Die technische Unterstützung und Instrumentierung der Universität von Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core Facility, insbesondere Drs. Rena Lapidus und Mariola Sadowska, werden dankbar anerkannt. Die für die Entwicklung dieses Tests zuständig Arbeit wurde zum Teil durch die NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, eine VA Merit Award an AP, und von der Universität von Maryland Zigarette Restitutionsfonds (CRF) an der Marlene Stewart &amp; vorgesehen finanziert Greenebaum Cancer Center.

Mehrere Schritte werden vor der Zeit durchgeführt und mehrere Reagenzien hergestellt und gelagert, bevor das Verfahren: (1) Zellkultur und Proteinisolierung, (2) Herstellung von Oligonukleotid (3) Herstellung von 96-Well-Platten (4) Kernextrakt Inkubation über Nacht. Vorgehensweise benötigt 2 Tagen wegen der Inkubation über Nacht von Kernprotein mit DNA-Oligonukleotiden. 1. Herstellung von Puffern 1.1 Kernproteinisolierung <ol><li> Hypotonischen Puffer: Zu 100 ml hypotonischen Puffer vorbereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl 2), 333 ul (3 M KCl) auf 98,3 ml H 2 O. Endkonzentrationen: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl. Für Hypotone Puffer + NP40 (für den Einsatz in Schritt 2.11): 0,5 ml (10% NP40) auf 9,5 ml hypotonischen Puffer für die letzten 0,5% NP40. </li><li> Niedrigsalzpuffer: Zu 100 ml Niedrigsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 &amp;mgr; l (1 M MgCl 2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 73 ml H 2 O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> Hochsalzpuffer: Zu 100 ml Hochsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 ul (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 47 ml H 2 O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl 2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> 10% NP40-Detergens: 10 ml NP40 bis 90 ml H 2 O </li><li> Protease-und Phosphatase-Inhibitoren [zum hypotonischen Puffer + NP40 (Schritt 2.11), um Niedrigsalzpuffer (Schritt 2.15) und der hohen Salzpuffer (Schritt 2.15) unmittelbar vor der Verwendung]: In 2,5 ul (1 M DTT) und 50 ul Proteaseinhibitoren (100x), 5 ml jedes Puffers für Endkonzentration von 0,5 mM DTT und 1x Proteaseinhibitoren. Der Protease-Inhibitor 100x Stock Mischung beinhaltet:Natriumfluorid (Ser / Thr, saure Phosphatasen), Natriumorthovanadat (Tyr, alkalische Phosphatasen), β-Glycerophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Natriumpyrophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Aprotinin (Ser Proteasen), Bestatin (Amino-Peptidasen ), E64 (Cystein-Proteasen), Leupeptin (Ser / Cys Proteasen), EDTA (Metalloproteasen). </li></ol> 1.2 Vorbereitung der Testplatten <ol><li> Plattenbefestigungslösung: So bereiten Sie 500 ml Lösung werden 5,25 g Natriumcarbonat in 500 ml H 2 O, gut mischen und pH-Wert auf 9,7 für eine endgültige Konzentration von 0,1 M Natriumcarbonat. </li><li> Teller Blockierlösung: Zur Herstellung von Poly Lager dI / dC Oligonukleotid, resuspendieren 1 Unit (~ 50 mg) von Poly dI / dC in 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, der 1 mM EDTA für eine Stammkonzentration von 50 ug / ul. Stock ist bis 1 ug / ul vor der Verwendung verdünnt. </li></ol> 1.3 Waschpuffer und Antikörperverdünnungen HINWEIS: Streptavidin Waschpuffer<html> verwendet werden, um Platten zwischen den Zugaben zu waschen und auf Primär-und Sekundärantikörper verdünnen. <ol><li> Um 1 l Streptavidin Waschpuffer, mit 2.4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), auf 1 Liter Millipore-Wasser sterilfiltriert , pH 7,18. Lagern bei 4 ° C Endkonzentration: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20. </li></ol> 1.4 DNA-Bindungspuffer HINWEIS: Dieser Puffer wird bei -20 ° C gelagert <ol><li> Die Bereitstellung von DNA 15 ml Bindungspuffer, fügen 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 &amp;mgr; l (1 M DTT), 3,0 ml (60% Glycerin), 300 &amp;mgr; l (50 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l poly dI / dC) mit entionisiertem / destilliertem H 2 O (12 ml) verdünnt. Endkonzentrationen: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% Glycerin, 1 ug / ul Poly dI / dC. </li></ol> 2. Zellkultur und Kernproteinisolierung t &quot;&gt; Hinweis: Die Herstellung erfordert etwa 3 h Stimulation von Zellen auf Experiment hängen die Anzahl der Zellen für jedes Experiment variieren und alle Volumen reflektieren ein typisches Experiment unter Verwendung von 3 × 10 7 Zellen / Punkt einstellen Volumen unterzubringen... die Anzahl der Zellen tatsächlich in dem Experiment 6 verwendet. <ol><li> Um Kernprotein für die DNA-Bindungsassays, die Kultur, die menschliche Zellen RUNX2 (Endothel-, Osteosarkom, Brustkrebs-Zellen) in geeigneten Medien 6 exprimieren. </li><li> Gönnen subkonfluente Zellen mit Nocodazol (0,2 ug / ml für 16 Stunden) zu den Zellen in der G2 / M Zellzyklus Grenze 6 verhaften. Unter diesen Bedingungen wird das Protein stabilisiert RUNX2 und maximale DNA-Bindung erreicht wird. Auf diese Weise ist genug Kernprotein für mehrere Tests und Inhibitoren können aus dem gleichen Präparat verglichen werden, zur Verfügung. </li><li> Für jeden Schritt, Pre-kühlen die Zentrifuge auf 4 ° C und bereiten Puffer und Chill 20 min bei 4 ° C vor der Zellernte.</li><li> Chill-Zellen (4 ° C) und die Durchführung Verfahren auf Eis. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 1000 rpm für 5 min in einem 15 ml Polypropylen-Rundrohr. </li><li> Wash 1x mit eiskaltem PBS (Ca 2 + und Mg 2 +-frei). </li><li> Zentrifuge wieder und entsorgen PBS Stand. </li><li> Add 500 ul hypotonischen Puffer ohne Protease-Inhibitoren, wobei darauf geachtet, das Zellpellet vollständig zu suspendieren. </li><li> Übertragen Inhalt in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Unmittelbar bei 5.500 rpm für 5,5 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und halten das Zellpellet. </li><li> Zellpellet in 500 ul hypotonischen Puffer, der 0,5% NP40. Hinzufügen Protease-und Phosphatase-Inhibitoren und 0,5 mM DTT (wie in Schritt 1.1.5 beschrieben). </li><li> Die Probe wird auf Eis für 30 Minuten ruhen. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 rpm für 10 min. </li><li> Entsorgen Sie den Überstand (enthält die cytosolische Proteine). </li><li> Resuspendieren Sie das Kernpellet in jeweils geringer sal 60 ult-Puffer (um die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) und Hochsalz-Puffer (auf die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) für eine Gesamtmenge von 120 ul. In 60 ul Niedrigsalzpuffer zum Pellet ersten und resuspendieren, dann fügen Sie 60 ul Hochsalzpuffer. Mischen Sie den Pellet an der Aufwirbelung unterstützen. </li></ol> HINWEIS: Dieser Schritt hilft loszuwerden einige der Kernmembran-Proteine ​​und bis zur Lyse Schritt gesetzt: niedrige Salz ersten (Pellet erneut, Vortex), so hohe Salz (Vortex) optimiert diesen Schritt. Halten Extrakt auf Eis für 30 min, unter Verwirbelung nach den ersten 10 min. <ol start="16"><li> Zentrifuge bei 12.000 rpm für 15 min; halten den Überstand mit dem Kernprotein. </li><li> Messen Proteinkonzentration (versuchen, um Proben bei 2-5 mg / ml zu halten), aliquoten in entsprechenden Mengen (10 ul / Röhrchen) und bei -80 ° C </li></ol> HINWEIS: Geschätzte Ausbeute: 30 x 10 6 cells 5 ug / ul Protein in 120 ul ergeben. 5 x 10 6 Zellen 2,2 ug / ul Protein in 40 ul ergeben. 3. Vorbereitung der Doppel Oligonukleotid <ol><li> Entwerfen komplementäre Oligonukleotide mit kompatiblen Halbstellen an den Enden. Für RUNX2 diese sind: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-Biotin (Sinn) und 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-Biotin (Antisense). </li></ol> HINWEIS: Pilotversuche festgestellt, dass drei RUNX2 Bindungsstellen und Single-Ende Biotin ergab die meisten reproduzierbare Ergebnisse. <ol start="2"><li> 5x herzustellen Annealing-Puffer: In 300 &amp;mgr; l (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 &amp;mgr; l (1 M MgCl 2), 10 &amp;mgr; l (1 M DTT) und 260 &amp;mgr; l H 2 O (600 &amp;mgr; l final). </li><li> Zu 200 pmol von jedem Einzelstrang-oligonucleotide (3 ul), fügen Sie 12 ul 5x Annealing-Puffer und 45 ul H 2 O für insgesamt 60 ul (200 pmol/60 ul). </li><li> Hitze bei 95 ° C für 5-10 min in einem Heizblock. </li><li> Abkühlen auf 65 ° C langsam (durch Einstellen der Temperatur auf 65 ° C, dauert es 15 min), dann auf Raumtemperatur langsam durch Abschalten der Leistung der Wärmeblock (oder indem Sie in 50 ml 65 ° C Wasser in einem Becherglas auf Eis, dies dauert 15-20 min). </li></ol> 4. Herstellung von 96-Well-Platten HINWEIS: Verwenden Sie keine Milchproteine ​​in den Waschpuffer. <ol><li> Fix Platte mit Befestigungslösung (0,1 M Natriumcarbonat): add 300 ul /. </li><li> Inkubation für 2 Stunden mit Schütteln bei Raumtemperatur (RT) oder kein Schütteln bei 4 ° C (O / N). </li><li> Waschen Platte 3x mit Streptavidin Waschpuffer (WB): add 300 ul / jeder Zeit. </li><li> Hinzufügen Biotin-markierten doppelsträngigen Oligonukleotids (3 Konsensus-Bindungsstellen pro Nukleotid) für 2 h with Schaukel (1,25 nmol / gut; 100 ul / Vertiefung). </li><li> 3x Waschen mit kaltem WB: add 300 ul / und dann sofort die Platte umzukehren in eine Senke und tupfen Sie die Kanten auf einem Papiertuch nach jeder Zugabe. </li></ol> HINWEIS: Verwenden Sie keine Pipettenspitzen, um Flüssigkeit von den Platten zu entfernen, da dies zu kratzen Avidin: Biotin: DNA-Komplexe aus den Vertiefungen. Tun Sie dies für alle nachfolgenden Waschschritte. 5. Inkubation mit Kernextrakt HINWEIS: Sie ersetzen nicht Lachs oder Hering-Sperma-DNA für die Poly dI / DC-Blockpuffer. Vermeiden Sperrplatten mit Milchproteinen. Beide Blockierungsmittel führen zu einer hohen Hintergrundwerten. <ol><li> Inkubation mit spezifischen Transkriptionsfaktor aus der Kernextrakt (90 ul /) erstellt. Erstellen Sie einen Master-Mix mit Kernextrakt (DNA-bindendes Protein, 3-9 g / gut) + Poly dI / dC (1 ug / ul von einer 50 ug / ul Lager) in 1x DNA-Bindungspuffer. Volumen wird als die Gesamtzahl der benötigtenBrunnen erforderlich (90 ul / Vertiefung). </li><li> Einem potentiellen Inhibitor, wie z. B. Vitamin D3 (Fig. 2) oder CADD Verbindung 5221975 (Fig. 3) oder der geeigneten Verdünnung der Lösungsmittelkontrolle, wie Ethanol, wird in diesem Schritt zugegeben. </li><li> Legen Sie die Platte auf Schaukel Plattform, O / N bei 4 ° C </li><li> 3x Waschen mit WB: add 300 ul / </li></ol> 6. Zugabe des primären Antikörpers HINWEIS: Primärantikörperverdünnungen sollte frisch zubereitet werden - Speicher wird nicht empfohlen. <ol><li> Verdünnen RUNX2-spezifische monoklonale Antikörper (Lager 1 ug / ul) 5.1, 000 in Streptavidin-Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug. </li><li> Inkubation für 1 h bei RT auf einer Schwingplattform. </li><li> 3x Waschen mit WB, fügen Sie 300 ul /. </li></ol> 7. Zugabe von sekundärem Antikörper HINWEIS: Sekundärantikörperverdünnungen können sto seinrot bei 4 ° C über Nacht bei Bedarf am nächsten Tag. <ol><li> Verdünnen F ab-spezifische Affinität gereinigt HRP-konjugierte Antikörper (7,1 mg / ml Stamm) bis 1:1,400 in Streptavidin-Waschpuffer: 3,5 ul antibody/5.0 ml Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug. </li><li> Inkubation 30 min bei RT auf einer Schwingplattform. </li><li> Wash 6x mit WB durch Umdrehen der Platte in Enke (300 ul / Vertiefung). </li></ol> 8. HRP-Substrat-und Produktentwicklung <ol><li> In 50 ul TMB-Substrat pro Vertiefung direkt ab Lager Flasche. </li><li> Inkubation 10-20 min bei RT im Dunkeln (Stop-Reaktion-Methode) oder die Messung der Extinktion direkt (kontinuierliche Bewegungsüberwachung). </li></ol> 9. Reaktionsmessung <ol><li> Stoppen Reaktionsverfahren: Für die visuelle Stopp-Reaktion, überprüfen Sie Farbwechsel von blau und klar zu stoppen Reaktion mit 50 ul Schwefelsäure. </li><li> Messung der Extinktion bei 450 nm mitdie Biotrak II Visible Plattenleser Spektralphotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) oder ein ähnliches Instrument. </li><li> Kontinuierliche Überwachung kinetische Methode: Fügen Substrat nach dem letzten Waschen und kurz vor der Platzierung im Spektralphotometer (nicht die Reaktion zu stoppen). </li><li> Extinktion bei 635 nm mit dem Bio-Tek Synergy HT Multi-Reaktionsmikroplatten-Reader Spektralphotometer (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) oder ein ähnliches Instrument. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

DNA-Bindungstests verwendet werden, um die Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA in Wechselwirkung zu messen. Assays für die DNA-Bindung umfassen elektrophoretische Mobilitätsverschiebung (EMSA) 1 und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wie Chemilumineszenzassays 2. Die EMSA ist nicht quantitative und verwendet radioaktiv markierte (32 P) Oligonukleotiden. Diese sind mit Kernproteinen inkubiert und Bindungs...

DNA-Bindungs-Assays sind nützlich bei der Messung der Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA zu interagieren. Assays für die DNA-Bindung sind elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA), die auf radioaktiv markierten Oligonukleotide 1 oder 2 Chemilumineszenzassays abhängen. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wurden auch beschrieben. Jedoch ist die EMSA eine nicht-quantitativer Assay, der die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotiden erfordert. Als Kernproteine ​​assoziieren mit den spezifischen Nukleotid-Promotor-Sequenzen, sind Bindungskomplexe auf Polyacrylamid-Gelen verzögert und die spezifische Transkriptionsfaktor kann mit einem Antikörper &quot;Supershift&quot; validiert werden. Wir haben eine quantitative DNA-Bindungsassay unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Format (D-ELISA), die in der Lage, die Interaktion von RUNX2 mit DNA-Bindungssequenzen entsprechend definierten Promotorelemente zu messen, ist entwickelt in RUNX2 Zielgene. Verwendung eines Anti-Antikörpers enthält RUNX2 Spezifität des Assays und der Mangel an Radiomarkierung zeichnen diesen Assay vom herkömmlichen Gel-Shift-Assay-5. Nachweis von Bindungskomplexen ist mit der Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine HRP-Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) in ein gefärbtes Produkt spektrophotometrische Analyse umwandelt möglich. Der Test hier berichtet die Verwendung von mutierten DNA-Oligonukleotide als Kontrolle übernehmen und kann zum Nachweis von kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitoren der DNA-Bindung verwendet werden. Das Screening von neuen Anti-Tumor-Verbindungen ist ebenfalls mit diesem Assay möglich.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

Viele DNA-Bindungsassays, wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), chemilumineszenten Assays Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-basierte Assays und Multiwell-basierten Assays verwendet werden, um Transkriptionsfaktor-Aktivität zu messen. Allerdings sind diese Tests nicht-quantitative, fehlt die Spezifität, kann die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotide beinhalten und kann nicht für das Screening von Inhibitoren der DNA-Bindung anpassungsfähig sein. Auf der anderen Seite, unter Verwendung einer quantitativen DNA-bindende Enzyme-linked Immunosorbent Assay (D-ELISA-Test) zeigen wir, nukleäres Protein-Wechselwirkungen mit DNA unter Verwendung des RUNX2 Transkriptionsfaktor, der auf spezifische Assoziation mit Konsensus-DNA-Bindungssequenzen auf Biotin vorliegenden hängen markierte Oligonukleotide. Vorbereitung der Zellen, die Gewinnung von Kernprotein, und das Design der Doppelstrang-Oligonukleotiden beschrieben. Avidin-beschichteten 96-well Platten mit alkalischen Puffer fixiert und mit Kernproteinen in Nukleotid-Blockierungspuffer inkubiert. Folldurch ausgiebiges Waschen der Platten spezifischen primären Antikörper und sekundären Antikörper-Inkubationen werden durch die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-Substrat und der Entwicklung der Farbreaktion verfolgt. Stop-Reaktionsmodus oder kontinuierliche Überwachung kinetische wurden verwendet, um quantitativ zu messen Protein-Wechselwirkung mit DNA. Wir diskutieren entsprechende Spezifität Kontrollen, einschließlich der Behandlung mit nicht-spezifischen IgG-oder Protein oder ohne primären Antikörper. Anwendungen des Assays sind beschrieben, einschließlich ihrer Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening und repräsentativen positiven und negativen Ergebnisse diskutiert.

Die D-ELISA-Verfahren ist hochspezifisch für die bezeichnete DNA-Bindungsprotein, solange eine sequenzspezifischen, doppelsträngigen Oligonukleotid drei Kopien des Konsensus RUNX2 Bindungsstelle (ACACCA) enthält, verwendet wird. Der primäre Antikörper, der das Protein Faktor erhöht auch die Spezifität. Der sekundäre Antikörper enthält kovalent gebundenen Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine klare Substrat (Tetramethylbenzidin) zu einem farbigen Produkt für einfache Erkennung (Abbildung 1) u...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

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Research

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Biology

18.5K Aufrufe.  University of Maryland School of Medicine.  Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht. 

Serie: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.