Wir haben einen zellkulturbasierten sensitiven und quantitativen Assay entwickelt, der zur Bewertung des Sonic Hedgehog-Signalwegs verwendet werden kann, der hauptsächlich über die primären Zilien transduziert wird. Dieser Assay kann verwendet werden, um genetische und epigenetische Veränderungen zu untersuchen, die mit einer primären Ziliendysfunktion verbunden sind. Trotz der zentralen Rolle der primären Zilien bei der Sonic Hedgehog-Signalgebung fehlt es den derzeitigen Methoden oft an der Sensitivität, die erforderlich ist, um die Funktion der primären Zilien unter genetischen Veränderungen zu beurteilen.
Dieses Protokoll füllt diese Lücke, indem es einen zellkulturbasierten Assay bereitstellt, der die Aktivierung von Sonic Hedgehog und die Expression von Sonic Hedgehog-Zielgenen in Flimmerzellen nachahmt. Im Vergleich zu anderen Protokollen, wie z. B. der Lokalisierung des geglätteten Proteins entlang der primären Zilien nach Aktivierung des Sonic Hedgehog-Signalwegs, ist unser Assay quantitativ, einfach zu befolgen und empfindlich, da er auf Zellkulturen basiert. Entfernen Sie zunächst den T25-Zellkulturkolben mit nahezu konfluenten RPE-1-Zellen, die in fünf Millilitern vollständigem Medium aus einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator wachsen.
Das Kulturmedium aus dem Zellkulturkolben entsorgen und die Zellen mit der enzymatischen Aktivität einer vorgewärmten 0,25%igen Trypsin-EDTA-Lösung entfernen. Die Zellen werden in einem Kolben mit einem vorgewärmten vollständigen Medium resuspendiert. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer, um die Zelldichte der Suspension zu bestimmen.
Legen Sie zwei sterile 12-Millimeter-Deckgläser in zwei 35-Millimeter-Zellkulturschalen. Säen Sie zweimal 10 hoch fünf asynchron wachsende RPE-1-Zellen in jede Schale, die Deckgläser enthält. Geben Sie zwei Milliliter vollwertiges Medium in jede Schale und züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang.
Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium aus den wachsenden RPE-1-Zellen und waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter vorgewärmtem DPBS-Puffer. Geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes DMEM-Medium mit 1 % Penicillin-Streptomycin ohne FBS zu jeder Schüssel. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch ein serumarmes Medium, das einen geglätteten Agonisten in einer Endkonzentration von 250 Nanomolaren enthält. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Übertragen Sie die Deckgläser nach der Inkubation auf eine 24-Well-Platte, wobei Sie in jede Vertiefung einen Deckglas legen.
Geben Sie 0,5 Milliliter gekühltes Methanol in jede Vertiefung, um die Zellen zu fixieren. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius. Waschen Sie die Einbezugsbezüge sofort dreimal mit 0,5 Millilitern Waschpuffer.
Entsorgen Sie das Medium aus dem Geschirr. Geben Sie 0,5 Milliliter TRIzol-Reagenz direkt in jede Schale. Verteilen Sie das Reagenz gleichmäßig und lassen Sie es fünf Minuten stehen.
Pipettieren Sie einige Male auf und ab, um eine homogene Mischung zu erhalten, und sammeln Sie sie in nukleasefreien 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen Geben Sie 0,1 Milliliter Chloroform in jedes Röhrchen mit TRIzol-gemischten Zellen, die mit einem geglätteten Agonisten und DMSO behandelt wurden. Inkubieren Sie die Röhrchen zwei bis drei Minuten lang, bevor Sie sie bei 12.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die wässrige Phase, die die RNA enthält, wird in frische Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Geben Sie 0,25 Milliliter Isopropanol in die wässrige Phase und inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Beobachten Sie die Bildung eines weißen, gelartigen RNA-Pellets.
Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette. Dann resuspendieren Sie das RNA-Pellet in 0,5 Millilitern frisch verdünntem 75%igem Ethanol. Drehen Sie die Röhrchen kurz, um das Mischen sicherzustellen.
Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette. Trocknen Sie die RNA-Pellets 10 Minuten lang an der Luft.
Resuspendieren Sie die Pellets in 25 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Messen Sie die Gesamt-RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer bei 260 Nanometern. Verwenden Sie ein bis drei Mikrogramm Gesamt-RNA aus jeder Probe, um cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers für ein cDNA-Synthesekit zu synthetisieren.
Richten Sie die qPCR-Reaktionen in dreifacher Ausführung unter Verwendung einer verdünnten cDNA von eins bis fünf aus jeder Probe mit Primer-Sets von GLI1-, PTCH1-, HHIP-, SMO- und Beta-Aktin-Genen ein, mit einem qPCR-Mastermix in einer fluoreszenzempfindlichen Multi-Well-PCR-Platte. Decken Sie die PCR-Platte mit einer geeigneten Versiegelung ab. Legen Sie die Platte in ein qPCR-Instrument.
Führen Sie das standardisierte qPCR-Programm mit 40 Amplifikationszyklen durch, gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse. Überprüfen Sie nach dem Lauf die Schmelzekurve jedes Amplikons auf einen einzelnen Peak bei der gewünschten Temperatur. Exportieren Sie die Verstärkungsdaten in eine Tabelle.
Berechnen Sie die relative Expression jedes Transkripts durch Normalisierung gegen die Beta-Aktin-Expression, stellen Sie die relativen Expressionsdaten in einem Diagramm dar und berechnen Sie die statistische Signifikanz der Expressionsänderungen mit einem ungepaarten t-Test. Die meisten der serumarmen Zellen bildeten primäre Flimmerhärchen mit mehr als 85% Zilienbildung. In dieser Bedingung waren die Expressionsniveaus von GLI1, PTCH1 und HHIP in glatten, mit Agonisten behandelten Zellen im Vergleich zu DMSO-behandelten Zellen signifikant erhöht, während die SMO-Transkriptspiegel keine signifikante Veränderung zeigten.
