Teil 1: Vorbereiten des mikrofluidischen Neuron Gerät <ol><li> A 3 &quot;Silizium-Wafer mit einem Muster aus der SU-8 durch Photolithographie hergestellt wird verwendet, um die Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen gegossen. Wir verweisen auf die SU-8 gemusterten Silizium-Wafer als Master Formen, oder&quot; Meister &quot;. </li><li> PDMS mit Härter bei aw / w-Verhältnis von 10:1 vermischt wird, das heißt, für 10 Gramm PDMS ist 1 Gramm Härter dazugegeben. </li><li> Die PDMS ist dann gut gemischt und gegossen auf den Silizium-Wafer. Die Silizium-Wafer ist in einem 10 cm Polystyrol-Petrischale enthalten. Es dauert etwa 12 g bis 15 g PDMS an den Master mit einer Dicke von ca. 4 mm abdecken. </li><li> Der Meister mit dem PDMS wird dann in einem Vakuumexsikkator mit dem Deckel der Petrischale gelegt, und Vakuum angelegt. Dies geschieht zur Beseitigung von Luftblasen aus der PDMS, dass beim Rühren in der Härter eingeführt wurden. Es dauert etwa 15 Minuten für die Luftblasen zu entfernen. </li><li> Der Meister mit PDMS ist aus dem Exsikkator entfernt. Ein Luftgewehr mit einem 0,45 um Filter verwendet wird, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen. </li><li> Der Master ist dann auf einer 80 ° C heißen Platte für 1 Stunde zu heilen platziert. </li></ol> Hinweis: Wenn einem Vakuumexsikkator nicht verfügbar ist, kann der Master bei Raumtemperatur für mehrere Stunden verlassen werden. Die Luftblasen verschwinden dann schließlich auf eigene Faust zu zerstreuen. Wenn eine heiße Platte nicht verfügbar ist, wird die PDMS bei Raumtemperatur nach 24 Stunden aushärten. Hinweis: Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass der Master-Ebene wird während der Aushärtung. Teil 2: Ausschneiden des Neurons Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Sobald die PDMS auf dem Master geheilt ist, ist es zu einer sauberen Haube genommen. </li><li> Mit einem Skalpell wird ein Kreis um den Umfang der Geräte senken. Wenn man fügt die Klinge in den PDMS, ist es wichtig, den Kontakt mit dem Silizium-Wafer zu machen, sondern um nicht zu viel Druck auf den Wafer, sonst wird der Meister zu knacken. </li><li> Mit einem Kreis schneiden den ganzen Weg um die Geräte (es gibt 4 Geräte pro 3 &quot;Silicon Master), wird die PDMS vorsichtig von der Master-gehoben. Das durch vorsichtiges Drehen des Skalpells gestartet werden kann, wie es in den vorherigen Schnitt eingeführt wird . </li><li> Als nächstes werden Reservoirs in das Gerät mit einem 8 mm Gewebebiopsie gestanzt. </li><li> Die Geräte werden dann geviertelt und überschüssiges PDMS getrimmt, so dass das Gerät ordentlich fit zu Corning Deckglas (Nr. 1) 24 mm x 40 mm. Stickstoff Luft wird verwendet, um wegblasen überschüssige Ablagerungen. Hartnäckige Verschmutzungen können auch unter Verwendung von 3M Scotch Brand 471 Vinylband werden. </li></ol> Teil 3: Plasma Bindung der Geräte an Glasdeckgläschen. <ol><li> Plasma Cleaner ist zur Bindung A Harrick das Neuron Geräte an die Deckgläser verwendet. Kurz gesagt, werden die Geräte in der Plasma-Reiniger montiert und eine Vakuumpumpe wird verwendet, um Luft aus der Kammer zu evakuieren. </li><li> Nach der Vakuum-Druck 300 milliTorr erreicht hat, ist die Macht an die elektrische Spule eingeschaltet und auf hoch. </li><li> Die elektrische Spule erzeugt Plasma &quot;, ein teilweise ionisiertes Gas aus Elektronen, Ionen und neutralen Atomen oder Molekülen&quot; - <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a> , aus der restlichen Luftmoleküle in der Kammer links. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf der Oberfläche des Glases und das Gerät, das bei platziert zusammen eine dauerhafte Verbindung bilden. Das Plasma dreht sich auch die Oberflächen hydrophil, was erleichtert die Zugabe von Flüssigkeiten hilft. Zudem sterilisiert der Plasma-Reiniger der Geräte. Die Oberfläche des PDMS-Gerät, das die Mikrofluidikvorrichtung enthält, ist offen ausgelegt in die Plasma-Reiniger zusammen mit dem Glasträger. Das Plasma behandelten Oberflächen der Glas-und Mikrofluidik-Gerät sind in Kontakt miteinander auf einer sauberen Werkbank montiert, dann in sterile 60 mm Schalen gelegt. Die behandelten Oberflächen bilden einen dichten irreversible Bindung. </li><li> Innerhalb von 10 Minuten von Plasma-Bindung der Geräte an Glas, Poly-L-Lysin (PLL) mit dem Gerät aufgenommen. Nach 10 Minuten wird die Hydrophilie des Gerätes verringern so dass es schwierig für die PLL auf das Gerät gelangen. Hinweis: Es ist wichtig, auf Luftblasen in das Gerät nach der Zugabe von PLL überprüfen. Luftblasen in den Hauptkanal sind unerwünscht, da sie Zellen würden oxidieren. Eine einfache Methode, um alle vorhandenen Luftblasen zu entfernen ist es, ein P200-Pipette mit 150 ul der Flüssigkeit (in diesem Fall PLL) gefüllt verwenden, legen Sie die Spitze direkt an der Eröffnung der Hauptkanal, und drücken Sie den P200 mit Nachdruck. Diese müssen eventuell mehrmals wiederholt werden, aber schließlich die Kraft aus der Pipette wird die Blasen austreiben. </li><li> Die Geräte mit PLL dürfen inkubieren über Nacht in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, dem deLaster sind zweimal schnell hintereinander mit autoklaviertem dH2O gespült. Während dieses Prozesses wird die Flüssigkeit nie ganz aus der Hauptkanäle entfernt, nur aus den Reservoirs. Entfernen von Flüssigkeit aus den wichtigsten Kanäle einführen Blasen. Nach 2 schnellen spült, sind die Geräte mit autoklaviertem dH2O gefüllt und wieder in den Inkubator für ein Minimum von 3 Stunden gesetzt, oder über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag sind die Geräte wieder 2 mal schnell mit autoklaviert dH2O gespült. Dann wird neuronalen Basalmedien, enthält die notwendigen Ergänzungen B27 und Glutamax zur Kultivierung von primären Ratten-Neuronen, die Geräte hinzugefügt. Die Geräte sind zurück in den Inkubator für die zukünftige Verwendung platziert. Die Geräte sind nun bereit für die Aussaat von Neuronen. </li></ol>

<ol>
	<li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research..">Microfluidic culture platform for neuroscience research..</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li></ol>

In diesem Video haben wir gezeigt, wie man und bereiten eine PDMS Mikrofluidik-Gerät, das wir verwenden, um Kultur Neuronen in. Das Gerät ermöglicht es uns, eine reine axonalen Fraktion durch Mikrorillen aus dem Fach mit einer Mischung aus Zellkörper, Dendriten und Axone getrennt zu erhalten . Diese Geräte ermöglichen dem Forscher die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen Studie sowie eine Plattform für die Durchführung des Körpers auf die Axone und beobachten, welche Auswirkungen diese Behandlungen sind auf die Neuronen. Das Gerät bietet auch ein Niveau von um Kultivierung Neuronen, erleichtern den Transport Studien hilft. Darüber hinaus ermöglicht die Mikrorillen, die die Zellkultur-Fach getrennt von der Axon-Fach, für fluidische Trennung zwischen den beiden Kammern macht es möglich, eine Seite des Geräts, ohne die andere Seite des Geräts direkt mit der Behandlung zu behandeln. Diese Eigenschaft erlaubt es dem Forscher, um Effekte wie Signaltransduktion und Transport, die sich aus der Behandlung zu untersuchen.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylgard 184 with curing agent

Please consult Dow Corning to find a vendor near you</td>
</tr>
<tr>
<td>Plasam Cleaner</td>
<td>Tool</td>
<td>Harrick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.harrickplasma.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Basal Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cornig No. 1 Cover Glass</td>
<td>cover glass</td>
<td>Corning</td>
<td>Corning No. X2935 244</td>
<td>Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D</td>
</tr>
<tr>
<td>60 mm Petri Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-13A</td>
<td>60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352098</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon 15 ml tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352097</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1274</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons

In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen herzustellen. Zuvor war ein Silizium-Wafer mit dem Entwurf für das Neuron Mikrofluidikvorrichtung mit SU-8 und Photolithographie zu einem Master-Werkzeug zu schaffen, oder das, was wir uns einfach als &quot;Master&quot;-Muster. Anschließend gießen wir das Silizium-Polymer PDMS auf der Oberseite des Meisters, die dann durch Erhitzen des PDMS zu 80 ° C für 1 Stunde ausgehärtet. Die PDMS bildet eine Negativform des Gerätes. Das PDMS wird dann sorgfältig geschnitten und weg von der Master-gehoben. Löcher gestanzt werden, wo die Lagerstätten werden und der überschüssige PDMS getrimmt vom Gerät weg. Stickstoff wird verwendet, um wegblasen überschüssige Ablagerungen aus dem Gerät. An diesem Punkt sind die Geräte jetzt einsatzbereit und kann entweder nach Corning Nr. 1 Deckglas mit einem Plasma-Sterilisator / Reiniger oder reversibel an das Deckglas, indem Sie einfach das Gerät auf der Oberseite des Deckglases gebunden gebunden. Die reversible Bindung des Gerätes an Glas wird in einem separaten Video abgedeckt und erfordert zunächst, dass das Gerät entweder mit 70% Ethanol oder durch Autoklavieren sterilisiert werden. Plasma Behandlung sterilisiert die Geräte, so dass keine weitere Behandlung notwendig ist. Es ist jedoch wichtig, wenn Plasma-Behandlung der Geräte, um die Flüssigkeit hinzufügen, um die Geräte innerhalb von 10 Minuten die Plasma-Behandlung, während die Oberflächen noch hydrophil sind. Warten länger als 10 Minuten, um Flüssigkeit hinzufügen, um das Gerät macht es schwierig für die Flüssigkeit auf das Gerät gelangen. Das Neuron-Geräte sind typischerweise Plasma-bound auf Glas und 0,5 mg / ml Poly-L-Lysin (PLL) in pH 8,5 Boratpuffer Abdeckung wird sofort an das Gerät hinzugefügt. Nach mindestens 3 Stunden Inkubation mit PLL, sind die Geräte mit dH2O Wasser mindestens 3-mal mit mindestens 15 Minuten zwischen jeder Wäsche gewaschen. Als nächstes wird das Wasser entfernt und frisches Medium ist, um das Gerät hinzugefügt. An dieser Stelle ist das Gerät einsatzbereit. Es ist wichtig, an dieser Stelle daran erinnern, niemals entfernen Sie alle Medien aus dem Gerät. Lassen Sie immer Medien in den Hauptkanal.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons at JoVE.com

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen farbricate.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

fabrication-microfluidic-device-for-compartmentalization-neuron-soma

Research

JoVE Journal

Biology

35.2K Aufrufe.  University of California, Irvine (UCI). In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen farbricate.

Serie: Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Forschung

Biologie

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Bauelementherstellung und Oberflächenmodifizierung

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

Non-Plasma-Bonding von PDMS für preiswerte Herstellung von Mikrofluidik-Geräte

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

Die Herstellung der thermoplastischen Mikrofluidikkanälen

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...