Ich möchte Sreemanti Basu für die Bereitstellung der Daten für die Abbildung 1 zu danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH AI069358 und die BloodCenter Research Foundation unterstützt.

A. Kaninchen Komplement <ol><li> Lager Kaninchen-Komplement sollte bei Raumtemperatur aufgetaut werden und dann in 0,5 und / oder 1 ml Volumen aliquotiert und bei -20-80 ° C für eine langfristige Lagerung. </li><li> Jede Menge ergänzen sollten titriert auf die optimale Arbeitsbedingungen Konzentration zu bestimmen. Typischerweise wird eine Verdünnung von 1.10 bis 01.20 Uhr optimal. </li><li> Kaninchen-Komplement nicht immer vor dem Verkauf, steril abhängig von der endgültigen Verwendung der Zellen, sollte die Ergänzung gefiltert sterilisiert werden, wenn aliquotiert und eingefroren oder vor der Zugabe zu den Zellen. </li></ol> B. Antikörper Selection <ol><li> Nicht alle Antikörper sind bei Komplementaktivierung effektiv, so dass die Antikörper muss zuerst für die Aktivität getestet werden. </li><li> Sowohl Maus und Ratte mAb sind Komplementaktivierung effektiv. </li><li> IgM-Antikörper sind in der Regel die effizienteste für den Einsatz in Komplement-induzierte Zelllyse durch IgG gefolgt. Die IgG-Isotypen am besten für die Komplementaktivierung variieren zwischen den Arten. </li><li> Jeder Antikörper ist für die optimale Nutzung bei einer Zelldichte von 10 7 Zellen / ml titriert werden. </li></ol> C. Grundlegende Protocol <ol><li> Stellen Sie die Start-Zell-Population zu 5 x 10 7 Zellen / ml in Medium mit hitzeinaktiviertem FCS. Das endgültige Volumen der Zellen wird die doppelte Startvolumen werden. Denken Sie daran, einige Zellen speichern, so dass der Abbau quantifiziert werden kann. </li><li> Jeder Antikörper sollte die Zellsuspension bei der richtigen vorgegebenen Konzentrations-oder hinzugefügt werden. Mischen Sie die Zellen auch durch Inversion. </li><li> Berechnen Sie die Höhe der Ergänzung erforderlich. Auftauen ergänzen Lager bei Raumtemperatur. Wenn die Ergänzung ist nicht steril, sterilisieren Sie es mit einem niedrigen Protein-Bindung Spritze Filter. Um die Spritze, fügen Sie einige ml Medium vor der Zugabe des Komplementsystems und Filter direkt in die Röhrchen mit den Zellen und Antikörper. </li><li> Passen Sie das Endvolumen in die Röhre, so dass die Zellen bei 1 x 10 7 Zellen / ml sind. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für eine Stunde, Mischen alle 15 Minuten. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen mit Medium zweimal. Zelltrümmer werden auf die Seite der Polystyrol-Röhrchen kleben. Tote Zellen und Schmutz können eliminiert werden durch Verwendung einer Zelle Sieb oder durch Dichtegradientenzentrifugation werden. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der Zellen durch den Vergleich der Zellpopulation von Interesse vor und nach der Entleerung. Durchflusszytometrie und Immunhistochemie sind zwei gute Methoden zur Bestimmung der Reinheit der Zellen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Bei Verwendung eines mAb, der optimal auf die Aktivierung zu ergänzen, Zell-Depletion nach einer Runde ist größer als 95%. Dies ist in Abbildung 1, wo wir mit Maus-Splenozyten von 32,2% αβ T-Zellen zusammen, wie durch die Expression von TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) mittels Durchflusszytometrie detektiert begann gezeigt. Wir erschöpft T-Zellen mit einem mAb spezifisch für Thy1, ein Protein, das von allen T-Zellen exprimiert, nicht aber andere Leukozyten. Der Antikörper wir benutzten, war Y-19 eine Ratte IgG2c 2. Nach dem beschriebenen Verfahren wurde die TCRβ Bevölkerung auf 1,56%, einer mehr als 95% Ermäßigung reduziert. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Depletion von THY1 + Milz-T-Zellen durch Komplement-Aktivierung. Insgesamt Maus-Splenozyten wurden durch Homogenisierung der Milz und Lyse von RBC erhalten. Anti-Thy1 und Baby Kaninchen-Komplement an vorgegebenen Konzentrationen wurden zu einem einzigen Zellsuspension von Splenozyten, so dass die Endzellkonzentration 1 x 10 7 Zellen / ml aufgenommen. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37 ° C wurden die Zellen zweimal gewaschen und ausgewertet durch Trypanblau-Ausschluss für die Lebensfähigkeit der Zellen. Die Effizienz der Depletion wurde mittels Durchflusszytometrie Vergleich des TCRβ + Zellen vor Erschöpfung (links) und nach Erschöpfung (rechtes Bild) beurteilt. Die horizontale Leiste zeigt positive Färbung und die Zahl über der Bar ist das Prozent positiv.

<ol>
	<li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Health+and+Disease.">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , (1994).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation.">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li></ol>

Die Reinigung von Zellpopulationen ist ein gemeinsames Verfahren für die Untersuchung ihrer Funktionen erforderlich. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zum Abbau Zellpopulationen mit Antigen-spezifischen Antikörpern und Komplement Erschöpfung. Die Erschöpfung von Zellpopulation kann erreicht werden, wenn eine Ergänzung aktivierende Antikörper zur Verfügung, um eine Linie spezifischer Marker werden. Hier haben wir die Depletion von T-Zellen unter Verwendung eines mAb spezifisch für Thy1 gezeigt, äußerte ein Protein im Wesentlichen alle T-Zell-Populationen. Wir erschöpft über 95% der αβ T-Zellen und die restlichen Splenozyten wurden von 68% auf 98% erhöht. Dieser Grad an Reinheit der Zellen ist vergleichbar mit anderen Reinigungsverfahren Strategien einschließlich FACS und Magnetic Bead Separation. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle Technik, die in 1,5 Stunden durchgeführt werden kann, wenn die Start-Zell-Population entsteht. Ein weiterer Vorteil der Ergänzung Erschöpfung ist, dass jedes Labor kann die Technik durchzuführen, weil es nicht erfordern teure Geräte und Reagenzien. Der einzige große Teile der Ausrüstung erforderlich sind, einem Wasserbad und einer Zentrifuge. Kaninchen ergänzen können aus einer Vielzahl von Anbietern zu einem angemessenen Preis erworben werden (siehe Tabelle der Reagenzien) und viele mAb kann von ATTC erworben werden und lokal zur Kostenkontrolle gewachsen. Im Gegensatz dazu erfordert FACS einem Durchflusszytometer mit cell sorting Kapazität, die in den sechs Zahlen und teuer fluoreszenzmarkierten mAb kosten wird. Magnetic Bead Separation ist preisgünstig, sondern erfordert den Kauf eines Magneten und magnetische Kügelchen, die teuer werden kann. Darüber hinaus sind einige Magnetic Bead Separation Strategien erfordern auch den Kauf von Spalten. Das größte Hindernis für die Verwendung von Komplement für Zell-Depletion ist die Verfügbarkeit von Komplement aktivierende mAb mit der Antigen-Spezifität erforderlich. Obwohl von Mensch, Maus und Ratte-Antikörper alle die Fähigkeit, zu ergänzen fix haben, sind einige Isotypen besser als andere. Obwohl IgM aus allen drei Arten ist sehr effektiv bei der Befestigung ergänzen die IgG-Isotypen variieren. So kann jeder mAb muss zunächst in einer Pilotstudie getestet werden, um ihre Wirksamkeit zu bestimmen. Für Antikörper, die nicht sehr effizient, kann zwei Runden ergänzen Erschöpfung ohne Auswirkungen auf die Rentabilität der übrigen Zellpopulationen durchgeführt werden. Als Kosteneinsparungen sollten die Antikörper für eine optimale Wirksamkeit titriert werden. Hinzu kommt, dass die verwendeten Antikörper nicht nötig, gereinigt werden. Hybridomüberstände und Aszites-Flüssigkeit arbeiten genauso effektiv, was besonders praktisch ist, IgM-Antikörper, die schwer zu reinigen sind. Wie mit den Antikörpern, ist es unerlässlich, dass die Ergänzung in einer Pilotstudie titriert werden. Eine zu hohe Konzentration führt zum Verlust der Lebensfähigkeit von nicht gezielten Zellpopulationen führen. Wichtig ist auch, dass die Inkubationszeit nicht mehr als 60 Minuten. In unserem Protokoll haben wir Co-Inkubation der Antikörper und das Komplementsystem zusammen. Allerdings können die Zellen mit dem Antikörper für 15-30 Minuten zu kennzeichnen und gewaschen vor der Zugabe von Komplement. Wenn Sie diese Strategie, stellen Sie sicher an den Antikörper Inkubationen auf Eis, um den Verlust der Zell-Antigen auf der Zelloberfläche zu verhindern durchzuführen, wie dies bei einigen Proteinen durch Patching und Capping oder Rezeptor-Internalisierung. Obwohl hocheffiziente, ist der größte Nachteil bei Erschöpfung Ergänzung zu anderen Methoden verglichen, dass es nicht zur positiven Selektion verwendet werden. So ist es schwierig, Subpopulationen von Zellen zu erhalten. Zum Beispiel würde es schwierig sein, Randzone B-Zellen aus follikulären B-Zellen, die am besten durch FACS erfolgen würde zu reinigen. In dieser Situation könnte die Komplementaktivierung verwendet werden, um T-Zellen führen, um die Anzahl der Zellen, die sortiert reduzieren. Diese Strategie würde die Art der Zeit, die würden Geld sparen und wäre weniger hart auf die Zellen. Da die Aufreinigung von spezifischen Zellpopulationen ist eine häufige Anforderung eine Reihe von Strategien entwickelt worden. Die wichtigsten Vorteile des Komplementsystems Erschöpfung Strategie sind die Erschwinglichkeit, technische Einfachheit und Zeitersparnis.

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		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>3-4 week baby rabbit complement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pel-Freez Biologicals</td>
<td>31061-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>various </td>
<td>An incubator set at 37 &deg;C can also be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

depletion of specific cell populations by complement depletion

Die Reinigung des Immunsystems Zellpopulationen ist oft erforderlich, um ihre einzigartigen Funktionen zu studieren. Insbesondere molekulare Ansätze wie real-time PCR und Microarray-Analysen erfordern die Isolierung von Zellpopulationen mit hoher Reinheit. Häufig verwendete Reinigung Strategien beinhalten fluoreszierende activated cell sorting (FACS), Magnetic Bead Separation und ergänzen Erschöpfung. Von den drei Strategien, Angebote ergänzen Erschöpfung die Vorteile der schnell, kostengünstig, schonend für die Zellen und eine hohe Zellausbeute. Das Komplementsystem besteht aus einer großen Anzahl von Plasmaproteinen, die, wenn aktiviert initiieren einer proteolytischen Kaskade die ihren Höhepunkt in der Bildung einer Membran-Angriffs-Komplex, eine Pore auf einer Zelloberfläche führt zum Zelltod bildet zusammen<sup&gt; 1</sup&gt;. Der klassische Weg wird durch IgM-und IgG-Antikörper aktiviert und wurde zunächst als ein Mechanismus zur Abtötung von Bakterien beschrieben. Mit der Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAb), kann der Komplement-Kaskade verwendet werden, um eine beliebige Zelle der Bevölkerung in eine Antigen-spezifische Weise zu lysieren werden. Depletion von Zellen durch das Komplement-Kaskade wird durch die Zugabe von Komplement Befestigung Antigen-spezifischen Antikörpern und Kaninchen-Komplement an den Start Zellpopulation erreicht. Die Zellen werden für 1 Stunde bei 37 ° C und die lysierten Zellen werden anschließend durch zwei Runden Waschen entfernt. MAb mit einem hohen Wirkungsgrad für Komplementbindungsreaktion in der Regel führen 95-100% des angestrebten Zellpopulation. Je nach der Reinigung Strategie für die gezielte Zellpopulation, kann eine sinnvolle Ergänzung Erschöpfung für die Zell-Reinigung oder zur Anreicherung von Zellpopulationen, die dann durch eine anschließende Verfahren gereinigt werden können verwendet werden.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Um effektiv zu studieren die Funktion des Immunsystems Zellpopulationen ihre Reinigung oft erforderlich ist. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle und kostengünstige Technik zur Isolierung von Immunzellen Populationen mit hoher Reinheit.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K Aufrufe.  Blood Research Institute. Um effektiv zu studieren die Funktion des Immunsystems Zellpopulationen ihre Reinigung oft erforderlich ist. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle und kostengünstige Technik zur Isolierung von Immunzellen Populationen mit hoher Reinheit.

Serie: Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual complement components can be quantified however this does not provide any information as to the activity of the pathway. The CH50 is a screening assay for the activation of the classical complement pathway (Fig 1) and it is sensitive to the reduction, absence and/or inactivity of any component of the pathway. The CH50 tests the functional capability of serum complement components of the classical pathway to lyse sheep red blood cells (SRBC) pre-coated with rabbit anti-sheep red blood cell antibody (haemolysin). When antibody-coated SRBC are incubated with test serum, the classical pathway of complement is activated and haemolysis results. If a complement component is absent, the CH50 level will be zero; if one or more components of the classical pathway are decreased, the CH50 will be decreased. A fixed volume of optimally sensitised SRBC is added to each serum dilution. After incubation, the mixture is centrifuged and the degree of haemolysis is quantified by measuring the absorbance of the haemoglobin released into the supernatant at 540nm. The amount of complement activity is determined by examining the capacity of various dilutions of test serum to lyse antibody coated SRBC. This video outlines the experimental steps involved in analysing the level of complement activity of the classical complement pathway.

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

The classical pathway is activated by antibody and culminates in target cell lysis. The CH50 assay provides a measure of the complement activity of a serum sample. This video demonstrates the steps involved in determining the CH50 of a serum sample, the calculations and interpreting of results.

Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH 50) Aktivität von Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...