Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grants EY0081 und 5T32UY07145 und von den Tempelrittern Eye Foundation unterstützt. Jason Rihel ist ein Bristol-Squibb Fellow of the Life Sciences Research Foundation.

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um die Visual-Motor Reaktionszeit von Zebrafisch-Larven auf Licht-und absteigende im eigenen Labor durchführen. Zebrafische sind ein großes Vorbild für Verhaltensstudien. Sie sind leicht zu pflegen, haben sie große Kupplung Größen, und sie entwickeln sich rasch. Zum Beispiel sind die Augen des Zebrafisch-Larven reagieren, die von Tag 3 der Entwicklung und zu welchem ​​Zeitpunkt sie zeigen eine Schreckreaktion Licht. Teil 1: Plating einzelnen Fische in eine 96-Well-Platte <ol><li> Wachsen WT-Larven unter einem Hell / Dunkel-Zyklus bei 28 ° C bis mindestens 4 Tage nach der Befruchtung (DPF). Unsere typischen Licht: Dunkel-Zyklus ist 14 Stunden von Lichtern ON ab 09.00 Uhr, und 10 Stunden Licht aus, ab 23.00 Uhr. Für die besten Ergebnisse Verhaltensstörungen, Überfüllung zu vermeiden, behalten wir gewöhnlich nicht mehr als 50 Larven in einem einzigen Petrischale. </li><li> Nach 4 dpf, sind die Zebrafisch bereit, in einer 96-Well-Platte übertragen werden. Um die Larven mehr schwimmen Zimmer, wir verwenden in der Regel eine 96-Well-Platte mit einem großen, gut Größe von 650 ul, allerdings arbeiten Standard-96-Well-Platten just fine. Mit Hilfe eines Kunststoff-Transfer-Pipette vorsichtig Transfer eine Larve pro Vertiefung. </li><li> Nach dem Übertragen Fisch in den Brunnen, füllen Sie jedes Well mit genügend Fische Wasser, so dass die Wasseroberfläche fast bündig an der Spitze der Brunnen ist. Entweder Überfüllung oder Unterfüllung der gut kann dazu führen, optische Probleme für die Aufnahme-Kamera. Auch darauf achten, dass Blasen in den Vertiefungen einzuführen. </li></ol> Teil 2: Übersicht über die Aufzeichnungsvorrichtung Für diesen Teil des Protokolls, entnehmen Sie bitte der Film-Komponenten zu identifizieren und sich mit unserer Einrichtung von der Aufzeichnungsvorrichtung vertraut zu machen. <ol><li> Im Inneren der Aufnahme Kammer ist eine gut definierte Ort, um die 96-Well-Platte positionieren. </li><li> Die Kamera ist auf der Rückseite positioniert und ist auf der Platte mit Hilfe von Spiegeln aus dem Feld konzentriert. Der Winkel dieser Spiegel kann durch Drehen der Schrauben, die den Spiegel in Position zu halten angepasst werden. </li><li> Die Aufnahme Kammer ist von unten durch Infrarot-LEDs beleuchtet. Dadurch kann die Kamera, um die Fische auch im Dunkeln sehen. Die Larven können nicht erkennen, IR-Licht, so dass dieses ständige IR-Beleuchtung wirkt sich nicht auf das Experiment. Weiße LEDs beleuchten auch die Aufnahme Kammer von unten. Sie sind getrennt von den IR-Beleuchtung gesteuert. Leuchtende die Kammer mit weißem Licht von oben oder von der Seite ist sicherlich möglich, aber in diesen Fällen darauf zu achten, vermeiden Sie starke starrt von der Wasseroberfläche mit der Kamera stören kann. </li><li> Für Experimente, die länger als ein paar Stunden, füllen die Kammer mit schwach fließendem Wasser, um eine konstante Temperatur für die Versuchsdauer. Ein Weg, um einen konstanten Fluss von Wasser zu erreichen ist, um Wasser aus einem Reservoir Pumpe durch ein kleines Aquarium Pumpe, die bis 28 ° mit einer typischen Unterwasser-Aquarium Heizer erwärmt wird. </li><li> Zur Minimierung von streunenden Vibrationen aus dem Raum, sollte die gesamte Aufnahme-Einheit auf einem schweren Balance Tisch sitzen. </li></ol> Teil 3: Alignment der 96-Well-Platte mit dem Computer-Grid des Video-Tracking Software <ol><li> Platzieren Sie den 96-Well-Platte mit dem Fisch in die Messkammer. </li><li> Bei Verwendung eines Wasserbades, langsam wird die Platte in das Wasser, so dass der Wasserstand eine Chance, ohne etwas zu verschütten auf die Platte passen. Alternativ schalten Sie die Wassermenge, fügen Sie die Platte, und dann wieder den Fluss. Auch sicher sein, eine Feder oder ein Gummiband verwenden, um den 96-Well-Platte in Position zu halten. </li><li> In der Sicht VideoTrack Software, überprüfen, ob alle die Larven des Experiments zu sehen auf dem Bildschirm sind. Mit den Steuerelementen der Software richten sich die Gitter der Video-Tracking-Software mit den Vertiefungen der Platte, so dass jeder Fisch in einem Quadrat des Gitters ist. Die Tracking-Computer wird die Berechnung der Bewegung getrennt für jede dieser Boxen, so, wenn Sie die Computer-Grid misalign einige der Fische Bewegungen können verloren gehen. Oder noch schlimmer: zwei benachbarten Fische nehmen den gleichen Raum und wie man Fische gezählt werden. Dieser Schritt ist sehr wichtig für alle Ihre Aufnahmen. </li><li> Nach der Ausrichtung, Programm der Zeitpunkt, wann die Lichter sollten ein-und ausschalten zu gehen. Wir in der Regel erlauben 3 Stunden hell oder dunkel Anpassung in die Box sowohl um eine Grundlinie Aktivität zu erhalten, sondern auch zu geben, die Larven eine Gelegenheit, sich zu beruhigen nach dem Pipettieren und Handhabung. Nach der Grundlinie haben wir dann im Wechsel mit 30 Minuten leuchtet ON von 30 Minuten von Lichtern OFF gefolgt und mehrmals wiederholen. </li><li> Als nächstes schließen Sie die Tür der Aufnahme Kammer und starten Sie die Aufnahme. </li><li> In der Praxis erfassen wir die Aktivität der einzelnen Fische pro Sekunde, aber der Viewpoint-Software in der Tat zeichnet die Frame für Frame-Daten (siehe den Filmfür eine Demonstration der Datenerhebung). Einstellen der Schwellenwert für die minimale Pixel ändern pro Frame hängt etwas von Ihrer Kamera und Licht-Setup. Für unser Setup, wir verwenden in der Regel ein Schwellenwert von 4 Pixeln, das heißt, wenn weniger als 4 Pixel verändert werden, wird davon ausgegangen Hintergrund. Wenn mehr als 4 Pixel bewegen, gibt es die Fische in Bewegung ist. Wir empirisch ermittelt, dass dieser Grenzwert nahezu erkennt alle Larven schwimmen und biegen Bewegungen. </li><li> Auch wenn die Aufnahme-Boxen die Larven isolieren ziemlich gut, schalten Sie das Licht in den Raum und kümmern uns um Unterbrechungen mit mechanischen Geräusche wie das Schließen und Öffnen von Türen in den Raum, mit einer Dance-Party, oder tut Ihr Training zu minimieren. </li></ol> Teil 4: Die Analyse der Daten <ol><li> Nach dem Experiment ist abgeschlossen, übertragen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle oder in Ihrem Lieblings-Analyse-Suite gesammelt. </li><li> Die beigefügte Excel-Tabelle ist ein Beispiel, wie die Daten aussehen kann: Sie enthält die Zeit in Sekunden nach dem Start des Experiments und der Aktivität der einzelnen Larve pro Sekunde für den Fisch während des gesamten Experiments (Siehe ergänzende Datei Beispiel Daten in der Files-Sektion auf dieser Seite). </li><li> Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die Aktivität eines einzelnen Larve. Abbildung 2 ist eine repräsentative Spur der Durchschnitt von 40 WT Zebrafisch-Larven. Die gemittelten ON und OFF Reaktionen sind prominente und konsequent. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Abbildung 1" width="569" height="398" /> Abbildung 1: Aktivität eines einzelnen Fisches Die Aktivität eines einzelnen WT Fisch bei 5 dpf in Reaktion auf wechselnde Perioden von 30 Minuten Licht an und aus.. Die ON-Reaktionen werden durch schwarze Pfeile und die OFF Antworten mit roten Pfeilen gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Abbildung 2" width="577" height="387" /> Abbildung 2: Durchschnittliche Aktivität von 40 Fischen Die durchschnittliche Aktivität von 40 WT Fisch bei 5 dpf in Reaktion auf wechselnde Perioden von 30 Minuten Licht an und aus.. Die gemittelten ON (schwarze Pfeile) und OFF (rote Pfeile) Reaktionen sind prominente und konsequent. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 3 zeigt eine schematische Übersicht über die experimentellen Entwurf in allen unseren Experimenten verwendet. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Abbildung 3" width="530" height="479" /> Abbildung 3. Experimentelle Gestaltung des Visual Motor Response (VMR) zu testen. A) Individuelle Fische sind in einer 96-Well-Platte in einer Aufnahme Kammer platziert. Die Aktivität der einzelnen Fisch pro Sekunde gemessen. B) Die Fische werden über einen Zeitraum von dunklen oder hellen Anpassung an ihnen ansiedeln und zu einer Baseline-Aktivität zu erhalten gegeben. Perioden von 30 Minuten leuchtet ON und OFF Lichter werden nacheinander für insgesamt 3 Stunden eingeführt. Dieses Diagramm wurde von Prober et al angepasst., 2006. Was bedeuten die Visual-Motor Reaktionszeit Graphen aussehen? Wir maßen die ON und OFF Reaktionen der WT Fisch ans Licht vergrößert und verkleinert. Um zu bestätigen, dass diese Antworten abhängig von Augen-Funktion wurden, maßen wir die Aktivität von chk-Mutanten, die nicht entwickeln keine Augen. Abbildung 4 zeigt die durchschnittliche Aktivität von WT Tieren sowie die chk erhaltenen Mutanten. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Abbildung 4" width="489" height="212" /> Abbildung 4: WT Fische ON und OFF Reaktionen, die durch die seitlichen Augen vermittelt werden klar die Fortbewegung des Zebrafisch-Larven bei 5 dpf in Reaktion auf 30 Minuten Licht ON und 30 Minuten Licht AUS pro Sekunde aufgezeichnet wird.. Jede Spur entspricht einem durchschnittlich 480 Antworten aus 120 einzelnen WT (blaue Kurve) oder chk mutierten Larven (orange Kurve) aufgezeichnet über 3 Experimente. Die chk-Mutanten nicht wesentlich erhöhen ihre Aktivität bis leicht erhöht oder verringert und haben einen niedrigen Ausgangswert Umfang der Tätigkeit. Diese Zahl wurde von Emran et al., 2007 angepasst. Visual-Motor Antworten von der NRC mutierten Fische. Das NRC-Mutante wurde angenommen, dass völlig blind auf der Grundlage der OKR testen. In den NRC-Mutante, nicht der Photorezeptor-Terminals nicht richtig bilden und die On Sehbahn ist stark gefährdet ein. Retinalen Ganglienzellen Aufnahmen aus dieser mutierten Fische zeigten, dass sie überwiegend Ausstellung OFF-type Ganglienzelle Antworten, einige anormale ON-OFF, aber keine reine On-Typ Reaktionen 2. Mit dem VMR-Test haben wir gezeigt, dass die NRC-Mutante eine normale OFF-Reaktion und eine verzögerte und träge ON-Antwort hat (see Abbildung 5). So ist die NRC-Mutante nicht völlig blind, als bisher angenommen 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Abbildung 5" width="591" height="244" /> Abbildung 5: NEU mutats erhöhen ihre Aktivität in Reaktion auf Veränderungen in Lichtintensitäten Verhaltensreaktionen auf Licht an und aus von WT und NRC mutierten Larven bei 5 dpf.. Jede Spur entspricht einem durchschnittlich 480 Antworten aus 120 einzelnen Fisch aus jedem Genotyp. Die durchschnittliche Fortbewegung des NRC-Mutanten (pink Spuren) ist geringfügig im Vergleich zu WT Fisch (blau Spuren) reduziert, bleibt aber kräftig nach dem Licht AUS Reiz. Beachten Sie die langsame Anstiegszeit in der NRC-Mutante Reaktion auf ON im Vergleich zu ON Reaktion des WT Fisch light light.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

Die experimentellen Verfahren zeigen wir im Film sind alle Vertreter der WT Fisch. Allerdings können diese Experimente analog auf mutierte Fisch sowie (siehe repräsentatives Ergebnis Abschnitt) durchgeführt werden. Wir schlagen vor, Platte WT Fisch und mutierte Fische auf der gleichen Platte in ein Schachbrett Entwurf für eine optimale Kontrolle. Bei der Verwendung von mutierten Fische auf der gleichen Platte wie WT Fisch sicher, dass Sie aufschreiben, welche Art von Fisch in jeder Vertiefung wurde vergoldet. Hier ist ein Vorsch...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

Die optokinetische Reflex (OKR) ist eine grundlegende visuelle Reflex ausgestellt von den meisten Wirbeltieren und spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Auges relativ zum visuellen Szene. Allerdings erfordert die OKR, dass ein Tier bewegte Streifen zu erkennen und es ist möglich, dass Fische, die zu einer OKR weisen scheitern möglicherweise nicht vollständig blind. Ein Zebrafisch-Mutante, die keine optokinetischen Antwort c (NRC) hat keine OKR unter allen Lichtverhältnissen getestet und wurde berichtet, dass völlig blind. Bisher haben wir gezeigt, dass OFF-Ganglienzellen Aktivität in diesen Mutanten können aufgezeichnet werden. Um festzustellen, ob mutierte Fisch ohne OKR wie das NRC-Mutante kann einfach Licht-und absteigende entwickelten wir die visuelle Motor Verhaltens-Assay (VMR) zu erkennen. In diesem Test werden einzelne Zebrafischlarven in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Larven mit einem automatischen Video-Tracking-System gelegt. Der Bewegungsapparat Reaktionen der einzelnen Larve bis 30 Minuten Licht ON und 30 Minuten Licht OFF wurden aufgezeichnet und quantifiziert. WT Fische haben einen kurzen Spike der motorischen Aktivität auf Licht an, wie die Schreckreaktion bekannt, durch die Rückkehr zu niedrigeren als Baseline-Aktivität gefolgt, eine so genannte einfrieren. WT Fische drastisch steigen ihre Bewegungsaktivität unmittelbar nach Lichter ausgeschaltet und erst allmählich (über mehrere Minuten) wieder auf den Ausgangswert Bewegungsaktivität. Das NRC-Mutanten ähnlich reagieren auf Licht OFF als WT Fisch, sondern zeigen einen leichten Rückgang in ihre durchschnittliche Aktivität zu WT Fische verglichen. Motor Aktivität in Reaktion auf Licht ON in nrc Mutanten verzögert und träge. Es ist eine langsame Anstiegszeit des NRC-Mutante Reaktion auf ON zu WT Licht ON Reaktion gegenüber Licht. Die Ergebnisse zeigen, dass nrc Fisch nicht vollständig blind. Da Knochenfischen kann Licht durch nicht-retinalen Gewebe zu erkennen, bestätigt uns, dass die unmittelbare Verhaltensreaktionen auf Lichtintensität Veränderungen intakt Augen benötigen, indem Sie die chokh (chk)-Mutanten, die völlig fehlende Augen von den frühesten Stadien der Entwicklung. In unserem VMR-Assay zeigen die chk-Mutanten keine Schreckreaktion entweder Licht ON oder OFF, die zeigen, dass die seitlichen Augen dieses Verhalten zu vermitteln. Die VMR-Assay hier beschriebenen ergänzt die etablierten OKR-Assay, die nicht getestet ist die Fähigkeit des Zebrafisch-Larven auf Veränderungen in Lichtintensitäten reagieren. Darüber hinaus verleiht die Automatisierung der VMR-Test selbst zu High-Throughput-Screening für Mängel in der Lichtstärke gefahren visuelle Antworten.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K Aufrufe.  Harvard. Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.

Serie: A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Forschung

Biologie

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

Die Nutzung der Ramsay Assay zu Flüssigkeitssekretion und Ionenfluss Preise in der Maßnahme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighischen Tubulus

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...