&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>Laser shutter (with driver)</td><td>Electro-Optical Products Corp.&amp;nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22X30-1.5</td><td>0.16-0.19 mm thick</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Gold Seal Microslides&amp;nbsp;</td><td>30103X1</td><td>0.93-1.05 mm thick</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#039;Bio</td></tr><tr><td>Fluorescent beads&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical table</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>RS4000 Series</td></tr><tr><td>60X Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X Objective</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 Oil &amp;infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X Objective</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3755</td><td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td></tr><tr><td>CP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937</td><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td>DL-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>Protocatechuic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>Tetramethyl orthosilicate</td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td></tr><tr><td>1&amp;rdquo; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BB1-E02, KM100</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; diameter posts</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>TR4</td><td>Quantity &amp;ge; 6</td></tr><tr><td>10X beam expander</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rdquo; diameter f = 300 mm lens with mount</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LA1256-A, LMR2</td><td>TIR lens</td></tr><tr><td>Fluorescent alignment target&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>VRC2SM1</td><td></td></tr><tr><td>Laser safety goggles</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>ND filter(s)</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>Optical beam profiler</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Post-mounted iris diaphragm</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ID25</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>Shearing interferometer</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ translation stage, &amp;frac12;&amp;rdquo; travel&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>World Star Technologies&amp;nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm, 30 mW</td></tr></tbody></table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene. Hier eine Zusammenfassung der FIONA Technik wird berichtet, und Beispiele der Forschung, die durchgeführt wurde unter Verwendung Fiona kurz beschrieben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie man auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, gefolgt von der Nutzung von FIONA um die 36 nm Schrittweite von einer einzigen abgeschnitten Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert messen Durchführung einer einfachen FIONA Experiment veranschaulicht. Schließlich jüngsten Bemühungen um die Anwendung FIONA zu dicken Proben erstrecken wird berichtet. Es wird gezeigt, dass mit einem Wasserimmersionsobjektiv und Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhäute (&gt;200 um) Lokalisierungsgenauigkeit von 2-3 nm erreicht werden.

Ein typisches Ziel-Typ TIRFM Aufbau ist in Abbildung 3 dargestellt. Zuerst wurde auf der Oberfläche immobilisierten Cy3-DNA Probe abgebildet. Ein typisches Bild ist in 4a gezeigt. Das Bild wurde mit 0,5 Sekunden Belichtungszeit aufgenommen, mit EM Verstärkung = 50 und CCD-Empfindlichkeit = 12.13 für die Kamera. Die Punktbild-Funktion (PSF) eines Cy3-DNA-Molekül ist in 4b dargestellt (von der durch den Pfeil in Figur 4a angedeutet Stelle), wo die Far...

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Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

17.6K Aufrufe.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben. 

Serie: Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Forschung

Ingenieurwesen

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Entwicklungsbiologie

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biotechnik

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologie

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Immunologie und Infektion

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...