Wir versuchen, die beste Methode für die Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern gegen rote Blutkörperchen zu finden. Der Monozyten-Makrophagen-Assay scheint sensitiver zu sein als der Monozyten-Monolayer-Assay. Die Frage, die wir zu beantworten versuchen, ist also, ob der Monozyten-Makrophagen-Assay ein besserer Assay für die Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern gegen rote Blutkörperchen ist als der Monozyten-Monolayer-Assay.
Die experimentelle Herausforderung sowohl beim Monozyten-Monolayer-Assay als auch beim Monozyten-Makrophagen-Assay besteht darin, ihre Effizienz zu optimieren, um eine schnellere Fertigstellung zu ermöglichen und gleichzeitig die Notwendigkeit einer manuellen Phagozytose-Beurteilung zu eliminieren. Mit anderen Worten, die Herausforderung besteht darin, zu versuchen, diese Assays halbautomatisch zu automatisieren. Der Monozyten-Monolayer-Assay, den ich 1980 entwickelt habe, wird seit 1983 routinemäßig vom Immunhämatologie-Referenzlabor verwendet, um zu entscheiden, welche Auto- oder Alloantikörper der roten Blutkörperchen das Potenzial haben, eine Hämolyse zu verursachen, wenn Spenderblut in Patienten mit diesen Antikörpern transfundiert wird.
Das MMA verwendet also Monozyten im Assay, aber die Antikörper-vermittelte Hämolyse wird typischerweise durch Makrophagen in der Milz oder der Leber verursacht. Hier untersuchen wir also, ob die Verwendung von primären Makrophagen in diesem Assay als Prädiktoren für potenzielle klinische Bedeutung von Antikörpern besser wäre als Monozyten. Der Versuch, den Monozyten-Makrophagen-Assay benutzerfreundlicher und schneller zu gestalten und keine Lichtmikroskopie zu erfordern, aber vielleicht wäre ein automatisierter Mechanismus zum Ablesen der Phagozytose wünschenswert.
Verdünnen Sie zunächst das Vollblut mit RPMI-1640 Complete Medium und schichten Sie es zur Zentrifugation auf ein Dichtegradientenmedium. Entnehmen Sie nach der Zentrifugation den Buffy Coat, der mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder PMBCs enthält. Nach dem Pelletieren der erhaltenen PBMCs werden sie in 10 Millilitern vorgewärmtem RPMI-1640 Complete Medium resuspendiert.
Bestimmen Sie die Zellzahl mit geeigneten Geräten, bevor Sie mit der Monozytenisolierung beginnen. Befolgen Sie die Anweisungen des Monozyten-Isolationskits und geben Sie die Probe in ein Propylenröhrchen geeigneter Größe. Geben Sie den Anreicherungscocktail in einer Konzentration von 50 Mikrolitern pro Milliliter der Probe in die Probe.
Nachdem Sie die Probe auf und ab pipettiert haben, wirbeln Sie sie gründlich durch und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei zwei bis acht Grad Celsius in einem Eiskübel. Wirbeln Sie nun die magnetischen Partikel während dieser Inkubationszeit 30 Sekunden lang durch. Nach der Inkubation fügen Sie der Probe magnetische Partikel in einer Konzentration von 100 Mikrolitern pro Milliliter Probe hinzu.
Wirbeln Sie die Probe vor und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei zwei bis acht Grad Celsius. Fügen Sie dann das Isoliermedium hinzu, um das Volumen je nach Bedarf mit einer abgestuften Pipette auf 2,5 Milliliter oder 10 Milliliter aufzufüllen, und mischen Sie. Legen Sie dann das Propylenröhrchen ohne Deckel in den Magneten und inkubieren Sie es etwa 2,5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Nehmen Sie dann den Magneten auf und drehen Sie ihn in einer kontinuierlichen Bewegung um, um die Zellsuspension in ein neues 5- oder 14-Milliliter-Röhrchen zu gießen. Resuspendieren Sie die isolierten Zellen in RPMI-1640 Medium. Zu Beginn geben Sie fünf Milliliter Poly-D-Lycin-Lösung in einen 25-Milliliter-Kolben für jede Makrophagenpopulation, M1 und M2, und lassen Sie die Kolben mindestens eine Stunde lang in der Haube.
Nach der Bestimmung der Zellzahl werden fünf Milliliter RPMI-1640 Medium zugegeben und dann ein- bis fünfmal 10 hoch sechs Monozyten in jeden vorkodierten 25-Milliliter-Kolben ausgesät. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für mindestens zwei Stunden. Nach der Inkubationszeit wird der Kolben einmal mit PBS und zweimal mit vollständigem RPMI-1640 Medium gewaschen.
Je nach gewünschtem Zelltyp werden 10 Milliliter M1- oder M2-Differenzierungsmedium in den Kolben gegeben und die Zellen im Inkubator sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid differenziert. Am sechsten Tag werden je nach Bedarf fünf Milliliter M1- oder M2-Polarisationsmedium in jeden Kolben gegeben. Lassen Sie die Makrophagen im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid mindestens zwei Tage lang polarisieren.
Vor der Entnahme von M1- oder M2-Makrophagen am achten Tag sollte der Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen abgefüllt werden, um ihn bei Bedarf weiter zu verwenden. Einen Milliliter Zellablösungslösung wird in den Kolben gegeben und inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, werden drei Milliliter des vollständigen RPMI-1640 Mediums in den Kolben gegeben und das Medium in einem 15-Milliliter-Röhrchen aufgefangen.
Nachdem Sie weitere drei Milliliter Medium in den Kolben gegeben haben, werden die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden gelöst. Sammeln Sie die abgelösten Zellen in einem frischen 15-Milliliter-Röhrchen. Um die Qualität der M1- und M2-Makrophagen zu bestimmen, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und resuspendieren Sie sie in vollständigem RPMI-1640 Medium mit dem 0,5-fachen, 10 hoch sechs Zellen pro Röhrchen.
Analysieren Sie dann die beiden Zellpopulationen mit einem Durchflusszytometrie-Assay. Zählen Sie die erhaltenen M1- und M2-Makrophagen mit einem Hämozytometer in einem Eins-zu-Eins-Färbeverhältnis mit Trypanblau. Rekonstituieren Sie die Makrophagen in einer Konzentration von 1 mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in RPMI-1640 Complete Medium.
Säen Sie mit einer Mikropipette 400 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung des Objektträgers mit acht Vertiefungen und inkubieren Sie den Objektträger mindestens 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einem vollständig befeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Um die RhD-positiven R2R2-Erythrozyten zu waschen, geben Sie PBS bei einem pH-Wert von 7,4 in die Zellen und zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 350 g. Nach zwei weiteren solcher Waschungen opsonisieren Sie die Test-Erythrozytenprobe mit Antikörpern von Interesse.
Inkubieren Sie die opsonisierten und nicht-opsonisierten Antikörper-Erythrozyten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Wirbeln Sie alle 15 Minuten intermittierend auf, um zu verhindern, dass sich die Erythrozyten absetzen. Waschen Sie dann die opsonisierenden Erythrozyten dreimal mit PBS bei pH 7,4, wie zuvor gezeigt.
Um die Opsonisierung der Erythrozyten zu überprüfen, führen Sie einen indirekten Antiglobulintest mit einem sekundären opsonisierenden Anti-Human-Antikörper zum primären opsonisierenden Antikörper durch. Nach dem Lesen des indirekten Antiglobulintests rekonstituieren Sie gewaschene opsonisierte RHD plus R2R2-Erythrozyten in einer Suspension von 1,25 Vol.-% mit RPMI-1640 Complete Medium. Nach der 1,5-stündigen Inkubation der M1- und M2-Makrophagen aspirieren und entsorgen Sie das überstehende Medium vorsichtig entlang der Ecke der Vertiefung.
Geben Sie dann 400 Mikroliter des 1,25%opsonisierten Erythrozytengemisches in jede Vertiefung des Dreifachaufbaus. Inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid zwei Stunden lang ungestört. Gießen Sie nun 100 Milliliter PBS bei einem pH-Wert von 7,4 in zwei Bechergläser.
Tauchen Sie den Objektträger in den ersten Becher und bewegen Sie ihn langsam für 20 bis 30 Hübe hin und her. Übertragen Sie dann den Objektträger in den zweiten Becher und waschen Sie ihn 20 bis 30 Mal lang. Nehmen Sie den Objektträger aus dem PBS und tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem Papiertuch ab.
Tauchen Sie den Objektträger 45 Sekunden lang in 100% Methanol, um die Zellen zu fixieren. Trocknen Sie die Rutsche an der Luft und montieren Sie sie mit einem selbst vorbereiteten Einbettmedium. Fügen Sie Deckglas hinzu und lassen Sie den Objektträger über Nacht trocknen, bevor Sie die Phagozytose quantifizieren.
M1- und M2-Makrophagen wurden erfolgreich polarisiert und acht Tage lang kultiviert, wobei in Mikroskopiebildern unterschiedliche morphologische Merkmale zu beobachten waren. In der Durchflusszytometrie zeigten M1-Makrophagen eine Expression von etwa 86,1 % von CD80 und eine Expression von 0,17 % von CD209. M2-Makrophagen zeigten eine CD209-Expression von 97,3 % und eine CD80-Expression von 0,003 %.
Histogramme der Fluoreszenzintensität bestätigten eine höhere CD80-Expression in M1-Makrophagen im Vergleich zu M2-Makrophagen. M2-Makrophagen zeigten eine signifikant höhere CD209-Expression im Vergleich zu M1-Makrophagen. M2-Makrophagen zeigten einen signifikant höheren phagozytären Index im Vergleich zu M1-Makrophagen.
Mikroskopische Aufnahmen zeigten deutliche Hinweise auf eine erhöhte Phagozytose bei M2-Makrophagen im Vergleich zu M1-Makrophagen. Ziel dieser Studie war es, das Potenzial der Verwendung von Makrophagen anstelle von Monozyten zur Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern gegen rote Blutkörperchen zu bewerten. Diese Tabelle zeigt, dass M2-Makrophagen besser phagozytieren als M1-Makrophagen oder Monozyten mit Antikörpern, die als klinisch signifikant gelten.
Daher kann bei weiteren Studien ein Assay mit M2-Makrophagen zur besseren Vorhersage der klinischen Signifikanz von Antikörpern verwendet werden.
