Wir möchten Dr. Bill Cashdollar für seine Unterstützung in der Verwendung der Durchflusszytometrie Core-danken.

<ol><li> Vor Beginn des Prozesses, müssen die folgenden Punkte zu sein, gesammelt und aufbereitet: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Eis </li><li> 15 ml konische Röhrchen zum Färben von Zellen und 12 x 75 mm Strömungsrohre zur Färbung einfarbig steuert. </li><li> Färbepuffer: Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) + 3% fötalem Kälberserum (FCS) </li><li> Pipetten </li><li> Fc-Block (falls erforderlich) und Färbung Antikörper. Antikörper müssen für eine optimale Färbung titriert werden. </li><li> Compensation Perlen </li><li> Suspensionspuffer: Hank Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS </li><li> Trypanblau und Hämozytometer </li><li> Zellsieb (40 um Nylon) </li><li> Sammlung Röhren: Zwei Arten von Sammelröhrchen können a) 12 x 75 mm Polystyrol-Röhrchen (mit 300 ul FCS und 25 mM HEPES) oder b) 15 ml konische Röhrchen (mit 1 ml FCS + 25 mM HEPES) werden. Jeder reiche Medium mit hoher Konzentration im Serum kann für die Sammlung von sortierten Zellen verwendet werden. </li></ol></li><li> Generieren Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der ab-Zell-Population. </li><li> Optional: Bereichern Sie für die gewünschte Zellpopulation durch eine Bulk-Reinigungsverfahren wie Komplement Erschöpfung oder magnetische Sortierung. Der wesentliche Vorteil der Anreicherung Schritt ist, dass es die Art der Zeit reduziert. </li><li> Wash Zellen einmal mit Färbepuffer. </li><li> Überstand verwerfen und Zellen in Färbepuffer in einer Konzentration bis zu 50 x 10 6 zur effizienten Färbung. </li><li> Optional: Für Zellen, die ein hohes Maß an FcR, blockieren die Rezeptoren mit einem geeigneten Blocking-Methode. Eine Methode der Wahl ist die Verwendung eines mAb, die auf Eis für 10-15 min FcyR bindet. Diese Antikörper sind kommerziell erhältlich. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden mAb (in einer vorbestimmten Konzentration) auf die gewünschte Zellpopulation Fleck und inkubieren für 20-30 min auf Eis im Dunkeln, durch zwei Waschungen mit Färbepuffer gefolgt. Optional: Die Färbung mit einem vitalen Farbstoff, wie Propidiumiodid kann enthalten, um tote Zellen (5) zu erkennen sein. Wenn Multi-Color-Färbung verwendet werden soll, sind einfarbig Kontrollen erforderlich. Wir verwenden BD CompBeads einzelne Farbe Kontrollen vorzubereiten mit dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Wenn nicht mit direkt konjugierten Antikörpern, wiederholen Sie Schritt 7 mit den entsprechenden Sekundär-Antikörper oder Streptavidin-Konjugat. </li><li> Nach dem Waschen die Zellen in Kulturmedium und bestimmen die Zellkonzentration mit einem vitalen Farbstoff wie Trypanblau. </li><li> Passen Sie die Zellkonzentration auf 15-20 x 10 6 / ml. Für Zellpopulationen, die Cluster bilden, die das Instrument bei der Sortierung können verstopfen, die Zellen-Filter durch ein Sieb. </li><li> Einrichten und optimieren die Zell-Sorter. Der Prozess der Einrichtung eines Durchflusszytometer variiert in Abhängigkeit von der Herstellung und muss von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Die allgemeinen Empfehlungen lauten wie folgt: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Wählen Sie die gewünschte Düse je nach Zelltyp, die sortiert werden. </li><li> Für sterile Sorten, sterilisieren das Instrument. </li><li> Führen Instrument der Qualitätskontrolle mit Perlen, um zu überprüfen Laser funktionieren, und es ist genau sortieren. </li><li> Installieren Sie die erforderlichen Auffangvorrichtung und richten Sie die Seite Streams. </li><li> Schauen Sie sich das Instrument der Laser und Detektor bis zum fluoreszierenden Markierungen, die verwendet werden (unser BD FACS Aria hat drei Lasern und können bis zu neun Farben zu erkennen) kann bestimmen, festgelegt. </li><li> Sobald festgestellt wird, was fluoreszierenden Markierungen auf der Zell-Sorter verwendet wird, kann Entschädigung durchgeführt werden (wie unten beschrieben) werden. </li></ol></li><li> Führen Ausgleich mit der negativen Kontrollprobe und die einzige positive Kontrollen. Kompensation ist notwendig, um das Spektrum Überschneidungen zwischen beiden Detektoren zu entfernen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass eine Entschädigung nicht narrensicher und wird negativ durch, wie hell bestimmte Marker Fleck, und die Fluoreszenz der Zellen, die geringe Autofluoreszenz, die zu einer schlechten Auflösung zwischen dunkel und negativen Populationen führen kann betroffen sind. Für beste Ergebnisse sollte das experimentelle Design umfassen die Verwendung von hellen Fluorochrome mit Markern, die geringe Expression haben oder die nicht über ein bekanntes Fluoreszenzmuster. Marker, die eine gute Trennung zwischen Zellpopulationen und sind hoch exprimiert bieten sollte mit Dimer Fluorochrome wie diejenigen von roten oder violetten Laser angeregt werden. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Eine Entschädigung kann mit Kompensation Perlen, die Polystyrol-Mikropartikel, die mit einem Antikörper spezifisch für die Kappa leichten Kette des Ig aus Maus, Ratte, Ratte oder / Hamster wurden gekoppelt sind, ausgeführt werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophor wie die experimentellen Proben. </li><li> Richten Sie eine Vorlage, die eine bivariate Plan, forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), und ein Histogramm zur Anzeige umfasstjedes Fluorochrom, die verwendet werden. </li><li> Führen Sie die negative Kontrolle Röhre und stellen Sie die forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), um die Bevölkerung von Interesse auf der Skala statt. </li><li> Passen Sie die Fluoreszenz PMT-Einstellungen, um die negativen Bevölkerung oder Autofluoreszenz im äußersten linken Teil des Histogramms Platz. </li><li> Notieren Sie sich die negative Kontrolle Röhre. </li><li> Führen Sie das einzige positive Kontrolle Rohre und notieren Sie die Daten für jede Röhre. </li><li> Zeichnen Sie ein Intervall Schutzzaun um den positiven Teil der Daten auf das Histogramm, und ein anderes Intervall Tor auf der negativen Teil des Histogramms. </li><li> Manuelle Kompensation wird durch die Einstellung erfolgt der Median (Median ist eine bessere Schätzung der zentralen Tendenz als der Mittelwert auf einer logarithmischen Skala) des Positiven, bis er gleich dem Median der Negative ist. Dies muss für jeden der Fluorochrom-Etiketten in dem Experiment verwendete durchgeführt werden. </li><li> Zur Einstellung der Median, passen Sie die spektrale Überlappung Werte höher oder niedriger, bis die Mediane für die einzelnen fluoreszierenden Parameter entsprechen so genau wie möglich. </li><li> Eine Entschädigung kann auch automatisch mit Analyse-Software geschehen. Automatische Kompensation verwendet die erfassten Daten von der Entschädigung Kontrollen eine algebraische Matrix für alle Fluorophore in dem Experiment verwendete berechnen. Diese Werte werden verwendet, um zu subtrahieren aus den Beiträgen der nicht-primären Farben, die in einer Grundfarbe des Detektors Blutungen sind. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich die experimentelle Probe, die sortiert werden und die Nutzung Gating-Tools und subsetting Methoden, um die Bevölkerung von Interesse zu definieren. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Richten Sie die experimentelle Vorlage mit einem Punkt-Diagramm, dass FSC vs SSC-Displays und einen Gating-Werkzeug, Polygon, Rechteck-, Intervall-oder Quadranten zu Tor der Bevölkerung von Interesse. Das Streudiagramm zeigt die physikalischen Eigenschaften der Zelle, die verschiedene auf den jeweiligen Zelltyp ist. </li><li> Der beste Weg, um die Fluoreszenz-Gating-Strategie zu bestimmen, ist die Fluoreszenz minus eins (FMO)-Steuerelemente verwenden. In einem FMO Steuerrohr alle Reagenzien, die in dem Experiment verwendet werden, sind mit Ausnahme des einen von Interesse enthalten. Die FMO hilft zu unterscheiden zwischen schwach gefärbte Populationen und breiten negativen Populationen. </li><li> Verwenden Sie die Daten aus FMO Rohren aufgenommen, um festzustellen, wo man Tore in die Röhre statt. </li></ol></li><li> Nach Toren bestimmt worden sind, können die Tore für die Sortierung in externe Sammelröhrchen ausgewählt werden. Bis zu vier Toren (oder Populationen) kann zu einem Zeitpunkt in Abhängigkeit von der Instrumentierung zur Verfügung sortiert werden. </li><li> Führen Sie die experimentelle Probe-Röhrchen bei 4 ° C, auf Ablenkplatten drehen und Art der Probe. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 Zellen in eine 12 x 75 mm Rohr und 1,5 sortiert x 10 6 bis 4,5 x 10 6 Zellen in eine 15 ml konische sortiert werden. </li><li> Sobald die erforderliche Anzahl von Zellen erhalten worden ist, manuell stoppen Sortierung. </li><li> Führen Sie eine post-Art-Analyse, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu ermitteln. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wir haben hier für Maus Milz B-und CD4 T-Zell-Sortierung (Abbildung 1) gezeigt. Milzzellen wurden mit PE Texas Red-konjugiertem Anti-Maus-B220, FITC-konjugierten Anti-Maus-TCRβ und AlexaFluor-700-konjugierten Anti-Maus-CD4 an B-Zellen (B220 + TCRβ-) und CD4 T-Zellen (CD4 + + TCRβ identifizieren gebeizt ). Die Sortierung wurde mit BD FACS Aria Instrument durchgeführt. Nach dem Sortieren der B-Zell-Reinheit betrug&gt; 97% und die CD4 T-Zell-Reinheit betrug&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Reinheit der Milz B-Zellen und CD4 T-Zellen nach FACS. Maus Milzzellen mit anti-Maus-B220, TCRβ und CD4 Antikörper gefärbt wurden. FACS für B-Zellen wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf B220 + TCRβ-Zellen (Abb. 1A, links, untere rechte Quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der B-Zellen (Abb. 1A, rechts) zu bestimmen. B220-Färbung ist auf der x-Achse und TCRβ Flecken auf der y-Achse dargestellt. FACS für CD4 T-Zellen wurde unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometer durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (Abb. 1B, linken, oberen rechten Quadranten). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der CD4 T-Zellen (Abb. 1B, rechts) zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Reinheit der Milz CD4 T-Zellen nach FACS. Murine Milz-T-Zellen wurden durch die Entfernung von B-Zellen durch Schwenken bereichert. Anschließend wurden die Zellen mit anti-Maus-TCRβ und CD4 Antikörper (linkes Bild) gefärbt. FACS wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (links, rechts oben quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der T-Zellen, die größer als 99% (rechts) war zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. -&gt;

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FACS ist ein hochentwickeltes Verfahren zur Reinigung von Zellpopulationen von Interesse, in denen eine sehr hohe Reinheit (95-100%) der sortierten Population erhalten werden kann. Daher ist diese Technik besonders wichtig für Experimente, bei denen hohe Reinheit ist eine wesentliche Voraussetzung (zB Microarray-Analyse). FACS ist besonders vorteilhaft gegenüber anderen verfügbaren Methoden der Reinigung, wenn eine Zelle Bevölkerung muss auf der Grundlage einer wöchentlichen ausgedrückt Oberflächenmarker gereinigt werden oder wenn zwei oder mehr Populationen zu reinigende, die verschiedenen Ebenen der Ausdruck der gleichen Oberfläche Marker haben werden müssen. Zum Beispiel die Reinigung der Randzone B-Zellen (B220 + CD21 hallo CD23 int / niedrig) und follikulärem B-Zellen (B220 + CD21 int / low CD23 hallo) auf Expression von CD21 und CD23 auf. Ein weiterer wachsender Anwendung von FACS ist Single cell sorting ermöglicht die Analyse einzelner Zellen (3, 4). FACS ist auch allgemein zu sortieren Zellen, die fluoreszierende Proteine, die genetisch ausgedrückt werden, wie grün fluoreszierende Protein markierte Proteine ​​(5) verwendet. Wenn eine sterile Art durchgeführt wird können die Zellen kultiviert werden. Allerdings kann die Lebensfähigkeit der Zellen und die Ausbeute bei der Sortierung beeinträchtigt werden. Die Lebensfähigkeit kann durch eine Zell-abhängige optimale Temperatur für die Sortierung und Verarbeitung Sammelröhrchen unmittelbar nach ihrer Kapazität zu erreichen verbessert werden. Die Wiederherstellung kann durch Verwendung von Polypropylen-Röhrchen, das Sammeln sortierten Zellen im Serum von Rich Media und Invertieren Sammelröhrchen intermittierend, Pflege-Röhrchen bei einer optimalen Temperatur und Zentrifugieren sortierten Zellen für ca. 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu erhöht werden / Protocol.htm). Die Entwicklung von Ultra-High-Speed-Sorter hat die Möglichkeit, die Anwendung von Flow Sortierung in klinischen Umgebungen erweitert. Die mögliche klinische Anwendungen der FACS gehören Reinigung von Blut-Stammzellen aus menschlichem Blut zu therapeutischen Zwecken, Anwendungen in der Krebstherapie, Amniozentese Ersatz-, Sortier-menschlichen Spermien und Früherkennung von Krankheiten Erkennungen (6, 7). Für mehrfarbige Färbung wird Antikörperselektion ein wichtiger Schritt und Fluorochrome beruhen auf dem Nachweis-System für die jeweilige Instrument gewählt. Es gibt eine Reihe von Unternehmen, die Zellsortern und der Laser-Konfiguration variiert verkaufen nach den Bedürfnissen der Benutzer. So kann man nicht einfach verwenden genau die gleichen Antikörper in veröffentlichten Studien ohne Bestätigung Kompatibilität verwendet. Für eine optimale Antikörper Auswahl, sollte man die Expression des Proteins untersucht. Im Allgemeinen sollten die hellsten verfügbaren Fluorochrom-markierten Antikörper verwendet, um schwach ausgedrückt Oberflächenmarker Fleck, während dim Fluorochrome für die Färbung von stark exprimierten Oberflächenmarker (8) verwendet werden können. Darüber hinaus Antikörper sollten in einer Weise, dass unter ihren Emissionsspektren Überlappung gewählt werden, ist minimal. Für mehrfarbige Färbung, ist es äußerst schwierig zu entscheiden Fluorochrom, dass keine spektrale Überlappung. In dieser Situation ist die Entschädigung durchgeführt. Kompensation ist notwendig, um mathematisch zu eliminieren die Fluoreszenz Überschneidungen zwischen den Emissionen Spektrum der verschiedenen Fluorochrome, die messbar von den Detektoren (8-10) ist. In anderen Worten ist die Überlappung Fluoreszenz von einem Fluorochrom aus dem Emissionsspektrum eines anderen Fluorochrom abgezogen. Die Ausgleichsrechnung erfordert eine ungefärbte Kontrolle und einzigen positiven Kontrollen für jedes Fluorochrom für eine mehrfarbige Färbung (9, 10). Eine Entschädigung kann unter Verwendung von Zellen oder Perlen werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophoren wie die experimentellen Proben haben. Compensation Perlen sind besonders vorteilhaft, wenn der Zelloberfläche Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird und wenn die Zellpopulation von Interesse ist in der Anfangsphase ab Zellpopulation begrenzen. Sobald der Antikörper ausgewählt wurden, sollte ihre Aktivität durch die Durchführung einer Titration Analyse optimiert werden. Dies ist besonders wichtig, wenn der FACS-Maschine hat sehr leistungsfähige Laser. Die Verwendung von suboptimalen Konzentrationen der Färbung Antikörper können in schlechten Abtrennung der gewünschten Zellpopulation aus der gesamten Zellpopulation führen. Die Verwendung von hohen Antikörper-Konzentrationen erhöht die Chance für Antigen nicht-spezifische Färbung. Deshalb Antikörper-Titration ermöglicht die Auswahl der Antikörper-Konzentration, die maximale Helligkeit des positiven Bevölkerung und minimale Hintergrundfärbung (8) gibt. FACS ist heute ein Standard-Technik für die Reinigung von Subpopulationen von Zellen. Es kann benutzt werden, um jeden Zelltyp, in denen eine einzige Zellsuspension erzeugt und können Antikörper verfügbar sind, um die gewünschte Zellpopulation zu identifizieren trennen. FACS ist die Methode der Wahl, wenn highly reine Zellpopulationen sind erforderlich.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

Experimentelle und klinische Studien erfordern oft hochreine Zellpopulationen. FACS ist eine Technik der Wahl, um Zellpopulationen bekannter Phänotyp zu reinigen. Andere bulk Methoden der Reinigung sind Panning, ergänzen Erschöpfung und Magnetic Bead Separation. Allerdings hat FACS mehrere Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Methoden. FACS ist die bevorzugte Methode, wenn eine sehr hohe Reinheit des gewünschten Bevölkerung erforderlich ist, wenn die Zielzelle Bevölkerung ein sehr niedriges Niveau der Identifizierung Marker drückt oder wenn Zellpopulationen erfordern Trennung basierend auf differentiellen Marker Dichte. Darüber hinaus ist FACS die einzige verfügbare Reinigungsverfahren für Zellen auf innere Färbung oder intrazelluläre Protein-Expression basiert, wie eine gentechnisch veränderte fluoreszierendes Protein-Marker zu isolieren. FACS ermöglicht die Reinigung von einzelnen Zellen nach Größe, Granularität und Fluoreszenz. Um Zellen von Interesse zu reinigen, werden diese zunächst mit Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern (mAb), die spezifische Oberfläche Marker auf die gewünschte Zellpopulation (1) zu erkennen gefärbt. Negative Auswahl von ungefärbten Zellen ist ebenfalls möglich. FACS Reinigung erfordert ein Durchflusszytometer mit Sortier-Kapazität und der entsprechenden Software. Für FACS werden Zellen in Suspension als Stream in Tröpfchen mit jeweils einer einzelnen Zelle vor einer Laser hindurchgeführt. Die Fluoreszenz-Detektionssystem erkennt Zellen von Interesse auf vorbestimmten fluoreszierenden Parameter der Zellen. Das Gerät gilt eine Gebühr, die Tröpfchen mit einer Zelle von Interesse und eine elektrostatische Ablenkung erleichtert Sammlung der geladenen Tröpfchen in entsprechende Sammelröhrchen (2). Der Erfolg der Färbung und damit Sortierung hängt weitgehend von der Auswahl der Identifizierung von Markern und die Wahl der mAb. Sortieren Parameter können je nach Anforderung der Reinheit und Ausbeute werden. Obwohl FACS erfordert spezielle Ausrüstung und Ausbildung des Personals, ist es die Methode der Wahl für die Isolierung von hochreiner Zellpopulationen.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Für viele wissenschaftliche Studien, die eine biologische und chemische Analyse von Zell-Populationen müssen die Zellen in einem hohen Zustand der Reinheit sein. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine überlegene Methode, bei der reinen Zellpopulationen zu erhalten.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K Aufrufe.  BloodCenter of Wisconsin. Für viele wissenschaftliche Studien, die eine biologische und chemische Analyse von Zell-Populationen müssen die Zellen in einem hohen Zustand der Reinheit sein. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine überlegene Methode, bei der reinen Zellpopulationen zu erhalten.

Serie: Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...